CN111349140A - 一种高纯度重楼皂苷ⅶ的制备方法及质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法及质量控制方法，以百合科植物云南重楼、华重楼或多叶重楼的干燥果壳为原料，用乙醇溶液回流提取，建立重楼皂苷Ⅶ化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立重楼皂苷Ⅶ化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。本发明工艺设计合理，工艺简单，分离速度快，生产周期短，所得产品纯度高，含量达98%以上，质量可控，适合工业化生产，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及化合物制备技术领域，具体是一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法及质量控制方法。
背景技术
化学对照品又称标准品，是中药质量标准研究、质量检测和质量控制的实物对照，中药化学对照品的研究，是中药标准化研究的一个非常重要的部分，对产品的质量评价，特别是在药品生产的质量控制中，中药化学对照品起着极其重大的作用，是中药质量控制的基础与核心。
重楼皂苷Ⅶ是一种皂苷类化学成分，是云南重楼、华重楼、多叶重楼、七叶一枝花等植物的活性成分之一，也是许多植物和药品标准质量控制的指标性成分。目前虽已有相应的国家药品标准物质，但国内外对重楼皂苷Ⅶ中药化学对照品的***研究未见报道，参照中药化学对照品（供含量测定用）的技术要求，对重楼皂苷Ⅶ化学对照品进行研究，建立重楼皂苷Ⅶ化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立重楼皂苷Ⅶ化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。
重楼皂苷Ⅶ是从百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis (Franch.)Hand.-Mazz.、华重楼Paris polyphylla Smith var. chinensis(Franch.) Hara、多叶重楼Paris polyphylla Smith等中分离得到的活性物质，从公开文献所知，重楼皂苷Ⅶ的提取分离过程和含量测定方法，主要有以下几种方法：
1.【题名】北重楼的化学成分研究（黄贤校,高文远,满淑丽,闫娟娟,王彦丽.北重楼的化学成分研究[J].中国中药杂志,2009,34(14):1812-1815）：取北重楼的全草(2.1 kg)，分别用95%和60%的乙醇加热各回流提取4次，每次3 h，合并滤液，减压回收乙醇得浸膏，加入适量水混悬后，分别用石油醚、醋酸乙酯和水饱和正丁醇进行萃取。正丁醇部分过硅胶柱粗分离，用三氯甲烷-甲醇***(100∶0，95∶5，9∶1，8∶2∶0.2，7∶3∶0.3，6∶4∶0.4，甲醇)梯度洗脱，得到10个组分，其中对第7个组分再进行PTLC得到重楼皂苷Ⅶ。
2.【题名】长药隔重楼中甾体皂苷成分的分离与结构鉴定（刘显波,张浩,雍正平,薛丹.长药隔重楼中甾体皂苷成分的分离与结构鉴定[J].华西药学杂志,2010,25(05):508-511）：称取5.3 kg长药隔重楼干燥根茎粗粉，用70%乙醇于室温下反复渗漉提取(共20倍药材量)，提取液合并减压浓缩至无醇味，加入适量水混悬分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取后，剩余水层溶液中加入大量水稀释，过大孔树脂D101，用30%、50%、70%、95%乙醇依次洗脱，将洗脱液分别回收至干浸膏。取8 g70%洗脱部位进行硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇***(6∶1、5∶1、4∶1、3∶1)梯度洗脱，得到5个组分(Fr.7～11)。Fr.9经预装硅胶中压柱层析处理，氯仿-甲醇系(5∶1、4∶1、3∶1)梯度洗脱，然后经Sephadex LH-20纯化得到重楼皂苷Ⅶ 73mg。
3.【题名】黑籽重楼化学成分及其抗肿瘤活性研究（景松松,王颖,李雪娇,李霞,黄璐琦,肖培根,高文远.黑籽重楼化学成分及其抗肿瘤活性研究[J].中草药,2017,48(06):1093-1098）：黑籽重楼根状茎3.2 kg，粉碎，依次用90%乙醇和60%乙醇加热回流，各提取3次，每次2 h。合并提取液，减压回收乙醇得浸膏。然后将浸膏混悬于水中，依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂得到石油醚萃取部分6.8 g，醋酸乙酯萃取部分38.6 g，正丁醇萃取部分74.1 g。醋酸乙酯萃取部分用硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯（10∶0→0∶10）进行梯度洗脱，得到6个组分（Fr. A～F），Fr.C依次通过硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇10∶0→5∶5），凝胶 Sephadex LH-20 柱色谱（二氯甲烷-甲醇 1∶1），制备液相（70%甲醇）纯化，得到重楼皂苷Ⅶ（9 mg）。
4.【题名】金线重楼的化学成分（刘海,黄芸,张婷,王强,陈筱清.金线重楼的化学成分[J].中国药科大学学报,2006(05):409-412）：金线重楼干燥根茎约10 kg，粉碎，用5倍量工业乙醇热回流提取3次(每次3 h)，提取液合并，减压浓缩至无醇味，加水溶解。水溶液上大孔树脂D101柱，收集40 %～80 %乙醇洗脱液，回收至干得浸膏约50 g。将所得浸膏经反复硅胶柱层析(氯仿-甲醇梯度洗脱)，得部位A和B，再将部位A和B经Sephadex LH-20(氯仿-甲醇)，ODS(甲醇-水)反复分离纯化，得到重楼皂苷Ⅶ（203 mg）。
5.【题名】狭叶重楼的主要甾体皂苷类化学成分的分离及鉴定（尹鸿翔,薛丹,白楠,陈雏,陈阳,张浩.狭叶重楼的主要甾体皂苷类化学成分的分离及鉴定[J].四川大学学报(医学版),2008(03):485-488）：狭叶重楼干燥根茎约15 kg，粉碎，用70%乙醇室温反复渗漉提取(共20倍药材量)，提取液合并，减压浓缩至无醇味，加水分散。水液用石油醚脱脂后，乙酸乙酯，正丁醇依次萃取。正丁醇萃取部位上大孔树脂HPD100柱，收集40%～80%乙醇洗脱液，回收至干得浸膏约80 g。将所得浸膏经反复硅胶柱层析(氯仿-甲醇梯度洗脱)并结合葡聚糖凝胶Sephadex LH-20〔氯仿∶甲醇 (V /V ) 1∶1等度洗脱〕纯化，得到重楼皂苷Ⅶ(435mg)。
6.【题名】云南重楼的化学成分（张玉波,吴霞,李药兰,王国才.云南重楼的化学成分[J].暨南大学学报(自然科学与医学版),2014,35(01):66-72）：云南重楼的干燥根茎10.0 kg，粉碎后用40 L体积分数70%乙醇渗漉提取，合并提取液经减压浓缩得浸膏1.5 kg。用水分散浸膏，上清液过HP-20型大孔吸附树脂，依次用水，体积分数分别为30%、60%和90%乙醇梯度洗脱。体积分数30%乙醇洗脱部位减压浓缩得浸膏141 g，所得浸膏经硅胶柱，以V氯仿∶V甲醇=97∶3～1∶1梯度洗脱，所得流分经TLC分析合并，得到7个馏分(Fr．1-7)．Fr．4依次过反相ODS柱、Sephadex LH-20和制备 型HPLC，分离纯化得到重楼皂苷Ⅶ(18.1 mg)。
