CN112305218A - 一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用 - Google Patents
一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112305218A CN112305218A CN202010831512.8A CN202010831512A CN112305218A CN 112305218 A CN112305218 A CN 112305218A CN 202010831512 A CN202010831512 A CN 202010831512A CN 112305218 A CN112305218 A CN 112305218A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- novel coronavirus
- gold
- protein
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 78
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 68
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 55
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 23
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 36
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 13
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 5
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 12
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 abstract description 8
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 abstract description 8
- 108700002099 Coronavirus Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 4
- 239000012567 medical material Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 4
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101710114810 Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M gold monochloride Chemical compound [Cl-].[Au+] FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010028403 hemagglutinin esterase Proteins 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于医药材料领域，涉及一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用。本发明还包括相应的抗体检测试纸条的制备方法，特别是涉及一种用于检测新型冠状病毒抗体检测的胶体金试纸条制备方法。本发明的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，包括以下步骤：金标抗体偶联物制备，采用抗人IgG/M/A的多克隆抗体偶联胶体金；病毒抗体捕获用抗原混合液制备，所述的病毒抗体捕获用抗原包括但不限于新型冠状病毒S蛋白、N蛋白、E蛋白或者新型冠状病毒S蛋白、N蛋白、E蛋白的活性片段；混合抗原，并在硝酸纤维素膜的检测线处固定抗原。本发明能够更有效、更快速、更特异性的检测新冠病毒总抗体，有助于提高新冠病毒抗体的检出率。
Description
技术领域
本发明属于医药材料领域，涉及一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用。具体涉及一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法，涉及一种新的抗体检测试纸条及其制备方法，特别是涉及一种用于检测新型冠状病毒抗体检测的试纸条及其制备方法，和应用。
背景技术
新型冠状病毒属于冠状病毒科。冠状病毒因其在显微镜下能观察到明显的棒状（Spike）粒子突起，形状好似帝王的皇冠而得名。冠状病毒分为α、β、γ以及δ四个冠状病毒属，新型冠状病毒（SARS-CoV-2）与引发2003年严重急性呼吸综合征（Severe AcuteRespiratory Syndromes，SARS）的SARS-CoV病毒，以及引发2012年中东呼吸综合征（MiddleEast Respiratory Syndrome，MERS）的MERS-CoV病毒都属于冠状病毒科β冠状病毒属(Betacoronavirus)。
