CN111044728B - 用于快速检测腺病毒的IgM抗体胶体金试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于快速检测腺病毒的IgM抗体胶体金试纸条，其包括基板，所述基板上依次设有样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫的一部分叠覆于所述胶体金标记垫上，所述胶体金标记垫的一部分叠覆于所述硝酸纤维素膜上，所述吸水纸的一部分与所述硝酸纤维素膜搭接，所述胶体金标记垫含有羊抗人IgM抗体‑胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，所述第一检测线包被有腺病毒特异性抗原多肽‑载体蛋白，所述对照线包被有人IgM抗体。本发明提供的IgM抗体胶体金试纸条具有操作简单、检测快速、成本低廉等特点。

Description

用于快速检测腺病毒的IgM抗体胶体金试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于快速检测腺病毒的IgM抗体胶体金试纸条。
背景技术
腺病毒是无包膜的DNA病毒，目前包含有85种病毒亚型，能够感染呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱、眼和肝脏等。其中腺病毒引发的肺炎在儿童中较常见，约占儿童肺炎的10％，其中大部分的腺病毒感染症状较轻，但是也有部分会形成重症，严重可导致患者死亡。腺病毒引发的重症因素较多，跟患儿的免疫状态、年龄有一定的关系，另外腺病毒引起肺炎重症跟腺病毒亚型有密切关系，引发腺病毒重症肺炎主要有3型、4型、7型、55型腺病毒亚型。目前腺病毒没有任何的特效药，临床主要是采用对症治疗的方法，因此腺病毒的早期诊断特别是腺病毒亚型的检测是对医生诊疗方案的制定有很大的指导意义的。
目前腺病毒分型主要是中和抗体血清型测试方法和核酸序列分型测试方法。其中血清型中和抗体操作过程比较复杂，需要先从病人标本中分离培养到腺病毒，测试分离的腺病毒TCID50数值，再用特异血清型血清标本与100TCID50腺病毒进行微量中和抗体测试，时间需要3周以上。这个方法由于操作需要有专业培训的技术人员，要具备专业的细胞和病毒实验室，并且操作时间比较长，因此中和抗体血清型测试方法只能应用科研工作，无法满足日常临床的诊断工作。核酸序列分型的方法是抽提患者标本中的病毒核酸，选用特异腺病毒亚型荧光PCR诊断试剂盒(内有特异针对腺病毒的引物和探针)进行测试。该方法灵敏度高，特异性强，是腺病毒分型的主流方法。但是该方法需要国家认证的PCR实验室，需要经过专业培训合格的技术员，还需要昂贵的荧光PCR仪器，因此无法很好应用于基层医疗单位的日常检测。另外腺病毒分型也可以采用宏基因组测试，宏基因组是以环境中所有微生物基因组为研究对象，通过对环境样品中的全基因组DNA进行高通量测序，获得单个样品的饱和数据量，基于denovo组装进行微生物群落结构多样性，微生物群体基因组成及功能，特定环境相关的代谢通路等分析，可以有效对腺病毒进行分型测试。但是宏基因组测试成本昂贵，一般患者都承受不起。
发明内容
本发明的目的是针对以上技术缺陷提供一种操作简单，能够快速、准确地检测腺病毒的IgM抗体胶体金试纸条。
为了实现以上目的，本发明提供了一种用于快速检测腺病毒的IgM抗体胶体金试纸条，该IgM抗体胶体金试纸条包括基板，所述基板上依次设有样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫的一部分叠覆于所述胶体金标记垫上，所述胶体金标记垫的一部分叠覆于所述硝酸纤维素膜上，所述吸水纸的一部分与所述硝酸纤维素膜搭接，所述胶体金标记垫含有羊抗人IgM抗体-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，所述检测线包被有腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白，所述对照线包被有人IgM抗体。
优选地，所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白中的腺病毒特异性抗原多肽是3型腺病毒特异性抗原多肽、4型腺病毒特异性抗原多肽、7型腺病毒特异性抗原多肽或55型腺病毒特异性抗原多肽中的一种或多种。
作为一种优选的实施方式，所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白中的腺病毒特异性抗原多肽为3型腺病毒特异性抗原多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示(氨基酸序列位于3型腺病毒的六邻体第136位到第189位)。
作为一种优选的实施方式，所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白中的腺病毒特异性抗原多肽为4型腺病毒特异性抗原多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示(氨基酸序列位于4型腺病毒的六邻体第136位到第183位)。
