CN1159580C - 胶体金层析法检测sars冠状病毒抗原的试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗原的试剂,由包被膜、吸水纸、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜依次粘贴构成;本发明的胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗原的试剂可应用于医院、机场、海关、家庭等场所,能够在几分钟内判断结果,从而及早预防疫情扩散。
Description
技术领域
本发明涉及测试技术,具体地是胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗原的试剂。
背景技术
非典型肺炎(又称严重急性呼吸***综合症,Severe Acute RespiratorySyndrome,缩写SARS)在全世界肆虐已近五个月,4月16日世界卫生组织正式宣布一种人类过去从未发现的新型冠状病毒为SARS的病原。冠状病毒(Corona Virus)是在1968年由Almeida等发现,命名为“冠状病毒”,是因其形态,该病毒在电子显微镜下包膜上有形状类似日冕的棘突。冠状病毒分类广泛,可感染人和家禽家畜,可引起家禽的传染性支气管炎,鼠肝炎,猪脑脊髓炎,猫传染性腹膜炎等;人冠状病毒可引起上呼吸道感染,婴幼儿哮喘及细支气管炎,急性胃肠炎等。
世界各国的研究者们正在研究快速而准确的SARS冠状病毒实验室诊断性的测试方法。然而在有了用于病毒和抗体测试的标准试剂和充分的测试方法之后,SARS疾病的诊断仍然是基于临床和流行病学的证据。目前SARS冠状病毒的实验室测试方法有:①分子测试(简称PCR法);②抗体测试,目前包括ELISA法和IFA法;③细胞培养。
1.分子测试(PCR法)
PCR法能够在不同的样品中测定SARS冠状病毒的基因物质(包括血液、粪便、呼吸道分泌物或身体组织等样品)。引物是PCR测试方法中的主要片断,已经由世界卫生组织的实验室网络在世界卫生组织网站上公布。已经研制出了包括引物、阳性和阴性控制器的PCR测试工具。
总的来说,现有的PCR测试方法有非常好的特异性,但是缺乏灵敏性。这就意味着阴性的测试结果并不能排除病人中有SARS病毒的存在。而且,由于缺乏实验室质量控制而导致的实验室样品的污染,能够导致假阳性结果的出现。
对于存在有必要的质量控制程序的PCR测试的阳性结果:推荐用于SARS冠状病毒的实验室测试是有非常好的特异性的,阳性结果意味着在样品中有SARS冠状病毒的基因物质(即RNA)的存在。但并不意味着有活病毒的存在或者是存在着大量的病毒足够感染其他人。PCR测试的阴性结果并不能够排除SARS病毒的存在。用PCR方法对SARS冠状病毒进行测试,由于以下几方面的原因结果可能出现阴性:
①病人没有被SARS冠状病毒所感染;病例是由其它的病原体(病毒、细菌和真菌)感染引起的,或者是由于非感染性的原因引起的。
②测试结果是不正确的(假阴性)。目前的测试方法需要进一步的改进以提高其灵敏性。
③样品并不是在有病毒或基因物质存在的时候收集到的。病毒和基因物质有可能仅仅存在于一个较短的时期内,取决于用于测试的样品的种类。
PCR法仅用于病毒核酸的检测,要求具备PCR扩增仪及凝胶电泳设备,实验时间较长(两小时以上),需专业技术人员操作和判断检测结果。
2.抗体测试
冠状病毒感染人体后,机体将产生相应抗体(人抗冠状病毒抗体),用以抵抗病毒的增殖。当人体被“非典”病毒感染并产生抗体之后,即用病人的血清(抗体)与检测试剂进行反应,呈阳性反应的说明受试者已受病毒感染,并产生了抗体(免疫反应)。但对于发病早期还未产生抗体的病人,阴性结果不能说明受试者未受病毒感染。
特异性地检测患者体内抗体IgM和IgG的水平,有这两种抗体产生的患者即可确定为“非典”感染者。对阴性结果仍需进行跟踪检测,如果超过“非典”潜伏期之后仍没有检测出抗体则可排除患病的可能。
①ELISA(酶联免疫吸咐反应)
ELISA法根据抗原抗体特异性免疫反应原理设计,采用间接法或双抗原夹心法检测SARS病例的血清中的抗SARS冠状病毒抗体IgG和IgM,大约在疾病开始后的10天出现可靠的阳性结果。该法特点是特异性强、反应灵敏、检出率高,是世界卫生组织(WHO)推荐的病原抗体临床检测的主要方法。