SARS-CoV-2有四种结构蛋白：刺突糖蛋白（S，Spike protein）、小包膜糖蛋白（E，Envelop Protein）、膜糖蛋白（M, Membrane Protein）、和核衣壳蛋白（N蛋白）。S蛋白在识别并结合宿主细胞表面受体，介导病毒包膜与宿主细胞膜融合的过程中起至关重要作用。E蛋白的功能是组装病毒并充当粒子通道；M蛋白与E蛋白一起参与病毒包膜的形成与出芽过程；N蛋白与病毒RNA形成核糖核蛋白复合物，N蛋白是一种多功能结构蛋白，具有增强病毒基因组转录、破坏各种宿主细胞活动而对宿主细胞产生毒性等不同特征。
截至2020年4月10日，国家药品监督管理局一共审批通过了27个新冠检测试剂，其中18个是核酸检测试剂，9个抗体检测试剂。在获批的这9款抗体检测试剂中有3个产品是化学发光方法，其余6款产品则使用了胶体金标记方法来检测。
大部分新冠病毒抗体检测试剂盒使用胶体金标记新冠抗原，通常是S或N蛋白，在检测T线T1和T2分别包被抗人IgM抗体和抗人IgG抗体以实现对人体新冠病毒抗体IgG和IgM的分别检测。由于正常人的血清中含有大量的抗体，病毒免疫刺激后产生的特异性抗体占比很少，大量非特异性抗体会与胶体金标记的抗人IgG抗体发生竞争性结合，导致假阴性结果的产生。另外，如果IgM和IgG抗体的检测在同一支试纸条上，金颗粒被前端的抗人IgG捕获，会严重削弱IgM的检测信号，导致检测灵敏度下降。
希腊研究者汇集了世界各地的38项研究中涉及的7848个个体的血清学检测数据（新冠肺炎患者3522例，非新冠肺炎4326例），统计结果表明以检测新冠抗体IgG和IgM的灵敏度在0.53-0.66之间。
发明内容
本发明目的在于：提供一种胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，在检测血清中病毒总抗体（IgA、IgM和IgG）的基础上，提高新冠抗体的检出率。
本发明的再一目的在于：提供一种上述检测的胶体金检测试纸。
本发明目的通过下述方案实现：提供一种新冠病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法，包括以下步骤：
金标抗体偶联物制备，采用抗人的多克隆抗体偶联胶体金；
病毒抗体捕获用抗原混合液制备，所述的病毒抗体捕获用抗原包括新型冠状病毒S蛋白、N蛋白或者新型冠状病毒S蛋白、N蛋白的活性片段；
混合抗原，并在硝酸纤维素膜的检测线处固定抗原。
2019 -nCoV（SARS-2）冠状病毒的结构基因组29883bp，基因组中包括了14个ORF框，较大的蛋白分子包括以下蛋白的区域，N：核衣壳蛋白；S：Spike蛋白；M：膜蛋白；HE：血凝素酯酶；E：包膜蛋白。感染细胞的主要是通过在S蛋白与细胞表明的ACE2结合进入细胞。所述的新型冠状病毒S蛋白或者N蛋白与我国卫生健康委员会的报道一致。
较好的，所述的识别新型冠状病毒抗体的抗原可以是新型冠状病毒S蛋白或者N蛋白，或者其活性片段。
较好的，上述方法采用抗人的多克隆抗体实现病毒特异性总抗体的检测。
较好的，采用多种病毒抗原混合液用于血液中总抗体的捕获。
较好的，所述的多克隆抗体是抗人IgG/A/M多克隆抗体。
较好的，上述方法所述的多克隆抗体是山羊抗人的抗体。
较好的，制备两种抗原后，将两者混合。在本发明的一个优选实施例中，两种抗原在抗原混合液中的终浓度为1mg/mL。
所述的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法中，测试结果判定方法如下：.
待测样品与金标抗体反应结果为阳性、但是与新冠病毒抗原反应结果为阴性，则检测样品中不含有新冠病毒抗体；
待测样品与金标抗体反应结果为阳性、并且与新冠病毒抗原反应结果为阳性，则检测样品中含有新冠病毒抗体；
待测样品与金标抗体反应结果阴阳性，则检测失败或者检测试剂失效。
另一方面，本发明还提供了一种金标抗体偶联物，所述的金标抗体偶联物包括抗人的多克隆抗体和胶体金，胶体金与抗人的多克隆抗体偶联。
本发明还包括含有上述的金标抗体偶联物的检测试剂或者试剂盒。所述的试剂盒中，通常含有说明书、阳性参照和/或阴性参照。
本发明本方法检测线可固定多种具有强抗原性的抗原，增加具有强抗体捕获能力的抗原表位数量，提高新冠抗体的灵敏度与检出率。
再一方面，本发明提供了上述金标抗体偶联物的应用。所述的金标抗体偶联物可以用于识别冠状病毒的抗体，辅助检测冠状病毒，或者制备冠状病毒的检测试剂盒。
具体而言，针对新型冠状病毒胶体金抗体检测假阴性和灵敏度低的问题，本发明提供一种病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法，该方法包括以下步骤：
（1）金标抗体偶联物制备：采用抗人IgG/A/M多克隆抗体，如山羊抗人IgG/A/M多克隆抗体，偶联胶体金，以实现针对抗原的特异性总抗体的检测。
（2）病毒抗体捕获用抗原混合液制备：多种病毒强抗原性抗原用10mM PBS缓冲液稀释成抗原混合液，抗原在混合液中的终浓度为1mg/mL，并在硝酸纤维素膜的检测线（T线）处固定。
该方法用胶体金标记抗人IgG/M/A抗体，工艺简单重复性好，其抗体胶体金标记复合物稳定性优于抗原胶体金偶联复合物。与传统的、用胶体金标记抗原检测线分别固定抗人IgG或IgM抗体方法不同，此方法可固定多种抗原以捕获血清中的抗体，而传统方法受限于抗原性质的多样性，胶体金标记条件不一，一般仅标记一种抗原来捕获抗体。
本发明还提供了相应的胶体金检测试纸。所述的检测试纸主体包括上样垫、结合垫、吸收垫、和反应膜；
所述的检测试纸包括金标抗体偶联物，所述的金标抗体偶联物采用抗人的多克隆抗体偶联胶体金；
所述的检测试纸还包括病毒抗体捕获用抗原，所述的病毒抗体捕获用抗原与反应膜固定连接。
较好的，所述的检测试纸还包括背板，用于安置上述上样垫、结合垫、吸收垫、反应膜。