7.中国专利：重楼皂苷II和重楼皂苷VII的制备方法，申请号：201710587402.X，申请人：中国科学院昆明植物研究所，摘要：将滇重楼果皮粉碎后，用水或1％～99％乙醇超声提取，提取液经过浓缩后得粗提物。粗提物加水制成混悬液，依次用乙酸乙酯、正丁醇分别萃取，萃取液浓缩后，分别得到乙酸乙酯萃取部分和正丁醇萃取部分，正丁醇萃取部分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，经甲醇洗脱后得到富含重楼皂苷II和VII的部位；或粗提物，经D101大孔树脂层析，分别用水洗脱、80％乙醇洗脱、95％乙醇洗脱和丙酮洗脱，其中，80％乙醇洗脱部分浓缩后，得到洗脱物，取80％乙醇洗脱部物，加100mL水制成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位，正丁醇萃取部位即为富含重楼皂苷II和VII的部位。富含重楼皂苷II和VII的部位，经制备型HPLC制备得到化合物重楼皂苷VII和重楼皂苷II。
8.中国专利：一种重楼皂苷系列的制备工艺，申请号：201710982092.1，申请人：上海源叶生物科技有限公司，摘要：将重楼药材粉碎，用乙醇溶液浸泡，进行加热得到提取液；提取液浓缩至小体积，采用大孔树脂静态吸附，然后装柱，用乙醇溶液洗脱除去杂质，收集总重楼皂苷部分；将得到的总重楼皂苷用甲醇溶解，用反相C18中压柱制备，用乙腈溶液洗脱流动相，收集重楼皂苷VI、VII的混合部分，将重楼皂苷VI、VII混合部分用正相硅胶分离，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液洗脱，得到纯化的重楼皂苷VI、VII。
9.【题名】HPLC 法测定重楼块根中4种重楼皂苷含量研究（韩平,阮成江,王海明,杜维,丁健,张莞晨.HPLC法测定重楼块根中4种重楼皂苷含量研究[J].大连民族大学学报,2018,20(01):17-20）：建立HPLC测定重楼块根中重楼皂苷Ⅶ等4种重楼皂苷含量的方法。
10.【题名】长柱重楼中主要甾体皂苷类成分的定性定量分析（黄圆圆,康利平,彭华胜,刘大会,郝庆秀,赵加六,陈敏,黄璐琦.长柱重楼中主要甾体皂苷类成分的定性定量分析[J].中国中药杂志,2017,42(18):3452-3460）：建立HPLC-UV同时测定77 株不同来源的长柱重楼中重楼皂苷Ⅶ等8种重楼皂苷的含量。
11.【题名】UPLC法同时测定云南重楼栽培品中11种皂苷的含量（昝珂,高宇明,崔淦,刘杰,过立农,郑健,马双成.UPLC法同时测定云南重楼栽培品中11种皂苷的含量[J].药物分析杂志,2017,37(09):1572-1577）：建立超高效液相色谱法同时测定云南重楼栽培品中重楼皂苷Ⅶ等11种甾体皂苷的含量。
12.【题名】不同产地丫蕊花不同部位中3种皂苷成分含量测定及差异分析（陈帅,张美,袁崇均,罗森,王笳.不同产地丫蕊花不同部位中3种皂苷成分含量测定及差异分析[J].中国药房,2020,31(03):325-329）：建立高效液相色谱法测定建立测定丫蕊花中重楼皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量，比较不同产地丫蕊花不同部位中这3种皂苷成分的含量差异。
13.【题名】正交试验优选白花延龄草中重楼皂苷Ⅶ提取工艺研究（李小沛,张亚玉,赵立春,张春阁,刘继永.正交试验优选白花延龄草中重楼皂苷Ⅶ提取工艺研究[J].特产研究,2019,41(02):1-5）：采用正交试验法考察料液比、提取时间、提取温度3个因素对白花延龄草根茎中重楼皂苷Ⅶ含量的影响。采用HPLC法测定白花延龄草中重楼皂苷Ⅶ的含量。白花延龄草根茎中重楼皂苷Ⅶ的最佳提取工艺条件为料液比1∶9、提取时间4 h、提取温度90 ℃。在此条件下，测得白花延龄草根茎中重楼皂苷Ⅶ的含量为0.931 mg/g。
上述方法从不同角度论述了重楼皂苷Ⅶ的提取分离方法。分离纯度较高，但纯度大多数未达到中药化学对照品的要求，即纯度大于98%，无法满足高纯度重楼皂苷Ⅶ化学对照品的需要；重楼皂苷Ⅶ的测定，及对重楼皂苷Ⅶ化学对照品的质量控制与评价的研究，未见相关报导。
今后生产的各种产品，无论是在国内或是进入国际市场，都需要靠高水平的质量标准和高水平的分析测试技术来获得发展和提高，否则将失去市场，产品的质量标准和检测方法变得愈来愈重要，“安全、有效和质量可控”的用药标准已成为国际共识，药品生产应围绕着这一中心展开，其核心为质量标准控制水平，而化学对照品则起关键的作用。但目前大部分中药药材及其制剂，因化学成分不明或无化学对照品，无法阐明其作用的化学物质基础，也无法进行质量控制，而不能被现代文明社会所接受，也成为中草药和天然药物难以进入国际药品市场的制约关键，技术壁垒给发展中药产业带来了困难，因此，进行中草药化学成分的研究及质量标准规范化研究是中药现代化发展的必经之路，对阐明中草药作用的物质基础以及中草药制剂的生产加工工艺的制定、伪劣产品的鉴别等等具有重要的意义。毫无疑问，对重楼皂苷Ⅶ进行质量标准研究，建立规范化的分析测试方法，制定高技术水平的控制重楼皂苷Ⅶ质量的检测指标和分析方法，使之科学化、规范化，增强国际竞争力，为中药进入国际市场创造条件，具有重大的实际意义和学术价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法及质量控制方法，解决高纯度重楼皂苷Ⅶ化学对照品的问题。
重楼皂苷Ⅶ作为植物、药材及其产品的化学对照品，是质量控制的技术关键，众多企业、科研和检验部门都需要高纯度的对照品，其市场需求很大，由于重楼皂苷Ⅶ在药材中的含量低，提取分离技术要求很高、难度很大。本发明进行重楼皂苷Ⅶ中药化学标准品制备及其质量控制技术研究，解决高纯度重楼皂苷Ⅶ化学对照品的问题，具有重大的实际意义和学术价值。
本发明通过以下技术方案实现：
一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）取云南重楼、华重楼或多叶重楼的干燥果壳，粉碎，用乙醇回流提取，提取温度75～85 ℃，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1～1.5倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇***梯度洗脱，收集含重楼皂苷Ⅶ的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的重楼皂苷Ⅶ粗结晶；
5）将重楼皂苷Ⅶ粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集重楼皂苷Ⅶ组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为90～98%的重楼皂苷Ⅶ合并，并将保留时间相同且纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ合并，分别进行减压浓缩，即可得到纯度为90～98%及纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ。
本发明的工艺流程如图1所示。
具体的，所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的5～20倍，乙醇浓度为70～90%，回流提取次数为3～8次，每次1～3 h。