作为一种优选的实施方式，所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白中的腺病毒特异性抗原多肽为7型腺病毒特异性抗原多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示(氨基酸序列位于7型腺病毒的六邻体第261位到第308位)。
作为一种优选的实施方式，所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白中的腺病毒特异性抗原多肽为55型腺病毒特异性抗原多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示(氨基酸序列位于7型腺病毒的六邻体第132位到第180位)。
作为一种优选的实施方式，根据本发明的IgM抗体胶体金试纸条中，所述腺病毒特异性多肽-载体蛋白根据EDC方法将腺病毒特异性多肽与载体蛋白进行化学交联获得。优选地，所述载体蛋白是BSA、KLH、OVA中的任意一种或多种。最优选为KLH蛋白。
另一方面，本发明还提供了一种同时检测多种腺病毒的试剂盒，其包括至少两个所述IgM抗体胶体金试纸条，并且每个IgM抗体胶体金试纸条中的腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白中的腺病毒特异性抗原多肽不同，所述腺病毒特异性抗原多肽选自3型腺病毒特异性抗原多肽、4型腺病毒特异性抗原多肽、7型腺病毒特异性抗原多肽、55型腺病毒特异性抗原多肽中的任意两种或更多种。
优选地，上述同时检测多种腺病毒的试剂盒包括四个所述IgM抗体胶体金试纸条，并且每个IgM抗体胶体金试纸条中的腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白中的腺病毒特异性抗原多肽分别为3型腺病毒特异性抗原多肽、4型腺病毒特异性抗原多肽、7型腺病毒特异性抗原多肽和55型腺病毒特异性抗原多肽。
另一方面，本发明还提供了根据本发明的IgM抗体胶体金试纸条的制备方法，其包括如下步骤：
步骤1：制备所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白；
步骤2：制备含有所述羊抗人IgM抗体-胶体金标记物的胶体金标记垫；
步骤3：将所述样品垫、所述胶体金标记垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水纸粘贴在所述基板上；
步骤4：将所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白和所述人IgM抗体喷涂在所述硝酸纤维素膜上。
优选地，所述步骤1的具体操作如下：将2mg KLH蛋白用0.2ml的0.1M MES溶解，将2mg腺病毒特异性抗原多肽用0.5ml的0.1M MES溶解，然后将两种溶液混合，再加入50μl质量体积浓度为1％的EDC溶液，混合均匀，室温下反应，透析，得到所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白。
优选地，所述步骤2的具体操作如下：100ml的超纯水加热沸腾后加入1-1.5ml的氯金酸，搅拌均匀后迅速加入1-1.5ml的1％(质量浓度)柠檬酸三钠溶液，液体变成红色后继续沸腾10min，冷却至常温，将胶体金溶液倒入烧杯中，放置到磁力搅拌器上搅拌，同时用0.2M碳酸钾调整pH至8.0，然后加入1ml羊抗人IgM抗体，磁力搅拌30min，加入0.1ml封闭液磁力搅拌10min，然后取出标记好羊抗人IgM抗体的胶体金溶液，9000g离心30min，弃去上清，加入10ml胶体金稀释液重悬胶体金沉淀，充分混匀后喷涂到所述胶体金标记垫上，真空冷冻干燥。
优选地，所述步骤4的具体操作如下：用包被缓冲液稀释人IgM抗体、3型腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白，其中人IgM抗体的浓度为1mg/ml，3型腺病毒抗原多肽-载体蛋白浓度为0.5mg/ml，然后均匀喷涂到所述硝酸纤维素膜上。
本发明还提供一种能够区分3型、4型、7型、55型腺病毒的免疫快速分型诊断方法，其利用3型、4型、7型、55型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条测试感染患者血清中的特异性IgM抗体来判断患者感染的腺病毒亚型，其中用于区分特异性IgM抗体是4种腺病毒特异性抗原多肽。该检测方法的步骤如下：
(1)使用血清采集管采集患者的血液标本，通过离心方法分离血清标本；
(2)分别吸取10μl血清标本加入到所述腺病毒IgM抗体胶体金试纸条上，再分别加入100μl的样本稀释液，室温作用15分钟，肉眼判断结果。
优选地，所述样品是人血清标本，该方法检测是人血清中腺病毒IgM抗体。所述样本稀释液为按重量计含有0.15％海藻糖、0.1％胰蛋白胨、0.5％牛血清白蛋白和0.1％prolin-300的PBS缓冲液。