间接法主要用于检测体液中的抗体成份。该方法是将特异性抗原包被在固相载体的表面,形成固相抗原,加入待检样品,使其中的相应抗体结合到固相载体的抗原上,再加入酶标记的抗抗体,形成抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物,最后加入底物溶液显色。固相载体上的酶催化底物成为有色产物,通过比色测知样品中抗体的含量。间接法的优点是只要变换包被抗原,就可利用同一酶标记抗抗体建立检测相应抗体的方法。该法试验成败的关键在于包被抗原的纯度。特别注意要除去能与一般健康人血清发生免疫学反应的杂质,包被抗原中也不能含有可与酶标记得抗人Ig(s)反应的物质。间接法中另一个干扰因素是正常血清中所含有的高浓度非特异性IgG。由于IgG的吸附性很强,非特异性IgG可直接吸附在固相载体上,有时也可吸附在包被抗原的表面;故在间接法实验中,抗原包被后一般要用无关的蛋白质进行封闭固相载体上的剩余空间。检测的血清样本一般也不能直接使用,需经稀释后再加入与包被抗原进行反应,以减少高浓度的IgG对实验结果的干扰。
双抗原夹心法的反应模式与双抗体夹心法相类似。将特异性抗原结合在某种固相载体上,将指示剂标记在特异性抗原上,加入酶作用底物,酶与底物发生反应后,底物显色,根据底物显色的深浅定性或定量地检测待检样本中抗体的量。它与间接法测定抗体的不同之处是以酶标记抗原代替酶标记抗抗体,其敏感性和特异性均高于间接法。本法的关键在于酶标记抗原的制备应根据抗原结构的不同来寻找合适的标记方法。
ELISA法要求抗原纯度高、特异性好,否则会出现非特异性反应,操作程序较复杂,需反复洗涤,若洗涤次数不够或过多易造成假阳性和假阴性,并易造成操作者受害和环境污染,实验时间较长,需两小时以上得出检测结果。该法必须具备酶标仪和洗板机,这在基层实验室和小型门诊较难达到,且试验受温度等条件限制,给检测带来不便。
②IFA(荧光免疫检验法)
IFA法同样根据抗原抗体特异性免疫反应原理设计,把感染病毒的细胞固定在玻片上,将待检测病人的血清滴于上面,带有病毒的病人血清中含有相应抗体,结合于玻片上,加入荧光试剂,即可显示出荧光。在荧光免疫显微镜下可直接观察检测结果。IFA用于SARS病例的血清中的IgG抗体的测定,大约在疾病开始后的10天出现阳性结果。这种测试方法也可用于IgG抗体的测定。这也是一种经典的测定方法,需要借助于荧光免疫显微镜进行测定。
IFA法灵敏度高,但必须具备荧光免疫显微镜和暗室条件,为获得良好荧光观察效果必须配备合适的滤光片,实验时间需两小时,结果检测于荧光免疫显微镜下进行,必须由有经验的专业技术人员判定检测结果。
阳性的抗体测试结果显示以前曾有过SARS冠状病毒的感染。从急性期到恢复期发生了从阴性到阳性的血清转化,或者是抗体滴定增长了四倍,显示近期有感染。
阴性的抗体测试结果:在疾病发生的21天后没有检查到抗体,表明没有受到SARS冠状病毒的感染。
3.细胞培养
来自SARS病例的样品中的病毒(例如呼吸道分泌物、血液或者粪便),通过接种细胞培养和病毒增殖也能测到。一旦分离到了病毒,将做进一步的通过电镜观察或血清学反应等方法鉴别以证实是否是SARS病毒。细胞培养是条件非常苛刻的测试,但目前(除了动物测试外)仅仅表明了有活病毒的存在。阳性的细胞培养结果表明在所测试的样品中有活的SARS冠状病毒的存在。阴性的细胞培养结果并不能排除SARS冠状病毒的存在(见阴性的PCR结果)。
细胞培养是一种无菌操作技术,要求具备很高的实验工作环境和条件(无菌操作间、超净工作台、操作间等),需要大量仪器设备(培养箱、离心机、显微镜、离心机等),需要大量专业实验器材(多种培养器皿),实验技术复杂,需要有经验的专业技术人员操作,且实验周期很长(需数月),不适宜疾病的快速检测。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题,提供一种胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗原的试剂,可应用于医院、机场、海关、家庭等场所,能够在几分钟内判断结果,从而及早预防疫情扩散。