上样垫、结合垫、反应膜、吸收垫依次连接，排列于背板上。上样垫置于结合垫前端，结合垫的后端与反应膜的前端相接，反应膜的后端与吸收垫的前端相接。
本发明还提供了上述检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
上样垫预处理：在含吐温和叠氮钠的缓冲液中浸泡，烘干，备用；
结合垫预处理：在含牛血清白蛋白或吐温、叠氮钠的硼酸缓冲液中浸泡，烘干，备用；
制备新型冠状病毒抗原混合液：将新型冠状病毒S蛋白和/或N蛋白、或者其活性片段，用缓冲液制成抗原混合液；
制备反应膜：将新型冠状病毒抗原混合液和抗山羊IgA、IgG或者IgM抗体分别固定在反应膜上。
较好的，将新型冠状病毒抗原混合液固定在反应膜检测线T区，将抗山羊IgA、抗山羊IgG的抗体或者抗山羊IgM的抗体固定在反应膜对照线C区，用于检测待测样品中新型冠状病毒抗体。
较好的，样品垫处于最前端，用于加入待测样品。结合垫可以是与金标二抗结合的胶体金垫。硝酸纤维膜（微孔膜）上设置有T线和C线。硝酸纤维膜（微孔膜）的T线部位连接有新冠病毒抗体相关的抗原。该抗原能够与待测抗体（被测抗体）识别并结合，金标二抗也能够识别并结合待测抗体（被测抗体）。硝酸纤维膜（微孔膜）的T线部位连接有识别并结合二抗的抗体。
使用时，将待测样品加入样品垫部位，样品流经结合垫达到硝酸纤维素膜部位，其中的新冠病毒抗体与T线部位的抗原结合，同时与金标二抗结合。没有与抗金标二抗结合的金标二抗流经C线部位时，与抗（金标）二抗的抗体识别并结合。未发生反应或者未结合的物质经吸收垫流出。
测试结果判定方法为：
阴性结果：仅在对照线C区处出现阳性反应结果，检测线T区出现阳性反应结果，表明待测样本中不含有新型冠状病毒抗体；
阳性结果：在对照线C区和检测线T区各出现阳性反应结果，表明待测样本中含有新型冠状病毒抗体；
无效结果：当对照线C区未出现阳性反应结果，表明测试失败或试剂失效。
本发明公开了一种用于新冠病毒抗体检测用的胶体金试纸条制备方法，用于更有效更特异性的检测新冠病毒总抗体。采用本发明的制备方法还可适用于其它病毒抗体检测试剂盒的设计和制备。本发明优越性在于：
1.本发明方法测试血清中的总抗体，总抗体检测能比单独检测IgM抗体和IgG抗体提前1-3天诊断出新型冠状病毒的感染，并且阳性结果更为明显，可以更好的作为早期诊断新冠肺炎的血清学诊断指标，测试灵敏度优于单独测试一种抗体的产品。
2.本发明方法可以在T线固定多种免疫原性强的新冠病毒抗原，多样的抗原表位会使该方法的检出率优于仅使用一种病毒抗原捕获抗体的产品；
5-15分钟，快速检测出结果，且结果判读清晰明了。
附图说明
图1为实施例方法所制备的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的检测结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
抗体检测制备材料：兔抗山羊IgG (ab6741)、山羊抗人IgG/IgM/IgA抗体(ab102420)购自abcam公司。重组抗原S蛋白与N蛋白购自北京义翘神州（SinoBiological）。胶体金溶液、PVC背板、玻璃纤维结合垫、上样垫及硝酸纤维素NC膜购自上海捷宁生物科技有限公司。硼酸缓冲盐、牛血清白蛋白BSA购自探索平台。
胶体金的制备
取1980ml双蒸水放入2000ml的烧杯内，置于电炉上加热，快要沸腾时加入20ml 1%的氯化金水溶液，加热至沸，再向其中加入约20ml±1ml 1%的柠檬酸三钠溶液，可看到溶液的颜色由黑色→紫色→深蓝→酒红色，当溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，继续煮沸15分钟，置室温冷却。
偶联物的制备
为了制备AuNP偶联物，将10µg的山羊抗人IgG/M/A抗体蛋白加入到1mL AuNP胶体金溶液(pH 9.0)中。室温孵育30 min后，加入100 µL10%的BSA，对AuNP表面进行封闭。室温孵育15min后, 13000rpm离心45分钟，弃上清，加入1mL 硼酸缓冲液（20mM, pH 9.0, 含1%BSA）重新悬浮。离心和重悬步骤重复2次，最终以100 µL硼酸缓冲液（20mM, pH 9.0, 含1%BSA）重悬待用。
新冠总抗体快速检测试纸的制备
试纸主体由PVC背板、上样垫、结合垫、吸收垫、NC膜等五部分组成。
上样垫预处理：在含0.1MNacl、0.2% Tween-20 (v/v) 和0.1% 叠氮钠(w/v)的PBS缓冲液中浸泡2小时，于37°C烘干2小时备用。
结合垫预处理：在含0.6M Nacl、 2% BSA(w/v)、3%蔗糖(w/v)、0.2% Tween-20 (v/v) 和0.1% 叠氮钠(w/v)的硼酸缓冲液（20mM, pH 9.0）中浸泡2小时，于37°C烘干2小时备用。
将重组新型冠状病毒S蛋白与N蛋白，用10mM PBS缓冲液稀释成抗原混合液，两种抗原在抗原混合液中的终浓度为1mg/mL，新冠抗原混合液和兔抗山羊IgG（1mg/mL）抗体分别在检测线（T线）和质控线（C线）上固定。将金标抗体喷洒到结合垫上。将NC膜、上样垫、结合垫分别组装到PVC背板上进行切割和处理。
标本检测及结果判定
将20 ul全血(或10 ul血清/血浆样本)滴入上样口，加入2-3滴稀释缓冲液(10mM PBS缓冲液)，等待5-15分钟后进行结果判读。
结果判断及数据计算
测试结果判定方法如下：
1、阴性结果：20分钟内仅在对照线C区处出现一条红色条带，检测线T区无色，为正常；
2、阳性结果：20分钟内出现两条红色条带，即对照线C区和检测线T区各出现一条红色条带，表明新冠病毒抗体检测为阳性；
3、无效结果：当对照线C区未出现有色条带，表明测试失败或试剂失效，需进行重复检测。