步骤3）所述的梯度洗脱条件为：0～A分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为100:1～20:1；A～B分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为3:1～5:1；所述A为90～160，所述B为120～200。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂***：***一，氯仿-甲醇-甲酸体积比为3:1:0.1，***二，正丁醇-乙酸-水体积比为4:1:5（上层溶液），***三，氯仿-甲醇-水体积比为65:35:10（下层溶液）；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距为15 cm；
定位：喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见橙红色的单一斑点，三种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤 5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，两者体积配比为55～75：25～45，流速为5～10 mL/min，检测波长为203～210 nm，柱温为25～35 ℃。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：
色谱柱：C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速：0.8～1.2 ml/min；进样量：10～20 μl；面积归一化法定量；***条件为以下三个条件的其中之一：
条件一：流动相为乙腈-水，两者体积配比为35～40:60～65，检测波长203 nm；
条件二：流动相为甲醇-水，两者体积配比为75～80:20～25，检测波长210 nm；
条件三：流动为甲醇-0.1%磷酸水溶液，两者体积配比为60～80:20～40，检测波长203～205nm。
优选的，所述的***条件一的流动相中，乙腈与水的体积配比为38:62；所述的***条件二的流动相中，甲醇与水的体积配比为75:25；所述的***条件三的流动相中，甲醇与0.1%磷酸水溶液的体积配比为75:25。
按照本发明的方法制备所得高纯度重楼皂苷Ⅶ采用高效液相色谱法检测纯度大于98％。
本发明所述的高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，也适用于从七叶一枝花的其他变种中提取高纯度重楼皂苷Ⅶ。七叶一枝花，学名：Paris polyphylla，为百合科重楼属的植物。其主要变种还包括：短梗重楼（Paris polyphylla Sm. var. appendiculata Hara）、缺瓣重楼（Paris polyphylla Sm. var. apetala Hand. -Mzt.）、宽叶重楼（Paris polyphyllaSm. var. latifolia Wang et Chang, var. nov）、狭叶重楼（Paris polyphylla Sm.var. stenophylla Franch.）、长药隔重楼（Paris polyphylla Sm. var. thibetica(Franch.) Hara）、宽瓣重楼（Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis (Franch.)Hand.）等。
本发明是从百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.、华重楼Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.)Hara或多叶重楼Paris polyphylla Smith的果壳中经提取、分离、精制、纯化而制得的重楼皂苷Ⅶ，其化学名、分子式、结构式如下：
中文名：重楼皂苷Ⅶ；
化学名：偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷（pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-O-β-D-glucopyranoside）
英文名：Chonglou Saponin Ⅶ；
分子式：C51H82O21；
结构式如下：
本发明对于产品重楼皂苷Ⅶ的质量控制方法如下：
一、含量与纯度测定：
精密称取于105 ℃干燥至恒重的对照品适量，加甲醇溶液制成每1 ml含1 mg的溶液，在测定条件下，进样20 μl（约相当于20 μg），注入液相色谱仪，用优选的3个流动相溶剂***分别记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2.5倍以上，用面积归一化法和主成分自身对照发计算含量，结果***测定对照品含量均在98%以上。杂质检查，分别在不同***记录的色谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于2.0%。结果见表1。采用自身对照法测得重楼皂苷Ⅶ候选化学对照品色谱纯度为98.69（n=3），杂质总含量均在2.0 %以下。
表1 HPLC（***①、***②、***③）归一化法定量分析结果
二、峰纯度检测：
取对照品适量，按流动相***，在高效液相色谱仪上，用二极管阵列DAD检测器进行峰纯度检查，重楼皂苷Ⅶ的HPLC色谱峰>98%，其色谱图为单一峰，三维图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。结果见图3、图4、图5。
本发明对HPLC色谱分析方法学考察如下：
色谱条件：采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，甲醇-0.1%磷酸水溶液（75:25）为流动相，检测波长203 nm，进样量20 μl；流量1 mL/min。
一、线性关系考察
取重楼皂苷Ⅶ候选化学对照品，于105 ℃干燥至恒重，取约10 mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为998.40 μg/mL的对照品储备液。分别吸取对照品储备液1 ml、1.2 ml、1.4 ml、1.6 ml、1.8 ml、2.0 ml置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至，摇匀，按上述色谱条件注入液相色谱仪，测定峰面积，并以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算得到回归方程为Y=3198.0X+64.34，R=0.9999。重楼皂苷Ⅶ候选化学对照品在进样量为9.98～19.97 μg范围内具有较好的线性关系。
二、重现性、稳定性与精密度考察
取同一供试品6份，分别按上述方法及色谱***测定，记录重楼皂苷Ⅶ色谱图及峰面积积分值，计算含量，结果平均含量99.83%，RSD为0.21%，说明该方法重现性良好。
取同一供试品溶液，在室温下放置2，4，6，8，10，12，24 h，依法进样测定，记录重楼皂苷Ⅶ色谱图及峰面积积分值，结果显示RSD为0.082%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。