本发明的胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗原的试剂由包被膜、吸水纸、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜依次粘贴构成;
所述包被膜通过下述方法制备:用包被缓冲液稀释包被抗体至浓度为5~20μg/ml,喷涂或涂覆在包被膜上,晾干后,于37℃封闭液中浸泡60分钟,取出后置37℃烘干2小时,封袋备用;
所述包被抗体是SARS冠状病毒单克隆抗体、或SARS冠状病毒多克隆抗体、或两种及两种以上SARS冠状病毒单克隆抗体。
所述包被缓冲液和封闭液的配方及制备方法是本领域通用的技术。
所述吸水纸为普通市售。
所述金标抗体通过下述方法得到:用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.5,按9~11μg/ml胶体金加入SARS冠状病毒单克隆抗体,混匀后静置,离心处理,弃去上清,将沉淀用标记洗涤液洗涤,将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解,置4℃备用。
所述涂覆金标抗体的玻璃纤维膜可以用通用方法将金标抗体涂覆在玻璃纤维膜上,也可以通过下述方法得到:将制备好的金标抗体均匀地铺在玻璃纤维膜上,每毫升溶液铺4~8平方厘米,冷冻干燥,封袋,置4℃备用。
本发明试剂的工作原理如下:
胶体金免疫层析技术是近年来发展迅速的一种简便、快速的免疫学检测方法,本试剂采用胶体金免疫层析技术,选用一种SARS冠状病毒单克隆抗体(或SARS冠状病毒多克隆抗体、两种或两种以上SARS冠状病毒单克隆抗体)作为固相物,利用双抗体夹心法原理检测血清中是否含有SARS冠状病毒抗原。当待检标本中含有SARS冠状病毒抗原时,抗原先和金标记抗体结合,由于层析作用反应复合物沿包被膜向前移动,当遇到包被抗原时,形成抗体-抗原-金标记抗体复合物而富集在包被线上,形成红色沉淀线,为阳性结果,从而快速诊断“非典”。
本发明与现有技术相比具有如下优点:
1、诊断快速,10分钟内可完成检测。
2、不需任何仪器设备。
3、操作简便,不需由专业人员操作。
具体实施方式
实施例1
本实施例采用一种SARS冠状病毒单克隆抗体作为固相物,利用双抗体夹心法原理检测血清中是否含有SARS冠状病毒抗原。本实施例的制造方法如下:
a、抗体制备
采用一种SARS冠状病毒单克隆抗体。
b、抗体膜的制备
1、包被缓冲液的配制:0.05M pH9.6硫酸盐缓冲液为包被溶液,0.22μ膜滤过,置4℃备用,效期一周。
2、封闭液的配制:配制0.01M pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS),0.22μ膜滤过,置4℃备用,效期一周。配制封闭工作液:2%BSA,2%脱脂奶,0.01M pH7.0PBS,0.22μ膜滤过,置4℃备用,效期三天。
3、包被膜制备:调试喷膜机,喷液量为20微升/35厘米,用包被缓冲液稀释包被抗体,浓度为8μg/ml,机器划线,两线间隔5mm,应细致均匀,室温晾干20分钟。37℃在封闭液浸泡中60分钟,取出后置37℃烘干处理两小时,封袋备用。
c、胶体金、胶体金标记抗体的制备
1、氯金酸的配制:用双蒸水溶解氯金酸,配成1%溶液,置4℃备用,效期三天。1000ml 1%氯金酸溶液配方:10g氯金酸;1000ml双蒸水。
2、柠檬酸三钠的配制:用双蒸水溶解柠檬酸三钠,配成1%溶液,置4℃备用,效期三天。1000ml 1%柠檬酸三钠溶液配方:10g柠檬酸三钠;1000ml双蒸水。
3、0.1M碳酸钾的配制:用双蒸水配制,0.22μ膜滤过,置4℃备用,效期一周。1000ml 0.1M碳酸钾溶液配方:13.8g碳酸钾;1000ml双蒸水。
4、3%PEG-20000的配制:用双蒸水配制,0.22μ膜滤过,置4℃备用,效期一周。1000ml 3%PEG溶液配方:30g PEG-20000;1000ml双蒸水。
5、标记洗涤液的配制:2%BSA,0.01M pH7.0 PBS溶液,0.22μ膜滤过,置4℃备用,效期两周。1000ml标记洗涤液配方:20gBSA;1000ml 0.01M pH7.0PBS溶液。
6、金标抗体保存液的配制:1%BSA,0.5%脱脂奶,5/万NaN3,0.1%Tween-20,0.01M pH7.0 PBS溶液,0.22μ膜滤过,置4℃备用,效期十五天。1000ml金标抗体保存液配方:10g BSA;5g脱脂奶;0.5g NaN3;1ml Tween-20;1000ml0.01M pH7.0 PBS溶液。
7、胶体金的烧制:用双蒸水将1%氯金酸稀释成0.01%,置电炉煮沸,按每100毫升0.01%氯金酸加入4毫升1%柠檬酸三钠,继续煮沸,直到液体呈亮红色即停止加热,冷却至室温后补足失水。外观应纯净,透亮,无沉淀和漂浮物。
8、金标抗体的制备:用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.5,按10微克抗体/毫升胶体金加入SARS冠状病毒单克隆抗体,混匀,静置30分钟,13000rpm离心30分钟,弃上清,沉淀用标记洗涤液洗涤两次,最后一次弃去上清,将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解,置4℃备用,效期一周。
d、金标抗体的冻干
将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上,每毫升溶液铺6平方厘米,冷冻干燥,封袋,置4℃备用。
e、试纸板的生产
1、金标抗体玻璃纤维膜的裁切:根据滴配实验确定的宽度,将金标抗体玻璃纤维膜进行裁切,置干燥房间备用。
2、吸水纸的裁切:用裁纸机将吸水纸切成35厘米长,4.2厘米宽,置干燥房间备用。
3、玻璃纤维膜的裁切:将玻璃纤维膜切成长35厘米,宽2厘米的长条,置干燥房间备用。
4、大板的粘贴:按要求把包被膜、吸水纸、冻干金标抗体、玻璃纤维膜粘贴在塑料底板上,组成大板。组装车间温度控制在25℃,湿度20%-30%。
f、切条
用切条机将大板切成单个人份,每人份宽度2.5毫米,随机抽检,灵敏度能检出室内质控,条带显色程度达到一个“+”号,无非特异性条带,能够通过***Panel。
g、组装、包装
将50人份已切好的试纸条与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内,放入试剂盒,每盒一份说明书。于4-25℃避光保存,不得冻存。
检测150例“非典”可疑患者的血清样本,用分子测试方法(PCR)作对照,对本发明进行特异性和敏感性检测(见表1)。本发明的特异性达92%(92/100),灵敏性达90%(45/50)。
表1 150份“非典”可疑患者血清样本SARS冠状病毒抗原检测结果
实验组(本发明)
合计
阳性数 阴性数
阳性数 45 5 50
对照组(PCR)
阴性数 8 92 100
合计 51 97 150
实施例2
本实施例采用两种或两种以上SARS冠状病毒单克隆抗体作为固相物,利用双抗体夹心法原理检测血清中是否含有SARS冠状病毒抗原。本实施例的制造方法与实施例1基本相同,不同点如下:
1、采用两种或两种以上SARS冠状病毒单克隆抗体作为包被抗体。
2、包被膜的制备:调试喷膜机,喷液量为20微升/35厘米,用包被缓冲液稀释包被抗体,浓度为5μg/ml,机器划线,两线间隔5mm,应细致均匀,室温晾干20分钟。37℃在封闭液浸泡中60分钟,取出后置37℃烘干处理两小时,封袋备用。
3、金标抗体的制备:用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.5,按11微克抗体/毫升胶体金加入SARS冠状病毒单克隆抗体,混匀,静置30分钟,13000rpm离心30分钟,弃上清,沉淀用标记洗涤液洗涤两次,最后一次弃去上清,将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解,置4℃备用,效期一周。
4、金标抗体的冻干:将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上,每毫升溶液铺4平方厘米,冷冻干燥,封袋,置4℃备用。
实施例3
本实施例采用SARS冠状病毒多克隆抗体作为固相物,利用双抗体夹心法原理检测血清中是否含有SARS冠状病毒抗原。本实施例的制造方法与实施例1基本相同,不同点如下:
1、采用SARS冠状病毒多克隆抗体作为包被抗体。
2、包被膜的制备:调试喷膜机,喷液量为20微升/35厘米,用包被缓冲液稀释包被抗体,浓度为20μg/ml,机器划线,两线间隔5mm,应细致均匀,室温晾干20分钟。37℃在封闭液浸泡中60分钟,取出后置37℃烘干处理两小时,封袋备用。
3、金标抗体的制备:用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.5,按9微克抗体/毫升胶体金加入SARS冠状病毒单克隆抗体,混匀,静置30分钟,13000rpm离心30分钟,弃上清,沉淀用标记洗涤液洗涤两次,最后一次弃去上清,将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解,置4℃备用,效期一周。
4、金标抗体的冻干:将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上,每毫升溶液铺8平方厘米,冷冻干燥,封袋,置4℃备用。
Claims (5)
1、一种胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗原的试剂,其特征在于由包被膜、吸水纸、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜依次粘贴构成;所述包被膜通过下述方法制备得到:用包被缓冲液稀释包被抗体至浓度为5~20μg/ml,喷涂或涂覆在包被膜上,晾干后,于37℃封闭液中浸泡60分钟,取出后置37℃烘干2小时,封袋备用;所述包被抗体是SARS冠状病毒单克隆抗体、或SARS冠状病毒多克隆抗体、或两种及两种以上SARS冠状病毒单克隆抗体;所述金标抗体通过下述方法得到:用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.5,按9~11μg/ml胶体金加入SARS冠状病毒单克隆抗体,混匀后静置,离心处理,弃去上清,将沉淀用标记洗涤液洗涤,将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解,置4℃备用。
2、根据权利要求1所述的胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗原的试剂,其特征在于所述涂覆金标抗体的玻璃纤维膜通过下述方法得到:将制备好的金标抗体均匀地铺在玻璃纤维膜上,每毫升溶液铺4~8平方厘米,冷冻干燥,封袋,置4℃备用。
3、根据权利要求1或2所述的胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗原的试剂,其特征在于所述包被膜通过下述方法制备得到:用包被缓冲液稀释包被抗体至浓度为8μg/ml,喷涂或涂覆在包被膜上,晾干后,于37℃封闭液中浸泡60分钟,取出后置37℃烘干2小时,封袋备用。
4、根据权利要求1或2所述的胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗原的试剂,其特征在于所述金标抗体通过下述方法得到:用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.5,按10μg/ml胶体金加入SARS冠状病毒单克隆抗体,混匀后静置,离心处理,弃去上清,将沉淀用标记洗涤液洗涤,将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解,置4℃备用。
5、根据权利要求1或2所述的胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗原的试剂,其特征在于所述包被膜通过下述方法制备得到:用包被缓冲液稀释包被抗体至浓度为8μg/ml,喷涂或涂覆在包被膜上,晾干后,于37℃封闭液中浸泡60分钟,取出后置37℃烘干2小时,封袋备用;所述金标抗体通过下述方法得到:用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.5,按10μg/ml胶体金加入SARS冠状病毒单克隆抗体,混匀后静置,离心处理,弃去上清,将沉淀用标记洗涤液洗涤,将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解,置4℃备用。
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