计算测试灵敏度。灵敏度指的是实际为阳性的样本中，检测判断为阳性的样本比例，其计算公式为：灵敏度(%)= 100x[真阳性/(真阳性+假阴性)]；
结果显示，用上述方法检测新型冠状病毒抗体，16个样品中，检出率或灵敏度为80%（图1）。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
金标抗体偶联物的制备，采用抗人IgG/M/A的多克隆抗体偶联胶体金；
病毒抗体捕获用抗原混合液制备，所述的病毒抗体捕获用抗原包括新型冠状病毒S蛋白、N蛋白、E蛋白或者新型冠状病毒S蛋白、N蛋白、E蛋白的活性片段；
将待测样品分别与金标抗体偶联物和病毒抗体捕获用抗原混合液反应；
待测样品与新冠病毒抗原反应呈阳性，表明待测样本中含有新冠病毒抗体。
2.根据权利要求1所述的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，其特征在于，所述的多克隆抗体是抗人IgG多克隆抗体、抗人IgA多克隆抗体或者抗人IgM多克隆抗体种的一种或者几种，获得此抗体的免疫原为人IgG、IgM、和IgA，因此该类抗体与人IgG、IgM、和IgA都有特异性反应。
所述的多克隆抗体是抗人IgG多克隆抗体、抗人IgA多克隆抗体或者抗人IgM多克隆抗体种的一种或者几种。
3.根据权利要求1所述的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，其特征在于，所述的多克隆抗体是山羊抗人的抗体。
4.根据权利要求1所述的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，其特征在于，所述的抗原在抗原混合液中的终浓度为1mg/mL。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
待测样品与金标抗体反应结果为阳性、但是与新冠病毒抗原反应结果为阴性，则检测样品中不含有新冠病毒抗体；
待测样品与金标抗体反应结果为阳性、并且与新冠病毒抗原反应结果为阳性，则检测样品中含有新冠病毒抗体；
待测样品与金标抗体反应结果阴阳性，则检测失败或者检测试剂失效。
金标抗体与C线二抗反应结果阴阳性，则检测失败或者检测试剂失效。
6.一种金标抗体偶联物，其特征在于，所述的金标抗体偶联物包括抗人的多克隆抗体和胶体金，胶体金与抗人的多克隆抗体偶联。
7.权利要求6所述的金标抗体偶联物的应用，其特征在于，所述的金标抗体偶联物用于制备新型冠状病毒的检测试剂盒或者识别新型冠状病毒的抗体。
8.一种检测试纸，其特征在于，所述的检测试纸主体包括上样垫、结合垫、吸收垫和反应膜；
所述的检测试纸包括金标抗体偶联物，所述的金标抗体偶联物采用抗人的多克隆抗体偶联胶体金；
所述的检测试纸还包括病毒抗体捕获用抗原，所述的病毒抗体捕获用抗原与反应膜固定连接。
9.根据权利要求8所述的检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
上样垫预处理： 在含吐温和叠氮钠的缓冲液中浸泡、烘干，备用；
结合垫预处理： 在含牛血清白蛋白或吐温、叠氮钠的硼酸缓冲液中浸泡、烘干，备用；
制备新型冠状病毒抗原混合液：将新型冠状病毒S蛋白和/或N蛋白、或者其活性片段，用缓冲液制成抗原混合液；
制备反应膜：将新型冠状病毒抗原混合液和抗山羊IgG/G/M抗体分别固定在反应膜上。
10.根据权利要求8所述的检测试纸的应用，其特征在于，将新型冠状病毒抗原混合液固定在反应膜检测线T区，将抗山羊IgG/M的抗体固定在反应膜对照线C区，用于检测待测样品中新型冠状病毒抗体；
测试结果判定方法为：
阴性结果：仅在对照线C区处出现阳性反应结果，检测线T区出现阳性反应结果，表明待测样本中不含有新型冠状病毒抗体；
阳性结果：在对照线C区和检测线T区各出现阳性反应结果，表明待测样本中含有新型冠状病毒抗体；
无效结果：当对照线C区未出现阳性反应结果，表明测试失败或试剂失效。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010831512.8A CN112305218A (zh) | 2020-08-18 | 2020-08-18 | 一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010831512.8A CN112305218A (zh) | 2020-08-18 | 2020-08-18 | 一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112305218A true CN112305218A (zh) | 2021-02-02 |
Family
ID=74483206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010831512.8A Pending CN112305218A (zh) | 2020-08-18 | 2020-08-18 | 一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112305218A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112964874A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-06-15 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 基于间接法的SARS-CoV-2检测试剂盒 |