本发明提供的IgM抗体胶体金试纸条利用3型、4型、7型、55型腺病毒亚型特异性抗原多肽为诊断靶位，检测患者血清中的IgM抗体，从而判断患者感染腺病毒的亚型情况，并且具有以下优势：操作简单，普通医务人员经过简单的培训就可以操作；检测时间短，15分钟即可得到检测结果，方便医生及时根据检测结果制定医疗方案；无实验室条件限制，适合医疗条件不完善的基层医院和社区诊所的诊疗工作；成本低廉，适用于医疗单位进行初步筛查工作。
附图说明
图1为本发明的腺病毒IgM抗体检测试纸条的结构侧视图。
图2为本发明的腺病毒IgM抗体检测试纸条的结构正视图。
图3为本发明的检测试纸条检测腺病毒IgM抗体的阳性结果示意图。
图4为本发明的检测试纸条检测腺病毒IgM抗体的阴性结果示意图。
图5为本发明的检测试纸条检测腺病毒IgM抗体的无效结果示意图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行详细说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例1：腺病毒特异性抗原多肽的制备
采用合成的方法制备腺病毒特异性抗原多肽，本发明所述的腺病毒抗原多肽包括3、4、7、55型腺病毒抗原多肽。其中3型腺病毒特异性抗原多肽的氨基酸序列如序列表SEQID NO.1所示；4型腺病毒特异性抗原多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；7型腺病毒特异性抗原多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；55型腺病毒特异性抗原多肽的氨基酸序列如见序列表SEQ ID NO.4所示。以上4种腺病毒抗原多肽委托上海吉尔生化公司负责合成，要求多肽的纯度大于99％。
实施例2：腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白的制备(EDC合成)
配置0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES，pH值4.5-5.0)。将10mg 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)加入到1ml超纯水，配置成1％质量体积浓度的EDC溶液。将2mg KLH蛋白(钥孔血蓝蛋白，也可使用BSA蛋白(牛血清蛋白)、OVA蛋白(鸡卵白蛋白))用0.2ml的0.1M MES溶解，将2mg的3型腺病毒特异性抗原多肽(或4型腺病毒特异性抗原多肽、或7型腺病毒特异性抗原多肽、或55型腺病毒特异性抗原多肽)用0.5ml的0.1M MES溶解，然后将两种溶液混合，再加入50μl现配的1％质量体积浓度的EDC溶液，混合均匀，室温下反应2小时。最后将反应完成的腺病毒抗原多肽-KLH蛋白4℃透析3-6小时，透析缓冲液为10mMPBS(Ph7.2)，中间换液2-5次。纯化物分装，-20℃保存备用。
实施例3：3型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条制备
3.1羊抗人IgM抗体胶体金标记垫制备
在硅化的三角烧瓶中加入100ml的超纯水，放置在磁力加热器上加热，沸腾后加入1-1.5ml的氯金酸(购自Sigma公司)，搅拌均匀后迅速加入1-1.5ml的1％柠檬酸三钠(购自广州化学试剂厂)溶液，液体变成红色后继续沸腾10min，再取下冷却。待冷却至常温，将胶体金溶液倒入烧杯中，放置到磁力搅拌器上搅拌，同时用0.2M碳酸钾调整pH至8.0，然后加入1ml羊抗人IgM抗体(购自Sigma公司，浓度1mg/ml)，磁力搅拌30min，加入0.1ml封闭液(10％BSA+0.1％Proclin-300+10mM PBS)磁力搅拌10min，然后取出标记好羊抗人IgM抗体的胶体金溶液，9000g离心30min，弃去上清，加入10ml胶体金稀释液(0.5％BSA+0.2％tween-20+2％蔗糖+0.1％Proclin-300+10mMPBS)重悬胶体金沉淀，充分混匀后以0.2-0.5μl/mm2喷涂到胶体金标记垫上，放入真空冷冻干燥剂中冻干4-5小时，取出放置干燥环境中备用。
3.2硝酸纤维素膜包被
用包被缓冲液(1.5％蔗糖+10mM PBS)稀释人IgM抗体、3型腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白，其中人IgM抗体的浓度为1mg/ml，3型腺病毒抗原多肽-载体蛋白浓度为0.5mg/ml。如图1和图2所示，将两者均匀喷涂到硝酸纤维素膜3上，其中人IgM抗体喷到硝酸纤维素膜3的对照线7上，腺病毒抗原多肽-载体蛋白喷到硝酸纤维素膜3的检测线6上，对照线7和检测线6位置相隔至少0.5cm。如图所示，该IgM抗体胶体金试纸条包括基板5，基板5上依次设有样品垫1、胶体金标记垫2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4，样品垫1的一部分叠覆于胶体金标记垫2上，胶体金标记垫2的一部分叠覆于硝酸纤维素膜3上，吸水纸4的一部分与硝酸纤维素膜3搭接，胶体金标记垫2含有羊抗人IgM抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜3上设有检测线6和对照线7，检测线6包被有腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白，对照线7包被有人IgM抗体。