取同一供试品溶液，连续进样6次，记录重楼皂苷Ⅶ色谱图及峰面积，结果RSD为0.54%，说明仪器精密度良好。
三、方法的耐用性考察
采用了3根不同厂家和品牌的色谱柱，分别进行保留时间、理论板数、分离度和杂质分离效果测定，在上述分析条件下，重楼皂苷Ⅶ峰与其他杂质峰达到基线分离，分离度大于1.5，按重楼皂苷Ⅶ峰计算理论板数不低于4000时，可满足测定要求，见表2。
表2 保留时间、理论板数及分离度
本发明的有益效果：
1、本发明制备获得的化合物经光谱及波谱分析确认为重楼皂苷Ⅶ。本发明先将百合科植物云南重楼、华重楼或多叶重楼的干燥果壳粉碎，用乙醇溶液回流提取，合并提取液，浓缩，浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物。正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱***梯度洗脱，用薄层色谱（TLC）检测，收集含有重楼皂苷Ⅶ的洗脱液，合并，减压浓缩，得到重楼皂苷Ⅶ粗结晶；再用高效制备液相色谱（PHPLC）法分离纯化，对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱（HPLC）检测，分别得到纯度在90%～98%之间的重楼皂苷Ⅶ和纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ组分。
2、本发明设计合理，工艺简单，利用醇水溶剂提取，经过一次硅胶柱色谱后即可得到纯度较高的重楼皂苷Ⅶ，最后经高效制备液相色谱法制备出纯度达到98%以上的重楼皂苷Ⅶ化学对照品，方法简便易行。
3、本发明通过对重楼皂苷Ⅶ化学对照品进行研究，建立重楼皂苷Ⅶ化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立重楼皂苷Ⅶ化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。本发明研究结果可为重楼皂苷Ⅶ化学对照品提供更完整的基础化学依据，掌握其化学信息和分析测试技术，有利于相关产品的进一步开发利用，而且对于开发我国特有产物，开发具有高技术、高附加值的产品，提高市场竞争能力，将会产生潜在而不可估量的社会效益与经济效益。
4、本发明采用薄层色谱和高效液相色谱进行纯度检查，含量测定及质量控制，确保产品的质量。本发明工艺设计合理，工艺简单，分离速度快，生产周期短，所得产品纯度高，质量可控，适合工业化生产，具有很好的应用前景。
5、本发明从云南重楼、华重楼或多叶重楼果壳中制备出纯度符合化学对照品要求，含量在98%以上的重楼皂苷Ⅶ，解决了重楼皂苷Ⅶ化学对照品的供应问题，为重楼及其他含有重楼皂苷Ⅶ成分的药品的质量控制提供了提供科学基础和保证。
附图说明
图1是高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备工艺流程图；
图2-1、2-2、2-3分别是重楼皂苷Ⅶ三种展开***薄层色谱图；其中，图2-1中展开剂为氯仿-甲醇-甲酸体积比3:1:0.1，图2-2中展开剂为正丁醇-乙酸-水体积比4:1:5，图2-3中展开剂为氯仿-甲醇-水体积比65:35:10；
图3重楼皂苷Ⅶ高效液相色谱图；
图4是重楼皂苷Ⅶ高效液相色谱3维光谱图；
图5是重楼皂苷Ⅶ 5点光谱图；
图6重楼皂苷Ⅶ红外光谱图；
图7重楼皂苷Ⅶ紫外吸收光谱图；
图8是重楼皂苷Ⅶ1H-NMR核磁共振光谱图；
图9是重楼皂苷Ⅶ13C-NMR核磁共振光谱图；
图10-1、10-2是重楼皂苷Ⅶ质谱图。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的甲醇量的百分数是体积百分数，v/v表示溶液的体积比。
实施例1
一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）取云南重楼的干燥果壳5 kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取温度75℃，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.2倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇***梯度洗脱，收集含重楼皂苷Ⅶ的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的重楼皂苷Ⅶ粗结晶；
5）将重楼皂苷Ⅶ粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集重楼皂苷Ⅶ组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为90～98%的重楼皂苷Ⅶ合并，并将保留时间相同且纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ合并，分别进行减压浓缩，得到纯度为95%及纯度99.6%的重楼皂苷Ⅶ。
所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的12倍，乙醇浓度为85%，回流提取次数为5次，每次1.5 h。
步骤3）所述的梯度洗脱条件为：0～90分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为100:1~20:1；90～120分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为5:1。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂***：***一，氯仿-甲醇-甲酸体积比为3:1:0.1，***二，正丁醇-乙酸-水体积比为4:1:5（上层溶液），***三，氯仿-甲醇-水体积比为65:35:10（下层溶液）；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距为15 cm；
定位：喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见橙红色的单一斑点，三种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤 5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，两者体积配比为75:25，流速为5mL/min，检测波长为203 nm，柱温为25 ℃。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：
色谱柱：C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；面积归一化法定量；***条件：流动为甲醇-0.1%磷酸水溶液，两者体积配比为80:20，检测波长203 nm；
面积归一化法定量，主成分（重楼皂苷Ⅶ）峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
实施例2
一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）取华重楼的干燥果壳3 kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取温度78℃，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.3倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇***梯度洗脱，收集含重楼皂苷Ⅶ的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的重楼皂苷Ⅶ粗结晶；
5）将重楼皂苷Ⅶ粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集重楼皂苷Ⅶ组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的重楼皂苷Ⅶ合并，并将保留时间相同且纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ合并，分别进行减压浓缩，得到纯度为96%及纯度98.5%的重楼皂苷Ⅶ。
所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的20倍，乙醇浓度为70%，回流提取次数为8次，每次2 h。
步骤3）所述的梯度洗脱条件为：0～120分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为100:1~20:1；120～160分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为4:1。
步骤 4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂***：***一，氯仿-甲醇-甲酸体积比为3:1:0.1，***二，正丁醇-乙酸-水体积比为4:1:5（上层溶液），***三，氯仿-甲醇-水体积比为65:35:10（下层溶液）；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距为15 cm；
定位：喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见橙红色的单一斑点，三种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，两者体积配比为70:30，流速为7 mL/min，检测波长为205 nm，柱温为30℃。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：
色谱柱：C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速：1.1 ml/min；进样量：15 μl；面积归一化法定量；***条件：流动相为乙腈-水，两者体积配比为38:62，检测波长203 nm；
面积归一化法定量，主成分（重楼皂苷Ⅶ）峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
实施例3
一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）取云南重楼的干燥果壳5 kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取温度80 ℃，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇***梯度洗脱，收集含重楼皂苷Ⅶ的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的重楼皂苷Ⅶ粗结晶；
5）将重楼皂苷Ⅶ粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集重楼皂苷Ⅶ组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的重楼皂苷Ⅶ合并，并将保留时间相同且纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ合并，分别进行减压浓缩，得到纯度为97%及纯度99.8%的重楼皂苷Ⅶ。
所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的10倍，乙醇浓度为75%，回流提取次数为3次，每次3 h。
步骤3）所述的梯度洗脱条件为：0～100分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为100:1~20:1；100～140分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为5:1。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂***：***一，氯仿-甲醇-甲酸体积比为3:1:0.1，***二，正丁醇-乙酸-水体积比为4:1:5（上层溶液），***三，氯仿-甲醇-水体积比为65:35:10（下层溶液）；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距为15 cm；
定位：喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见橙红色的单一斑点，三种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，两者体积配比为60:40，流速为8 mL/min，检测波长为203 nm，柱温为25℃。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：
色谱柱：C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速：1.2 ml/min；进样量：15 μl；面积归一化法定量；***条件为：流动相为甲醇-水，两者体积配比为75:25，检测波长210 nm；
面积归一化法定量，主成分（重楼皂苷Ⅶ）峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
实施例4
一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）取华重楼的干燥果壳6 kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取温度78℃，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.1倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇***梯度洗脱，收集含重楼皂苷Ⅶ的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的重楼皂苷Ⅶ粗结晶；
5）将重楼皂苷Ⅶ粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集重楼皂苷Ⅶ组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的重楼皂苷Ⅶ合并，并将保留时间相同且纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ合并，分别进行减压浓缩，即可得到纯度为94%及纯度98.2%的重楼皂苷Ⅶ。
所述步骤 1）中乙醇的加入量为药材重量的15倍，乙醇浓度为80%，回流提取次数为6次，每次2h。
步骤3）所述的梯度洗脱条件为：0～160分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为100:1~20:1；160～200分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为3:1。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂***：***一，氯仿-甲醇-甲酸体积比为3:1:0.1，***二，正丁醇-乙酸-水体积比为4:1:5（上层溶液），***三，氯仿-甲醇-水体积比为65:35:10（下层溶液）；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距为15 cm；
定位：喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见橙红色的单一斑点，三种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，两者体积配比为55:45，流速为10 mL/min，检测波长为210 nm，柱温为30 ℃。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：
色谱柱：C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速：0.8 ml/min；进样量：20 μl；面积归一化法定量；***条件为：流动相为甲醇-水，两者体积配比为80:20，检测波长210 nm；
面积归一化法定量，主成分（重楼皂苷Ⅶ）峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
实施例5
一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）取多叶重楼的干燥果壳5 kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取温度77 ℃，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.2倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇***梯度洗脱，收集含重楼皂苷Ⅶ的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的重楼皂苷Ⅶ粗结晶；
5）将重楼皂苷Ⅶ粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集重楼皂苷Ⅶ组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的重楼皂苷Ⅶ合并，并将保留时间相同且纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ合并，分别进行减压浓缩，得到纯度为95%及纯度98.3%的重楼皂苷Ⅶ。
所述步骤 1）中乙醇的加入量为药材重量的8倍，乙醇浓度为80%，回流提取次数为4次，每次2.5 h。
步骤3）所述的梯度洗脱条件为：0～110分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为100:1~20:1；110～140分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为5:1。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂***：***一，氯仿-甲醇-甲酸体积比为3:1:0.1，***二，正丁醇-乙酸-水体积比为4:1:5（上层溶液），***三，氯仿-甲醇-水体积比为65:35:10（下层溶液）；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距为15 cm；
定位：喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见橙红色的单一斑点，三种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，两者体积配比为75:25，流速为5 mL/min，检测波长为205 nm，柱温为35 ℃。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：
色谱柱：C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速：1.1 ml/min；进样量：10μl；面积归一化法定量；***条件为：流动为甲醇-0.1%磷酸水溶液，两者体积配比为75:25，检测波长203nm；
面积归一化法定量，主成分（重楼皂苷Ⅶ）峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
实施例6
一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）取多叶重楼的干燥果壳2 kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取温度76℃，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.5倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇***梯度洗脱，收集含重楼皂苷Ⅶ的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的重楼皂苷Ⅶ粗结晶；
5）将重楼皂苷Ⅶ粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集重楼皂苷Ⅶ组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的重楼皂苷Ⅶ合并，并将保留时间相同且纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ合并，分别进行减压浓缩，得到纯度为96%及纯度99.1%的重楼皂苷Ⅶ。
所述步骤 1）中乙醇的加入量为药材重量的18倍，乙醇浓度为75%，回流提取次数为7次，每次2h。
步骤3）所述的梯度洗脱条件为：0～150分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为100:1~20:1；150～180分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为4:1。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂***：***一，氯仿-甲醇-甲酸体积比为3:1:0.1，***二，正丁醇-乙酸-水体积比为4:1:5（上层溶液），***三，氯仿-甲醇-水体积比为65:35:10（下层溶液）；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距为15 cm；
定位：喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见橙红色的单一斑点，三种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，两者体积配比为70:30，流速为8mL/min，检测波长为210 nm，柱温为30 ℃。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：
色谱柱：C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速：1.2 ml/min；进样量：20 μl；面积归一化法定量；***条件为：流动为甲醇-0.1%磷酸水溶液，两者体积配比为60:40，检测波长205 nm；
面积归一化法定量，主成分（重楼皂苷Ⅶ）峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
实施例7
一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1) 取短梗重楼的干燥果壳5 kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取温度78 ℃，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.5倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇***梯度洗脱，收集含重楼皂苷Ⅶ的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的重楼皂苷Ⅶ粗结晶；
5）将重楼皂苷Ⅶ粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集重楼皂苷Ⅶ组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的重楼皂苷Ⅶ合并，并将保留时间相同且纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ合并，分别进行减压浓缩，得到纯度为92%及纯度98.1%的重楼皂苷Ⅶ。
所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的12倍，乙醇浓度为85%，回流提取次数为5次，每次1.5h。
步骤3）所述的梯度洗脱条件为：0～160分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为100:1~20:1；160～200分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为3:1。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂***：***一，氯仿-甲醇-甲酸体积比为3:1:0.1，***二，正丁醇-乙酸-水体积比为4:1:5（上层溶液），***三，氯仿-甲醇-水体积比为65:35:10（下层溶液）；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距为15 cm；
定位：喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见橙红色的单一斑点，三种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，两者体积配比为65：35，流速为8 mL/min，检测波长为205 nm，柱温为30 ℃。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：
色谱柱：C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；面积归一化法定量；***条件为：流动为甲醇-0.1%磷酸水溶液，两者体积配比为75:25，检测波长203 nm；
面积归一化法定量，主成分（重楼皂苷Ⅶ）峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
对实施例1-7制备得到的产品抽样进行结构确证如下：
理化常数：重楼皂苷Ⅶ为色粉末，熔点260~262 ℃，易溶于甲醇、氯仿。
波谱数据鉴定如下：
1、红外吸收光谱（IR）
仪器：Bruker TENSOR 27FTIR；仪器校正和检定聚苯乙烯薄膜的IR谱，符合中国药典2015年版的规定；
样品制备方法：取样品适量，溴化钾压片；
测定数据如表3，测得的红外吸收光谱图见图6。
表3 重楼皂苷Ⅶ红外光谱数据
解析：
3423 cm-1：-OH的伸缩振动；1130、1053、979、892 cm-1：25D-螺甾烷的边链。
2、紫外吸收光谱（UV）
仪器：日本岛津UV-2550型紫外光谱仪；
仪器校正和检定，符合中国药典2015年版的规定；
溶剂：分析纯甲醇；
供试液：取样品适量，加甲醇配制成每1 mL含50 μg的溶液；
测定数据如表4，测得的紫外吸收光谱图见图7。
表4 重楼皂苷Ⅶ UV数据
| 溶剂 | 最大吸收 |
| 甲醇 | 末端吸收 |
解析：
紫外光谱为末端吸收，从紫外光谱图得知，结构中不含有不饱和共轭体系。
3、核磁共振谱
（1）1H-NMR 核磁共振谱
仪器：德国BRUKER Dre-500；
溶剂：Pyridine-d 5，内标TMS；
测定数据如表5，测得的1H-NMR 核磁共振波谱图见图8。
表5 1H-NMR 核磁共振谱数据表
（2）13C-NMR 核磁共振谱
仪器：德国 BRUKER 125 MHz；
溶剂：Pyridine-d 5，内标TMS；
测定数据如表6，测得的13C-NMR核磁共振波谱图见图9。
表6 13C-NMR 核磁共振谱数据
| 位置 | 化学位移（ppm） | 文献值 |
| 1 | 37.9 | 37.9 |
| 2 | 30.5 | 30.5 |
| 3 | 78.1 | 78.1 |
| 4 | 39.3 | 39.3 |
| 5 | 141.1 | 141.1 |
| 6 | 122.2 | 122.2 |
| 7 | 32.8 | 32.8 |
| 8 | 30.8 | 30.8 |
| 9 | 50.6 | 50.6 |
| 10 | 37.5 | 37.5 |
| 11 | 21.3 | 21.3 |
| 12 | 32.7 | 32.4 |
| 13 | 45.5 | 45.5 |
| 14 | 53.4 | 53.4 |
| 15 | 32.5 | 32.7 |
| 16 | 90.4 | 90.3 |
| 17 | 90.5 | 90.5 |
| 18 | 17.5 | 17.5 |
| 19 | 19.8 | 19.8 |
| 20 | 45.1 | 45.1 |
| 21 | 10.2 | 10.2 |
| 22 | 110.2 | 110.2 |
| 23 | 32.2 | 32.2 |
| 24 | 29.2 | 29.1 |
| 25 | 30.5 | 30.5 |
| 26 | 67.1 | 67.0 |
| 27 | 17.7 | 17.7 |
| 3- Rha′ | ||
| 1 | 100.7 | 100.6 |
| 2 | 78.4 | 78.3 |
| 3 | 78.0 | 77.9 |
| 4 | 78.3 | 78.3 |
| 5 | 77.4 | 77.3 |
| 6 | 61.5 | 61.5 |
| 4-Rha′′ | ||
| 1 | 102.5 | 102.5 |
| 2 | 72.9 | 72.9 |
| 3 | 73.3 | 73.4 |
| 4 | 74.5 | 74.5 |
| 5 | 69.9 | 69.9 |
| 6 | 19.3 | 19.0 |
| 4′-Rha′′′ | ||
| 1 | 103.7 | 103.7 |
| 2 | 73.7 | 73.7 |
| 3 | 73.2 | 73.3 |
| 4 | 80.8 | 80.8 |
| 5 | 68.7 | 68.6 |
| 6 | 19.0 | 19.2 |
| 2-Glc′′′′ | ||
| 1 | 102.6 | 102.5 |
| 2 | 73.0 | 73.0 |
| 3 | 73.2 | 73.2 |
| 4 | 74.4 | 74.4 |
| 5 | 70.8 | 70.8 |
| 6 | 18.8 | 18.8 |
4、质谱（MS）
仪器：Thermo QE FOCUS 液质联用色谱仪
测试条件：流动相甲醇-0.1%甲酸水溶液，75:25；电离方式HESI源；负离子模式；电离能量（N）CE 30 eV；Full-MS分辨率70000，dd-MS2分辨率17500。测定数据如表7，测得的质谱图见图10。
表7 ESI/MS质谱数据
测定结果：样品准分子离子峰m/z 1075.53442[M+CHOOH-H]-，测得其MS质量数为1030，与重楼皂苷Ⅶ的化合物分子式为C51H82O21相符。
主要裂解途径：样品的离子m/z 1029.52734[M-H]-，碎片离子有m/z 883.47095为[M-H-146]-、737.41284为[M-H-146×2]-，分别是失去1分子、2分子鼠李糖基C6H10O4 -的碎片离子，即C45H72O17、C39H62O13，与重楼皂苷Ⅶ结构相符。
综合各MS数据分析，样品分子量为1030，分子式C51H82O21，计算不饱和度为: Ω=（2×51+2-82）/2=11，符合本品结构。
结论：经质谱测得HR-ESI/MS分子离子峰为1029.52734[M-H]-，测得分子量为1030，结构单元中含有C=C、OH、CH3-、C-O、苯环。IR、UV、NMR、MS均证明此点，质谱特征碎片离子也证明其化学结构。
综合上各光谱数据，各理化常数和光谱数据与重楼皂苷Ⅶ化合物结构相符，并与文献值基本一致，确认为重楼皂苷Ⅶ。
结果：本发明分离、纯化的重楼皂苷Ⅶ化学对照品，经红外光谱、紫外光谱、核磁共振、质谱以及理化检测确认化学结构。经3个展开***5个不同浓度的TLC检测；3个流动相***和3个不同波长的HPLC检测，结果符合中药含量测定用化学对照品的要求，含量大于98%。
Claims (9)
1.一种高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）取云南重楼、华重楼或多叶重楼的干燥果壳，粉碎，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1～1.5倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇***梯度洗脱，收集含重楼皂苷Ⅶ的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的重楼皂苷Ⅶ粗结晶；
5）将重楼皂苷Ⅶ粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集重楼皂苷Ⅶ组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为90～98%的重楼皂苷Ⅶ合并，并将保留时间相同且纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ合并，分别进行减压浓缩，即可得到纯度为90～98%及纯度大于98%的重楼皂苷Ⅶ。
2.根据权利要求1所述的高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的5～20倍，乙醇浓度为70～90%，回流提取次数为3～8次，每次1～3h。
3.根据权利要求1所述的高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：步骤3）所述的梯度洗脱条件为：0～A分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为100:1～20:1；A～B分钟，洗脱***为氯仿-甲醇，二者比例为5:1～3:1；所述A为90～160，所述B为120～200。
4.根据权利要求1所述的高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂***：***一，氯仿-甲醇-甲酸体积比为3:1:0.1，***二，正丁醇-乙酸-水体积比为4:1:5（上层溶液），***三，氯仿-甲醇-水体积比为65:35:10（下层溶液）；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距为15 cm；
定位：喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见橙红色的单一斑点，三种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
5.根据权利要求1所述的高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：步骤5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，两者体积配比为55～75：25～45，流速为5～10 mL/min，检测波长为203～210 nm，柱温为25～35 ℃。
6.根据权利要求1所述的高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：
色谱柱：C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速：0.8～1.2 ml/min；进样量：10～20 μl；面积归一化法定量；***条件为以下三个条件的其中之一：
条件一：流动相为乙腈-水，两者体积配比为35～40:60～65，检测波长203 nm；
条件二：流动相为甲醇-水，两者体积配比为75～80:20～25，检测波长210 nm；
条件三：流动为甲醇-0.1%磷酸水溶液，两者体积配比为60～80:20～40，检测波长203～205 nm。
7.根据权利要求6所述的高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：所述的***条件三的流动相中，甲醇与0.1%磷酸水溶液的体积配比为60～80:20～40。
8.根据权利要求6所述的高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，其特征在于：所得高纯度重楼皂苷Ⅶ采用高效液相色谱法检测纯度大于98％。
9.权利要求1所述的高纯度重楼皂苷Ⅶ的制备方法，应用于从七叶一枝花的其他变种中提取高纯度重楼皂苷Ⅶ。
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