| CN112964873A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-06-15 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 基于夹心法的SARS-CoV-2检测试剂盒 |
| CN112964872A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-06-15 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | SARS-CoV-2检测试剂盒 |
| CN113624965A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-11-09 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | N蛋白特异性IgG4在甄别新型冠状病毒感染者和疫苗接种者中的应用 |
| CN113702643A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-11-26 | 杭州奥泰生物技术股份有限公司 | 一种联合检测新型冠状病毒中和抗体及核衣壳蛋白抗体的装置 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060188519A1 (en) * | 2004-06-14 | 2006-08-24 | To Cheung | Peptides, antibodies, and methods for the diagnosis of SARS |
| CN101609096A (zh) * | 2009-07-21 | 2009-12-23 | 上海师范大学 | 肺癌标志物检测免疫层析试纸及应用 |
| CN106188248A (zh) * | 2016-07-26 | 2016-12-07 | 兰州雅华生物技术有限公司 | 一种eb病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测eb病毒抗体的快速检测试剂盒 |
| GB201705666D0 (en) * | 2017-04-07 | 2017-05-24 | Price Robert Graham | method of producing polyclonal antibodies, and testing methods and apparatus using such antibodies, application to differentiation of gram positive and gram |
| CN111089962A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-05-01 | 中山生物工程有限公司 | 联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及制备方法 |
| CN111187354A (zh) * | 2020-02-20 | 2020-05-22 | 北京新创生物工程有限公司 | 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)IgM/IgG抗体检测试剂盒 |
| CN111337689A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-06-26 | 山西医科大学 | 一种新型冠状病毒检测试剂盒 |
| CN111378018A (zh) * | 2020-03-28 | 2020-07-07 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用 |
| CN111398603A (zh) * | 2020-03-28 | 2020-07-10 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种用于检测新型冠状病毒抗体的试纸条、制备方法及其应用 |
| CN111426831A (zh) * | 2020-03-24 | 2020-07-17 | 青岛汉唐生物科技有限公司 | 一种联合检测2019新型冠状病毒IgM和IgG抗体的试剂盒及其制备方法 |
| CN111458505A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-07-28 | 浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司 | 一种同时定量检测新冠病毒的IgG和IgM含量的检测纸及其方法 |
| CN111551712A (zh) * | 2020-05-07 | 2020-08-18 | 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 | 一种新型冠状病毒IgM/IgG二合一快速检测的试纸条、试剂盒及其制备方法 |
-
2020
- 2020-08-18 CN CN202010831512.8A patent/CN112305218A/zh active Pending
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060188519A1 (en) * | 2004-06-14 | 2006-08-24 | To Cheung | Peptides, antibodies, and methods for the diagnosis of SARS |