将喷涂好的硝酸纤维素膜3放置在湿度10-30％、，温度20-35℃的条件下晾干处理12小时以上，晾干好的硝酸纤维素膜3密封备用。
3.3组装、切条
将样品垫1、胶体金标记垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4结合按照图1所示，依次黏贴在pvc背板上，调整切条机参数进行切条，切成4mm宽度的试纸条。
3.4样本稀释液配置
称量1.5g海藻糖、1g胰蛋白胨、5g牛血清白蛋白溶解于1000ml的10mMPBS中，搅拌均匀后再加入1ml的prolin-300，搅拌均匀后0.45μm过滤器过滤，分装成5ml/瓶备用。
实施例4：4型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条的制备
4.1羊抗人IgM抗体胶体金标记垫的制备
在硅化的三角烧瓶中加入100ml的超纯水，放置在磁力加热器上加热，沸腾后加入1-1.5ml的氯金酸(购自Sigma公司)，搅拌均匀后迅速加入1-1.5ml的1％柠檬酸三钠(购自广州化学试剂厂)溶液，液体变成红色后继续沸腾10min，再取下冷却。待冷却至常温，将胶体金溶液倒入烧杯中，放置到磁力搅拌器上搅拌，同时用0.2M碳酸钾调整pH至8.0，然后加入1ml羊抗人IgM抗体(购自Sigma公司，浓度1mg/ml)，磁力搅拌30min，加入0.1ml封闭液(10％BSA+0.1％Proclin-300+10mM PBS)磁力搅拌10min，然后取出标记好羊抗人IgM抗体的胶体金溶液，9000g离心30min，弃去上清，加入10ml胶体金稀释液(0.5％BSA+0.2％tween-20+2％蔗糖+0.1％Proclin-300+10mMPBS)重悬胶体金沉淀，充分混匀后以0.2-0.5μl/mm2喷涂到胶体金标记垫上，放入真空冷冻干燥剂中冻干4-5小时，取出放置干燥环境中备用。
4.2硝酸纤维素膜包被
用包被缓冲液(1.5％蔗糖+10mM PBS)稀释人IgM抗体、4型腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白，其中人IgM抗体的浓度为1mg/ml，4型腺病毒抗原多肽-载体蛋白浓度为1.2mg/ml。如图1和图2所示，将两者均匀喷涂到硝酸纤维素膜3上，其中人IgM抗体喷到硝酸纤维素膜3的对照线7上，腺病毒抗原多肽-载体蛋白喷到硝酸纤维素膜3的检测线6上，对照线7和检测线6位置相隔0.5cm。将喷涂好的硝酸纤维素膜3放置在湿度10-30％、温度20-35℃条件下晾干处理12小时以上，晾干好的硝酸纤维素膜3密封备用。
4.3组装、切条
将样品垫1、胶体金标记垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4结合按照图1所示，依次黏贴在pvc背板上，调整切条机参数进行切条，切成4mm宽度的试纸条。
4.4样本稀释液配置
称量1.5g海藻糖，1g胰蛋白胨，5g牛血清白蛋白溶解于1000ml的10mMPBS中，搅拌均匀后在加入1ml的prolin-300，搅拌均匀后0.45μm过滤器过滤，分装成5ml/瓶备用。
实施例5：7型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条的制备
5.1羊抗人IgM抗体胶体金标记垫的制备
在硅化的三角烧瓶中加入100ml的超纯水，放置在磁力加热器上加热，沸腾后加入1-1.5ml的氯金酸(购自Sigma公司)，搅拌均匀后迅速加入1-1.5ml的1％柠檬酸三钠(购自广州化学试剂厂)溶液，液体变成红色后继续沸腾10min，再取下冷却。待冷却至常温，将胶体金溶液倒入烧杯中，放置到磁力搅拌器上搅拌，同时用0.2M碳酸钾调整pH至8.0，然后加入1ml羊抗人IgM抗体(购自Sigma公司，浓度1mg/ml)，磁力搅拌30min，加入0.1ml封闭液(10％BSA+0.1％Proclin-300+10mM PBS)磁力搅拌10min，然后取出标记好羊抗人IgM抗体的胶体金溶液，9000g离心30min，弃去上清，加入10ml胶体金稀释液(0.5％BSA+0.2％tween-20+2％蔗糖+0.1％Proclin-300+10mMPBS)重悬胶体金沉淀，充分混匀后以0.2-0.5μl/mm2喷涂到胶体金标记垫上，放入真空冷冻干燥剂中冻干4-5小时，取出放置干燥环境中备用。
5.2硝酸纤维素膜包被