| CN101609096A (zh) * | 2009-07-21 | 2009-12-23 | 上海师范大学 | 肺癌标志物检测免疫层析试纸及应用 |
| CN106188248A (zh) * | 2016-07-26 | 2016-12-07 | 兰州雅华生物技术有限公司 | 一种eb病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测eb病毒抗体的快速检测试剂盒 |
| GB201705666D0 (en) * | 2017-04-07 | 2017-05-24 | Price Robert Graham | method of producing polyclonal antibodies, and testing methods and apparatus using such antibodies, application to differentiation of gram positive and gram |
| CN111187354A (zh) * | 2020-02-20 | 2020-05-22 | 北京新创生物工程有限公司 | 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)IgM/IgG抗体检测试剂盒 |
| CN111426831A (zh) * | 2020-03-24 | 2020-07-17 | 青岛汉唐生物科技有限公司 | 一种联合检测2019新型冠状病毒IgM和IgG抗体的试剂盒及其制备方法 |
| CN111089962A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-05-01 | 中山生物工程有限公司 | 联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及制备方法 |
| CN111378018A (zh) * | 2020-03-28 | 2020-07-07 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用 |
| CN111398603A (zh) * | 2020-03-28 | 2020-07-10 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种用于检测新型冠状病毒抗体的试纸条、制备方法及其应用 |
| CN111337689A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-06-26 | 山西医科大学 | 一种新型冠状病毒检测试剂盒 |
| CN111458505A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-07-28 | 浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司 | 一种同时定量检测新冠病毒的IgG和IgM含量的检测纸及其方法 |
| CN111551712A (zh) * | 2020-05-07 | 2020-08-18 | 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 | 一种新型冠状病毒IgM/IgG二合一快速检测的试纸条、试剂盒及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 姚仁南: "HCV胶体金试纸条在献血者体检中的应", 《东南国防医药》, vol. 11, no. 6, pages 1 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112964874A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-06-15 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 基于间接法的SARS-CoV-2检测试剂盒 |
| CN112964873A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-06-15 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 基于夹心法的SARS-CoV-2检测试剂盒 |
| CN112964872A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-06-15 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | SARS-CoV-2检测试剂盒 |
| CN113702643A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-11-26 | 杭州奥泰生物技术股份有限公司 | 一种联合检测新型冠状病毒中和抗体及核衣壳蛋白抗体的装置 |
| CN113624965A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-11-09 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | N蛋白特异性IgG4在甄别新型冠状病毒感染者和疫苗接种者中的应用 |