用包被缓冲液(1.5％蔗糖+10mM PBS)稀释人IgM抗体、7型腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白，其中人IgM抗体的浓度为1mg/ml，7型腺病毒抗原多肽-载体蛋白浓度为0.8mg/ml。如图1和图2所示，将两者均匀喷涂到硝酸纤维素膜3上，其中人IgM抗体喷到硝酸纤维素膜3的对照线7上，腺病毒抗原多肽-载体蛋白喷到硝酸纤维素膜3的检测线6上，对照线7和检测线6位置相隔0.5cm。将喷涂好的硝酸纤维素膜3放置在湿度10-30％、温度20-35℃条件下晾干处理12小时以上，晾干好的硝酸纤维素膜3密封备用。
5.3组装、切条
将样品垫1、胶体金标记垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4结合按照附图1所示，依次黏贴在pvc背板上，调整切条机参数进行切条，切成4mm宽度的试纸条。
5.4样本稀释液配置
称量1.5g海藻糖，1g胰蛋白胨，5g牛血清白蛋白溶解于1000ml的10mMPBS中，搅拌均匀后在加入1ml的prolin-300，搅拌均匀后0.45μm过滤器过滤，分装成5ml/瓶备用。
实施例6：55型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条的制备
6.1羊抗人IgM抗体胶体金标记垫制备
在硅化的三角烧瓶中加入100ml的超纯水，放置在磁力加热器上加热，沸腾后加入1-1.5ml的氯金酸(购自Sigma公司)，搅拌均匀后迅速加入1-1.5ml的1％柠檬酸三钠(购自广州化学试剂厂)溶液，液体变成红色后继续沸腾10min，再取下冷却。待冷却至常温，将胶体金溶液倒入烧杯中，放置到磁力搅拌器上搅拌，同时用0.2M碳酸钾调整pH至8.0，然后加入1ml羊抗人IgM抗体(购自Sigma公司，浓度1mg/ml)，磁力搅拌30min，加入0.1ml封闭液(10％BSA+0.1％Proclin-300+10mM PBS)磁力搅拌10min，然后取出标记好羊抗人IgM抗体的胶体金溶液，9000g离心30min，弃去上清，加入10ml胶体金稀释液(0.5％BSA+0.2％tween-20+2％蔗糖+0.1％Proclin-300+10mMPBS)重悬胶体金沉淀，充分混匀后以0.2-0.5μl/mm2喷涂到胶体金标记垫上，放入真空冷冻干燥剂中冻干4-5小时，取出放置干燥环境中备用。
6.2硝酸纤维素膜包被
用包被缓冲液(1.5％蔗糖+10mM PBS)稀释人IgM抗体、55型腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白，其中人IgM抗体的浓度为1mg/ml，55型腺病毒抗原多肽-载体蛋白浓度为0.6mg/ml。如图1和图2所示，将两者均匀喷涂到硝酸纤维素膜3上，其中人IgM抗体喷到硝酸纤维素膜3的对照线7上，腺病毒抗原多肽-载体蛋白喷到硝酸纤维素膜3的检测线6上，对照线7和检测线6位置相隔0.5cm。将喷涂好的硝酸纤维素膜3放置在湿度10-30％、温度20-35℃条件下晾干处理12小时以上，晾干好的硝酸纤维素膜3密封备用。
6.3组装、切条
将样品垫1、胶体金标记垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4结合按照附图1所示，依次黏贴在pvc背板上，调整切条机参数进行切条，切成4mm宽度的试纸条。
6.4样本稀释液配置
称量1.5g海藻糖，1g胰蛋白胨，5g牛血清白蛋白溶解于1000ml的10mMPBS中，搅拌均匀后在加入1ml的prolin-300，搅拌均匀后0.45μm过滤器过滤，分装成5ml/瓶备用。
实施例7：腺病毒分型诊断试剂盒检测人血清吸取患者的血清标本10μl，加入到腺病毒IgM抗体胶体金试纸条的样品垫处，再加入样本稀释液100μl，室温放置15-20min，肉眼判断结果。
结果判断标准如下：
检测线6和对照线7出现红色条带，判定为腺病毒IgM阳性，如图3所示。
对照线7出现红色条带，而检测线6未出，判定为腺病毒IgM阴性，如图4所示。
对照线7未出现红色条带，表示试纸条无效，需要另取试纸条重新测试标本，如图5所示。
实施例8：腺病毒IgM抗体检测方法与PCR分型方法的对比实验
腺病毒PCR分型方法：根据腺病毒DNA全长序列，选择特异的核酸序列，分别设计引物和序列，构建荧光PCR诊断试剂盒，3、4、7、55型腺病毒具体的引物和探针见表1。
表1：3、4、7、55型腺病毒引物和探针序列表
Figure BDA0002218573250000091
选择疑似腺病毒感染的患者，分别采集患者的血清标本和咽拭子标本，其中血清标本用于测试腺病毒IgM抗体，咽拭子标本用于测试腺病毒核酸。腺病毒IgM抗体选用本发明构建的3型、4型、7型、55型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条进行测试。腺病毒核酸分型诊断试剂盒选用广州呼研所公司生产的3型、4型、7型、55型腺病毒核酸分型诊断试剂盒，严格按照生产企业的说明书操作。结果显示：3型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条与3型腺病毒核酸分型诊断试剂盒相比，阳性率为93.33％，特异性率为94.34％，经过SPSS软件统计分析，P大于0.05，差异不显著(见表2)；4型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条与4型腺病毒核酸分型诊断试剂盒相比，阳性率为92.00％，特异性率为93.88％，经过SPSS软件统计分析，P大于0.05，差异不显著(见表3)；7型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条与7型腺病毒核酸分型诊断试剂盒相比，阳性率为92.30％，特异性率为94.20％，经过SPSS软件统计分析，P大于0.05，差异不显著(见表4)；55型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条与55型腺病毒核酸分型诊断试剂盒相比，阳性率为90.48％，特异性率为92.68％，经过SPSS软件统计分析，P大于0.05，差异不显著(见表5)。
表2：3型腺病毒IgM抗体分型检测方法与PCR分型检测方法的对比测试
Figure BDA0002218573250000101
表3：4型腺病毒IgM抗体分型检测方法与PCR分型检测方法的对比测试
Figure BDA0002218573250000102
表4：7型腺病毒IgM抗体分型检测方法与PCR分型检测方法的对比测试
Figure BDA0002218573250000103
表5：55型腺病毒IgM抗体分型检测方法与PCR分型检测方法的对比测试
Figure BDA0002218573250000104
实施例9：腺病毒IgM抗体检测方法与血清中和抗体方法的对比实验
腺病毒血清中和抗体分型方法原理：从患者的咽拭子标本分离培养出腺病毒，再测试腺病毒的TCID50值，然后将100TCID50的腺病毒与不同亚型腺病毒的中和血清抗体进行微量中和实验，测试患者所感染的腺病毒亚型。
选择疑似腺病毒感染患者，采集患者的血清标本和咽拭子标本。其中咽拭子标本用于分离培养病毒，病毒培养后测试TCID50，再将100TCID50病毒与3、4、7、55型腺病毒中和抗体血清进行混合，然后接种到A549细胞上进行微量细胞中和试验，显微镜下观察细胞的病变效应，连续观察3-5天。如果与3型腺病毒中和抗体血清混合不会产生细胞病变，则说明患者感染的是3型腺病毒。其余亚型分类标准也同上。患者的血清标本采用本发明构建的腺病毒IgM抗体胶体金试纸条进行测试。判断标本：患者的血清是针对3型腺病毒IgM抗体阳性，则证明患者感染3型腺病毒。其它亚型腺病毒判断同3型腺病毒标准。
结果显示：3型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条与3型腺病毒血清中和抗体方法相比，阳性率为90.00％，特异性率为92.45％，经过SPSS软件统计分析，P大于0.05，差异不显著(见表6)；4型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条与4型腺病毒血清中和抗体方法相比，阳性率为88.00％，特异性率为91.84％，经过SPSS软件统计分析，P大于0.05，差异不显著(见表7)；7型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条与7型腺病毒血清中和抗体方法相比，阳性率为94.29％，特异性率为90.41％，经过SPSS软件统计分析，P大于0.05，差异不显著(见表8)；55型腺病毒IgM抗体胶体金试纸条与55型腺病毒血清中和抗体方法相比，阳性率为86.96％，特异性率为94.87％，经过SPSS软件统计分析，P大于0.05，差异不显著(见表9)。
表6：3型腺病毒IgM抗体分型检测方法与血清中和抗体检测方法的对比测试
Figure BDA0002218573250000111
表7：4型腺病毒IgM抗体分型检测方法与血清中和抗体检测方法的对比测试
Figure BDA0002218573250000112
表8：7型腺病毒IgM抗体分型检测方法与血清中和抗体检测方法的对比测试
Figure BDA0002218573250000113
表9：55型腺病毒IgM抗体分型检测方法与血清中和抗体检测方法的对比测试
Figure BDA0002218573250000121
实施例10：3、4、7、55型腺病毒IgM抗体检测试纸条特异性研究
选择多种亚型腺病毒感染患者、甲型流感病毒感染患者、乙型流感病毒感染患者、副流感病毒感染患者、呼吸道合胞病毒感染患者的血清标本，其中患者感染病毒的类型是通过病毒核酸测序的方法确认的，分别选用本发明3、4、7、55型腺病毒IgM抗体检测试纸条进行检测。检测方法如上所述。
检测结果显示：3型腺病毒IgM抗体检测试纸条与4、7、55型腺病毒以及甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒的等感染患者血清无交叉反应；4型腺病毒IgM抗体检测试纸条与3、7、55型腺病毒以及甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒等感染患者血清无交叉反应；7型腺病毒IgM抗体检测试纸条与3、4、55型腺病毒以及甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒等感染患者血清无交叉反应；55型腺病毒IgM抗体检测试纸条与3、4、7型腺病毒以及甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒感染患者血清无交叉反应。由此可见，本发明的3、4、7、55型腺病毒IgM抗体检测试纸条具有良好的特异性。
尽管上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 广州医科大学附属第一医院(广州呼吸中心)
广州呼吸健康研究院
<120> 用于快速检测腺病毒的IgM抗体胶体金试纸条及其制备方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 54
<212> PRT
<213> 3型腺病毒(Adenovirus type 3)
<400> 3
Ile Val Thr Thr Asn Arg Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr
1 5 10 15
Phe Gly Ile Ala Ser Met Lys Gly Asp Asn Ile Thr Lys Glu Gly Leu
20 25 30
Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro Ile
35 40 45
Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr
50
<210> 2
<211> 48
<212> PRT
<213> 4型腺病毒(Adenovirus type 4)
<400> 2
Lys Asp Ser Asp Ser Lys Met His Thr Phe Gly Ala Ala Ala Met Pro
1 5 10 15
Gly Val Thr Gly Lys Lys Ile Glu Ala Asp Gly Leu Pro Ile Arg Ile
20 25 30
Asp Ser Thr Ser Gly Thr Asp Thr Val Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Phe
35 40 45
<210> 3
<211> 48
<212> PRT
<213> 7型腺病毒(Adenovirus type 7)
<400> 3
Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu Tyr
1 5 10 15
Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu Thr Pro Asp Ser His Val Val Tyr Lys
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Asp Asp Asn Ser His Ala Asn Leu Gly Gln Gln Ala
35 40 45
<210> 4
<211> 49
<212> PRT
<213> 55型腺病毒(Adenovirus type 55)
<400> 4
Thr Ser Gln Trp Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val
1 5 10 15
Thr Glu Glu Glu Asn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Phe Gly Asn Ala Pro
20 25 30
Val Lys Ala Glu Ala Glu Ile Thr Lys Glu Gly Leu Pro Ile Gly Leu
35 40 45
Lys
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgagacctcc tacccatgaa ctaa 24
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gactgtattg ctgatttcaa gtaagtgtct 30
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcattgcccc taccttaccc aatccaa 27
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcaagctact gctcttccga c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgtgatggc agggtcccga g 21
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttcctacca gggatctatc agtgcgtc 28
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccacttaatc ataaatcagg gcaaaa 26
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttctctggaa ttaacattga aaggatag 28
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcagttgtg ctgggcatg 19
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tggctactgg tgcccttact aatgctaaag g 31
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaggcggtca ggcaaaacc 19
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccatgtcaat atcatattcg actttctga 29
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaaacaacgg agcagcca 18

Claims (5)

1.一种用于快速检测腺病毒的IgM抗体胶体金试纸条，其特征在于：所述IgM抗体胶体金试纸条包括基板，所述基板上依次设有样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫的一部分叠覆于所述胶体金标记垫上，所述胶体金标记垫的一部分叠覆于所述硝酸纤维素膜上，所述吸水纸的一部分与所述硝酸纤维素膜搭接，所述胶体金标记垫含有羊抗人IgM抗体-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，所述检测线包被有腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白，所述对照线包被有人IgM抗体；
所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白中的腺病毒特异性抗原多肽为4型腺病毒特异性抗原多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的IgM抗体胶体金试纸条，其特征在于：所述腺病毒特异性多肽-载体蛋白根据EDC方法将腺病毒特异性多肽与载体蛋白进行化学交联获得。
3.权利要求1所述的IgM抗体胶体金试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：制备所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白；
步骤2：制备含有所述羊抗人IgM抗体-胶体金标记物的胶体金标记垫；
步骤3：将所述样品垫、所述胶体金标记垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水纸粘贴在所述基板上；
步骤4：将所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白和所述人IgM抗体喷涂在所述硝酸纤维素膜上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1的具体操作如下：将2mg KLH蛋白用0.2ml的0.1M MES溶解，将2mg腺病毒特异性抗原多肽用0.5ml的0.1M MES溶解，然后将两种溶液混合，再加入50μl质量体积浓度为1%的EDC溶液，混合均匀，室温下反应，透析，得到所述腺病毒特异性抗原多肽-载体蛋白。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2的具体操作如下：100ml的超纯水加热沸腾后加入1-1.5ml的氯金酸，搅拌均匀后迅速加入1-1.5ml的1%（质量浓度）柠檬酸三钠溶液，液体变成红色后继续沸腾10min，冷却至常温，将胶体金溶液倒入烧杯中，放置到磁力搅拌器上搅拌，同时用0.2M 碳酸钾调整pH至8.0，然后加入1ml 羊抗人IgM抗体，磁力搅拌30min，加入0.1ml 封闭液磁力搅拌10min，然后取出标记好羊抗人IgM抗体的胶体金溶液，9000g 离心30min，弃去上清，加入10ml胶体金稀释液重悬胶体金沉淀，充分混匀后喷涂到所述胶体金标记垫上，真空冷冻干燥。
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