| CN113624965B (zh) * | 2021-08-05 | 2024-02-09 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | N蛋白特异性IgG4在甄别新型冠状病毒感染者和疫苗接种者中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112305218A (zh) | 一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用 | |
| US9849171B2 (en) | PRRSV compositions | |
| CN113009153B (zh) | 一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用 | |
| US8114408B2 (en) | Peptide fragments reacting specifically with antibodies against highly pathogenic newcastle disease virus and uses thereof | |
| CN113009154B (zh) | 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用 | |
| WO2022032983A1 (zh) | 一种检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条及其应用 | |
| CN113215107B (zh) | 一种检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫试剂盒及其制备方法 | |
| Hornsleth et al. | Detection of respiratory syncytial virus in nasopharyngeal secretions by ELISA: comparison with fluorescent antibody technique | |
| US20100068727A1 (en) | Rapid immunochromatographic detection by amplification of the colloidal gold signal | |
| WO2023284476A1 (zh) | 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体检测试纸条 | |
| CN113321715A (zh) | 新型冠状病毒抗原及其检测用途 | |
| US20100075441A1 (en) | Rapid immunochromatographic detection by amplification of the colloidal gold signal | |
| CN112904001B (zh) | 新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒及其制备方法与应用 | |
| CN108101968B (zh) | 一种小反刍兽疫疫苗株和野毒株差异性合成肽及其应用 | |
| CN106188248A (zh) | 一种eb病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测eb病毒抗体的快速检测试剂盒 | |
| CN112904021A (zh) | 一种双线检测新冠病毒疫苗接种后抗体的试纸条 | |
| Sampaio et al. | Measles, rubella, mumps and Toxoplasma gondii antibodies in saliva of vaccinated students of schools and universities in São Paulo City, Brazil | |
| CN102533795B (zh) | 一种重组人巨细胞病毒蛋白及其应用 | |
| CN101781360B (zh) | 一种重组风疹病毒蛋白及应用 | |
| Kao et al. | Monoclonal antibodies for the rapid diagnosis of respiratory syncytial virus infection by immunofluorescence | |
| JP2022027498A (ja) | さまざまなウイルスのための多重迅速検出キットおよび方法 | |
| CN108761069A (zh) | 一种应用表位抗体建立的鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法 | |
| CN105277714B (zh) | 基于磁性分离和量子点标记的人副流感病毒快速检测方法和试剂盒 | |
| CN114264821B (zh) | 检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其制备方法与应用 | |
| US20050221299A1 (en) | Peptide from the glycoprotein B from human herpesvirus 7 for use in a serological ELISA test |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |