CN110540558B - 一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法 - Google Patents

一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110540558B
CN110540558B CN201910644834.9A CN201910644834A CN110540558B CN 110540558 B CN110540558 B CN 110540558B CN 201910644834 A CN201910644834 A CN 201910644834A CN 110540558 B CN110540558 B CN 110540558B
Authority
CN
China
Prior art keywords
phlorizin
methanol
purity
ethyl acetate
eluting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910644834.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110540558A (zh
Inventor
袁健童
刘布鸣
柴玲
黄艳
冯军
陈明生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Institute Of Chinese Medicine & Pharmaceutical Science
Original Assignee
Guangxi Institute Of Chinese Medicine & Pharmaceutical Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Institute Of Chinese Medicine & Pharmaceutical Science filed Critical Guangxi Institute Of Chinese Medicine & Pharmaceutical Science
Priority to CN201910644834.9A priority Critical patent/CN110540558B/zh
Publication of CN110540558A publication Critical patent/CN110540558A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110540558B publication Critical patent/CN110540558B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8624—Detection of slopes or peaks; baseline correction
    • G01N30/8631—Peaks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明涉及一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法，该方法是将多穗柯的干燥叶片粉末用乙醇回流提取，合并提取液浓缩，混悬液用石油醚萃取后，取水液部分再用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层浓缩，得萃取物；乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用甲醇‑二氯甲烷***梯度洗脱，用薄层色谱检测，收集含有根皮苷的洗脱液合并，减压浓缩，再经凝胶柱层析，用甲醇‑三氯甲烷***洗脱，收集含有根皮苷的洗脱液，减压浓缩，重结晶，得到根皮苷粗结晶；再用制备高效液相法分离纯化，对所收集的洗脱液利用HPLC检测，得到纯度在90%～98%之间的根皮苷和纯度大于98%的根皮苷组分。本发明工艺简单分离速度快，生产周期短，所得产品纯度高，质量可控，适合工业化生产。

Description

一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法
技术领域
本发明涉及一种从中药植物中提取根皮苷的技术领域，具体涉及一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法。
背景技术
化学对照品又称标准品，是中药质量标准研究、质量检测和质量控制的实物对照，中药化学对照品的研究，是中药标准化研究的一个非常重要的部分，对产品的质量评价，特别是在药品生产的质量控制中，中药化学对照品起着极其重大的作用，是中药质量控制的基础与核心。根皮苷是一种黄酮类化学成分，化学名称为1-(2-( β-D-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮，是多穗柯等植物的活性成分之一，也是许多植物和药品标准质量控制的指标性成分。目前尚未有相应的国家药品标准物质，国内外对根皮苷中药化学对照品的***研究未见报道。
根皮苷主要存在于蔷薇科苹果树的根皮、茎、嫩叶以及苹果果实中，1835年由法国化学家Petersen从苹果树皮中首次分离得到。根皮苷在菊科、杜鹃花科、豆科、壳斗科、百合科等植物中也有少量存在，但在壳斗科石柯属植物甜茶多穗石柯中发现有大量的根皮苷存在。近年来，在荔枝果皮、杜梨叶、锁阳等植物中也发现有根皮苷的存在，其含量都较少。总的说来，苹果树的根皮、茎、嫩叶、苹果果实以及多穗石柯是根皮苷的主要来源，可以作为提取根皮苷的原料加以利用。目前，在根皮苷的提取分离和含量测定方法方面，检索到相关的文献，如：
1.【题名】多穗柯化学成分研究，【作者】李胜华、伍贤进、杨青丹、陈原阳、周楠。【摘要】对多穗柯的化学成分进行提取和分离纯化,并通过理化数据及波谱分析鉴定化合物结构。结果:从多穗柯的醇提物中分离出9个化合物,分别是:根皮苷(Ⅰ)、根皮素(Ⅱ)、二氢查尔酮-2′--βD-吡喃葡萄糖苷(Ⅲ)、胡萝卜苷(Ⅳ)、β-谷甾醇(Ⅴ)、槲皮素(Ⅵ)、木犀草素(Ⅶ)、槲皮苷(Ⅷ)及齐墩果酸(Ⅸ)等9种化合物。结论:除化合物Ⅰ和Ⅲ外均为首次从该植物中分离。
2.【题名】野金柴化学成分的分离和研究，【作者】金弘昕、赵亚、赖小平、陈建南、黄松。【摘要】利用ODS柱层析,聚酰胺树脂柱层析,制备液相的方法对野金柴中的化学成分进行分离和纯化,并通过IR、NMR等光谱技术和化学方法鉴定化合物的结构。结果分离得到7个化合物,经鉴定分别为胡萝卜苷(1)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(2)、槲皮苷(3)、3-羟基根皮苷(4)、根皮苷(5)、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(6)、齐墩果酸(7)。结论山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷为首次从野金柴植物中分离得到。
3.【题名】木姜叶柯中根皮苷的提取工艺优选，【作者】陈文、杜明月、刘浩然【摘要】分别提取木姜叶柯中的根皮苷，比较提取物得率。结果：热水提取法所获得的根皮苷纯度及含量最高。以1：20料液比，提取2h，提取3次为热水提取法最佳工艺。结论：热水提取法是木姜叶柯中根皮苷的最优提取方法。
4.【题名】荔枝果皮中根皮苷的提取工艺研究，【作者】张贺兴、刘胜来【摘要】以不同浓度乙醇作为提取溶剂,分别使用浸提法、回流法、超声波法提取荔枝果皮中的根皮苷,用高效液相色谱测定根皮苷含量。采用L9(34)正交表确定最佳提取工艺。结果热回流法提取效果较好,40%乙醇溶液10倍量回流提取10 min为优化提取方案。结论：优选确定的提取工艺可用于提取荔枝果皮的根皮苷。
5.【题名】多穗柯质量标准研究，【作者】饶伟源、冉国粮、邱宏聪、兰保强【摘要】对多穗柯药材进行显微鉴别和TLC鉴别;进行总灰分、水分、浸出物检查;采用HPLC,使用C18色谱柱,以乙腈-0.1%磷酸水溶液(25∶75)为流动相,在280 nm下测定根皮苷的含量。结果明确了多穗柯的显微特征,制定水分限度≤15%,总灰分限度≤5.0%;醇溶性浸出物限度≥45%;建立了根皮苷的含量测定方法。结论：建立的方法简便、准确、重现性好,可有效控制多穗柯药材的质量。
6.【题名】苹果中根皮苷的测定及其在苹果汁质量控制中应用初步研究，【作者】苏光明、胡小松、廖小军、张名位、张燕、吕芳琳、吴继红【摘要】建立了苹果根皮苷高效液相色谱(HPLC)测定方法,该方法线性范围0.5～200 mg/L,检测限0.3 mg/L,定量限0.5 mg/L,相关系数r=0.9997,回收率99.7%～101.8%。
7.【题名】RP-HPLC法测定多穗柯药材中根皮苷的含量，【作者】邱宏聪、李茂、蒋珍藕【摘要】采用Thermo ODS-2Hypersil(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱;流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(15:75),流速1.0mL.min-1;检测波长280nm;进样量5μL。结果:该方法的线性范围为0.105～2.10μg,r=0.9999(n=5);平均回收率(n=6)为98.7%,RSD为1.7%。结论:该法简便、准确,重复性好,可用于多穗柯药材的质量控制。
8.【题名】木姜叶柯中根皮苷与三叶苷含量测定研究，【作者】张亚洲、王涛、朱晶晶、刘学、周福才、王强【摘要】采用HPLC法测定木姜柯中根皮苷的含量，结论：该方法简便,结果准确可靠,可用于测定木姜叶柯中根皮苷与三叶苷含量。
上述各个文献公开的方法从不同角度论述了根皮苷的提取分离及质量测定方法。部分分离方法分离纯度较高，但纯度大多数未达到中药化学对照品的要求，即纯度大于98%，无法满足高纯度根皮苷化学对照品的需要；根皮苷的测定方法以原料药中成分测定为主，对根皮苷化学对照品的质量控制与评价的研究，未见相关报导。
根皮苷作为植物、药材及其产品的化学对照品，是质量控制的技术关键，众多企业、科研和检验部门都需要高纯度的根皮苷对照品，其市场需求很大，由于根皮苷在药材中的含量低，提取分离技术要求很高、难度很大。因此，参照中药化学对照品（供含量测定用）的技术要求，通过对根皮苷化学对照品进行研究，建立根皮苷化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立根皮苷化学对照品的技术标准，能为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证；研究结果可为根皮苷化学对照品提供更完整的基础化学依据，掌握其化学信息和分析测试技术，有利于相关产品的进一步开发利用，而且对于开发我国特有产物，开发具有高技术、高附加值的产品，提高市场竞争能力，将会产生潜在而不可估量的社会效益与经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法。
 本发明是从壳斗科科植物多穗柯  Lithocarpus polystachyus (DC.) Rehd.的叶中经提取、分离、精制、纯化而制得的根皮苷，其化学名、分子式、结构式如下：
中文名 ：根皮苷
化学名 ：1-(2-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮，（1-(2-(beta-D-Glμcopyranosyloxy)-4,6-dihydroxyphenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)-propanone）
英文名 ：phlorizin
分子式 ：C21H24O10
结构式如下 ：
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种高纯度根皮苷的制备方法，具体包括如下步骤：
1) 多穗柯的干燥叶片粉末，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2）浸膏再经石油醚萃取，静置，弃去石油醚层，水液部分再用乙酸乙酯萃取，静置，合并乙酸乙酯层，浓缩得乙酸乙酯萃取物 ；
3）乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱，收集含根皮苷的流分，所述的甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱条件为：0～A分钟，洗脱***为二氯甲烷 ；B～C 分钟，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，甲醇:二氯甲烷的比例为1:100～1:10 ；所述A 为 5～20，所述 B 为5～21，所述 C 为 70～110；
4）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，即得纯度为70～80％的根皮苷粗提物；
5）将根皮苷粗提物，经凝胶柱层析，用甲醇-三氯甲烷体积比1:1***洗脱，收集洗脱液，每10ml流份为一份；
6）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，重结晶，即得纯度为80～90％的根皮苷粗结晶 ；
7）将根皮苷粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集根皮苷组分；
8）对所收集的每一份根皮苷组分利用 HPLC 检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98% 之间和纯度大于 98% 以上的根皮苷，减压浓缩，得到纯度 90%-98% 之间以及大于 98% 以上的根皮苷。
上述的高纯度根皮苷的制备方法，所述步骤 1）中乙醇的加入量为药材重量的 5-10 倍，乙醇的体积浓度为 30-90%，回流提取次数为 3-15 次。
上述的高纯度根皮苷的制备方法，所述步骤 4）和所述步骤 6）中TLC 检测方法为：薄层板：硅胶G；3种展开剂***：***（1）二氯甲烷-甲醇体积比例 7:3，***（2）石油醚–乙酸乙酯-甲醇-甲酸体积比例为2:18:2:1，***（3）乙酸乙酯-甲酸-水体积比例14:1:1；点样：用甲醇制1mg/mL 的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为2μg、5μg、10μg、20μg、25μg ；置展开缸分别展开，展距：15cm ；定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯（365nm）下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点结果如图2。
上述的高纯度根皮苷的制备方法，所述步骤 7）制备高效液相色谱的色谱柱为 C-18 柱，甲醇-水体积比例 25:75-90:10为流动相洗脱，流速为 5～10 mL/min，检测波长为250～290nm，柱温为 20～35℃。
上述的高纯度根皮苷的制备方法，所述步骤 8）的 HPLC检测方法为：色谱条件 ：色谱柱 C-18，4.6×250mm，10μm ；流速：0.6-1.5ml/min ；进样量：19～118μg；面积归一化法、主成分自身对照法定量；***条件为以下三个条件的其中之一 ：
条件（1）流动相：甲醇–水体积比例 30:70-90:10，检测波长：220～370nm ；
条件（2）流动相：乙腈–水体积比25:75-80:20，检测波长：220～370nm ；
条件（3）流动相：甲醇–水体积比例 20:80-80:20，检测波长：220～370nm。
优选的，上述步骤 8）的***条件（1） 流动相：甲醇-水体积比例35:65 ，检测波长 ：222nm；***条件（2）流动相：乙腈-水体积比例30:70 ，检测波长：284nm；***条件（3）流动相：甲醇-水体积比例40:60 ，检测波长：254nm。
含量与纯度测定 ：精密称取于 105℃干燥至恒重的对照品适量，加50%甲醇溶液制成每 1ml 含 1mg 的溶液，在测定条件下，进样 6μl（约相当于 60μg），注入液相色谱仪，用优选的3个流动相溶剂***分别记录色谱图至主成分的出峰保留时间的 2.5 倍以上，用面积归一化法和主成分自身对照发计算含量，结果***测定对照品含量在均 98% 以上。杂质检查，分别在不同***记录的色谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于 2.0%。结果见表1。采用自身对照法测得根皮苷候选化学对照品色谱纯度为98.99（n=3），杂质总含量均在2.0 %以下。
峰纯度检测：取对照品适量，按流动相***，在高效液相色谱仪上，用二极管阵列DAD 检测器进行峰纯度检查，根皮苷的 HPLC 色谱峰 >98%，其色谱图为单一峰，三维图谱以及 5 点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。结果见图3、图4、图5。
色谱分析方法学考察
色谱条件：
采用Agilent pursuit C18色谱柱，甲醇-水（40∶60）为流动相，检测波长284 nm，进样量6μl；流量1mL/min。
线性关系：
取根皮苷候选化学对照品，于105 ℃干燥至恒重，取约10 mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为9.87mg/mL的溶液。分别吸取化学对照品溶液2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl，按上述色谱条件注入液相色谱仪，测定峰面积，并以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算得到回归方程为y = 212.3x -84.84，R=1。根皮苷候选化学对照品在进样量为19.7～118.4μg范围内具有较好的线性关系。
重现性、稳定性与精密度
取同一供试品6份，分别按上述方法及色谱***测定，记录根皮苷色谱图及峰面积积分值，计算含量，结果平均含量98.67%，RSD为0.15%，说明该方法重现性良好。
取同一供试品溶液，在室温下放置0.5，1，2，6，12，24 h，依法进样测定，记录根皮苷色谱图及峰面积积分值，结果显示RSD=0.20%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。
取同一供试品溶液，连续进样6次，记录根皮苷色谱图及峰面积，结果RSD=0.15%，说明仪器精密度良好。
方法的耐用性考察：
采用了3根不同厂家和品牌的色谱柱，分别进行保留时间、理论板数、分离度和杂质分离效果测定，在上述分析条件下，根皮苷峰与其他杂质峰达到基线分离，分离度大于1.5，按根皮苷峰计算理论板数不低于4000时，可满足测定要求，见表2。
结构确证：
理化常数：根皮苷为白色针晶，熔点190～192℃，溶于甲醇、乙醇、丙酮，乙酸乙酯，微溶于水，易溶于热水。
波谱数据鉴定：
红外吸收光谱(IR) 仪器：Bruker TENSOR 27FTIR 仪器校正和检定聚苯乙烯薄膜的IR谱，符合中国药典2015年版的规定。
样品制备方法：取样品适量，溴化钾压片。
本品的红外吸收光谱图见图6。
解析： 3570 cm-1，3182 cm-1: -OH的伸缩振动；2927、2869:C-H伸缩振动；1638 cm-1: 共轭C=O；1512 cm-1芳环骨架伸缩振动；1261 cm-1、1205 cm-1、1165 cm-1：C-O-C。
紫外吸收光谱(UV)
仪器：日本岛津UV-2550型紫外光谱仪。
仪器校正和检定，符合中国药典2015年版的规定。
溶剂：分析纯甲醇。
供试液：取样品适量，加甲醇配制成每1 mL含20μg的溶液。
本品的紫外吸收光谱图见图7
解析
紫外光谱在284、222nm处有两个最大吸收峰，为共轭双键的π→π*跃迁所产生的峰。从紫外光谱图得知，结构中含有不饱和共轭体系的发色团和助色团。
核磁共振谱：
1HNMR 核磁共振谱
仪器：德国BRUKER Dre-500
溶剂：DMSO，内标TMS
本品的1HNMR 核磁共振波谱图见图8。
13CNMR 核磁共振谱
仪器：德国 BRUKER 125 MHz
溶剂：DMSO，内标TMS
本品的13CNMR核磁共振波谱图见图9。
质谱（MS）
仪器：Thermo QE FOCUS 液质联用色谱仪
测试条件：流动相 0.1%甲酸/水-甲醇60:40；电离方式HESI源;正离子/负离子模式；电离能量30eV；分辨率70000。本品的质谱图见图10-图13。
测定结果：本品正/负离子模式下，测得准分子离子峰m/z 437.14420（M+H）+和m/z435.12958（M-H）-，其质量数M为436，1-(2-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮的化合物分子式为C21H24O10相符。
主要裂解途径：本品的负离子模式下准分子离子m/z 435.12958 (M-H)-，二聚体离子m/z871.26703(2M-H)-，是两分子根皮苷聚合而成；碎片离子m/z273.07856 (M-162-H)-是分子离子失去葡萄糖基得到的苷元离子；碎片离子m/z167.03386 (M-162-106-H)-是苷元离子在羰基邻位碳断裂后生成的碎片离子。正离子模式下准分子离子m/z 437.14420 (M+H)+，碎片离子有m/z 275.09116(M-162+H)+分子离子失去葡萄糖基得到的苷元离子；碎片离子m/z169.04916(M-162-106+H)+是苷元离子在羰基邻位碳断裂后生成的碎片离子碎片。主要裂解途径如下。
综合各MS数据分析，本品分子量为436，分子式C21H24O10，计算不饱和度为:Ω=（2×21＋2－24）/2=10，符合本品结构。
结论：本品经质谱测得HESI/MS准分子离子峰为435.12958 (M-H)-、437.14420 (M+H)+，测得分子量为436，结构单元中含有 C=C、O-H、CH3-、C-O、苯环。IR、UV、NMR、MS均证明此点，质谱特征碎片离子也证明其化学结构。
综合上各光谱数据，各理化常数和光谱数据与根皮苷化合物结构相符，并与文献值基本一致，本品应为1-(2-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮，即根皮苷。
结果：本发明分离、纯化的根皮苷化学对照品，经红外光谱、紫外光谱、核磁共振、质谱以及理化检测确认化学结构。经 3 个展开*** 5 个不同浓度的 TLC 检测；3个流动相***和3个不同波长的 HPLC 检测，结果符合中药含量测定用化学对照品的要求，含量大于 98%。
一种高纯度根皮苷，按照上述的高纯度根皮苷的制备方法制备而成，经质量检测，其纯度大于 98%。
本发明提供的一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法具有以下优点：
1、本发明设计合理，工艺简单，利用醇水溶剂提取，经过一次硅胶柱层析和凝胶柱层析后重结晶即可得到纯度较高的根皮苷，最后经制备高效液相色谱法制备出纯度达到98% 以上的根皮苷化学对照品，方法简便易行。
2、本发明分离速度快，生产周期短，适合工业化生产，有很好的应用前景。
3、本发明制备得到的化合物经光谱分析确认为根皮苷。
4、本发明采用薄层色谱和高效液相色谱进行纯度检查、含量测定及质量控制，确保产品的质量。
5、本发明从多穗柯叶中制备出纯度符合化学对照品要求，含量在 98% 以上的根皮苷，解决了根皮苷化学对照品的供应问题，为多穗柯及其他含有根皮苷成分的药品的质量控制提供了提供科学基础和保证，具有重大的实际意义和学术价值。
附图说明
图1 为本发明高纯度根皮苷的制备工艺流程图；
图2 为TLC 检测中根皮苷三种展开***的薄层色谱图；
图3为根皮苷高效液相色谱图；
图4为根皮苷高效液相色谱3维光谱图；
图5为根皮苷 5点光谱图；
图6为根皮苷红外光谱图；
图7为根皮苷紫外光谱图；
图8为根皮苷核磁共振光谱图- a氢谱谱图；
图9为根皮苷核磁共振光谱图- b碳谱谱图；
图10 为根皮苷质谱图-a 负离子模式一级质谱图；
图11 为根皮苷质谱图- b 负离子模式二级质谱图；
图12 为根皮苷质谱图- c 正离子模式一级质谱图；
图13为根皮苷质谱图- d 正离子模式二级质谱图。
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的乙醇量的百分数是体积百分数，v/v 表示溶液的体积比。
对比例： 多穗柯叶片1kg，粉碎后加入 10 倍 70％乙醇回流提取，每次30分钟，合并 提取液；将提取液浓缩至原体积的 1/4，用等体积量的石油醚超声萃取 2 次，弃去萃取液，将萃余液上 XAD-18 大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至无色，然后用 6 倍柱体积 60％乙醇洗脱，收集，减压回收试剂，浓缩，所得浸膏通过硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇(100∶1)→(10∶1) 梯度洗脱，收集洗脱液，回收试剂，浓缩至干得粗提物，所得粗提取物通过凝胶柱层析，用三氯甲烷-甲醇(1:1)洗脱，得根皮苷粗结晶，粗结晶用水反复重结晶 5 次，得纯度93%根皮苷产品。
实施例1
一种高纯度根皮苷的制备方法，具体包括如下步骤 ：
1) 多穗柯的干燥叶片粉末1kg，用10倍重量的体积浓度70%的乙醇回流提取 3次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，弃去石油醚层，水液部分再用乙酸乙酯萃取，静置，合并乙酸乙酯层，浓缩得乙酸乙酯萃取物；
3）乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱，收集含根皮苷的流分，所述的甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱条件为：0-5min，洗脱***为二氯甲烷 ；5-15min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，甲醇:二氯甲烷的体积比例为1:100；15-60min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:20；60-110min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:10；
4）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，即得纯度为重量含量70～80％的根皮苷粗提物 ；
5）将根皮苷粗提物，经凝胶柱层析，用甲醇-三氯甲烷体积比1:1***等度洗脱，收集洗脱液，每10ml流份为一份；
6）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80～90％的根皮苷粗结晶；
7）将根皮苷粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集根皮苷组分；制备高效液相色谱的色谱柱为 C-18 柱，甲醇-水体积比例 40-60为流动相洗脱，流速为 5 mL/min，检测波长为 284nm，柱温为 25℃；
8）对所收集的每一份根皮苷组分利用 HPLC 检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98% 之间和纯度大于 98% 以上的根皮苷，减压浓缩，得到纯度 93%以及99%的根皮苷。
所述步骤 4）和所述步骤 6）中TLC 检测方法为：取根皮苷粗品加甲醇制成每 1ml含 1mg 的溶液，在同一硅胶 G 薄层板上，分别按 2μg、5μg、10μg、20μg、25μg 不同的浓度梯度点样，以二氯甲烷–甲醇（7:3）、石油醚–乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:18:2:1）、乙酸乙酯-甲酸-水（14:1:1）三种***为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3% 三氯化铝乙醇溶液，在 105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光（365nm）下检视。在薄层色谱中，三种展开剂***，五个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
所述步骤 8）的 HPLC检测方法为：色谱条件 ：色谱柱 C-18，4.6×250mm，10μm ；流速：0.6ml/min ；进样量：19μg；***条件：流动相乙腈-水40：60，检测波长 360nm ；面积归一化法、主成分自身对照法定量；主成分（根皮苷 C21H24O10）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例2
一种高纯度根皮苷的制备方法，具体包括如下步骤 ：
1) 多穗柯的干燥叶片粉末1kg，用5倍重量的体积浓度70%的乙醇回流提取 4次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，弃去石油醚层，水液部分再用乙酸乙酯萃取，静置，合并乙酸乙酯层，浓缩得乙酸乙酯萃取物；
3）乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱，收集含根皮苷的流分，所述的甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱条件为：0～8分钟，洗脱***为二氯甲烷 ；8-20min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，甲醇:二氯甲烷的比例为1:100；20-40min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，甲醇:二氯甲烷的比例为1:20；40-55min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:15，55-110min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:10；
4）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，即得纯度为重量含量70～80％的根皮苷粗提物 ；
5）将根皮苷粗提物，经凝胶柱层析，用甲醇-三氯甲烷体积比1:1***洗脱，收集洗脱液，每10ml流份为一份；
6）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80～90％的根皮苷粗结晶 ；
7）将根皮苷粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集根皮苷组分；制备高效液相色谱的色谱柱为 C-18 柱，甲醇-水体积比例 45-55为流动相洗脱，流速为 5 mL/min，检测波长为 284nm，柱温为 25℃；
8）对所收集的每一份根皮苷组分利用 HPLC 检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98% 之间和纯度大于 98% 以上的根皮苷，减压浓缩，得到纯度为92%以及98.8%的根皮苷。
所述步骤 4）和所述步骤 6）中TLC 检测方法为：取根皮苷粗品加甲醇制成每 1ml含 1mg 的溶液，在同一硅胶 G 薄层板上，分别按 2μg、5μg、10μg、20μg、25μg 不同的浓度梯度点样，以二氯甲烷–甲醇（7:3）、石油醚–乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:18:2:1）、乙酸乙酯-甲酸-水（14:1:1）三种***为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3% 三氯化铝乙醇溶液，在 105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光（365nm）下检视。结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
所述步骤 8）的 HPLC检测方法为：色谱条件 ：色谱柱 C-18，4.6×250mm，10μm ；流速：1ml/min ；进样量：25μg；***条件：流动相：乙腈-水体积比例30:70 ，检测波长：284nm；面积归一化法计算含量，主成分（根皮苷 C21H24O10）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例3
一种高纯度根皮苷的制备方法，具体包括如下步骤 ：
1) 多穗柯的干燥叶片粉末1kg，用8倍重量的体积浓度为 50%的乙醇回流提取5次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，弃去石油醚层，水液部分再用乙酸乙酯萃取，静置，合并乙酸乙酯层，浓缩得乙酸乙酯萃取物；
3）乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱，收集含根皮苷的流分，所述的甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱条件为：0～5分钟，洗脱***为二氯甲烷；5-15min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:100；15-40min，洗脱***为二氯甲烷-甲醇，比例为1:20；40-55min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:15，55-110min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为 1:10；
4）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，即得纯度为重量含量70～80％的根皮苷粗提物 ；
5）将根皮苷粗提物，经凝胶柱层析，用甲醇-三氯甲烷体积比1:1***洗脱，收集洗脱液，每10ml流份为一份；
6）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80～90％的根皮苷粗结晶 ；
7）将根皮苷粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集根皮苷组分；制备高效液相色谱的色谱柱为 C-18 柱，甲醇-水体积比例38:62为流动相洗脱，流速为 6 mL/min，检测波长为 250nm，柱温为 25℃；
8）对所收集的每一份根皮苷组分利用 HPLC 检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98% 之间和纯度大于 98% 以上的根皮苷，减压浓缩，得到纯度为 92%以及 99% 的根皮苷。
所述步骤 4）和所述步骤 6）中TLC 检测方法为：取根皮苷粗品加甲醇制成每 1ml含 1mg 的溶液，在同一硅胶 G 薄层板上，分别按 2μg、5μg、10μg、20μg、25μg 不同的浓度梯度点样，以二氯甲烷–甲醇（7:3）、石油醚–乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:18:2:1）、乙酸乙酯-甲酸-水（14:1:1）三种***为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3% 三氯化铝乙醇溶液，在 105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光（365nm）下检视；在薄层色谱中，三种展开剂***，五个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
所述步骤 8）的 HPLC检测方法为：色谱条件 ：色谱柱 C-18，4.6×250mm，10μm ；流速：1.5ml/min ；进样量： 118μg；***条件：流动相甲醇-水体积比例40:60 ，检测波长：254nm；面积归一化法计算含量，主成分（根皮苷 C21H24O10）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例4
一种高纯度根皮苷的制备方法，具体包括如下步骤 ：
1) 多穗柯的干燥叶片粉末，用10倍重量体积浓度为30%的乙醇回流提取15次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，弃去石油醚层，水液部分再用乙酸乙酯萃取，静置，合并乙酸乙酯层，浓缩得乙酸乙酯萃取物 ；
3）乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱，收集含根皮苷的流分，所述的甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱条件为：0-5min，洗脱***为二氯甲烷 ；5-10min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:100；10-40min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:20；40-70min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为 1:15，70-110min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为 1:10；
4）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，即得纯度为70～80％的根皮苷粗提物；
5）将根皮苷粗提物，经凝胶柱层析，用甲醇-三氯甲烷体积比1:1***洗脱，收集洗脱液，每10ml流份为一份；
6）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，重结晶，即得纯度为80～90％的根皮苷粗结晶 ；
7）将根皮苷粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集根皮苷组分；制备高效液相色谱的色谱柱为 C-18 柱，甲醇-水体积比例 25:75为流动相洗脱，流速为 7 mL/min，检测波长为 250nm，柱温为 20℃；
8）对所收集的每一份根皮苷组分利用 HPLC 检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98% 之间和纯度大于 98% 以上的根皮苷，减压浓缩，得到纯度为 94% 以及 98.3% 的根皮苷。 所述步骤 4）和所述步骤 6）中TLC 检测方法为：取根皮苷粗品加甲醇制成每 1ml含 1mg 的溶液，在同一硅胶 G 薄层板上，分别按 2μg、5μg、10μg、20μg、25μg 不同的浓度梯度点样，以二氯甲烷–甲醇（7:3）、石油醚–乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:18:2:1）、乙酸乙酯-甲酸-水（14:1:1）三种***为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3% 三氯化铝乙醇溶液，在 105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光（365nm）下检视。结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
所述步骤 8）的 HPLC检测方法为：色谱条件 ：色谱柱 C-18，4.6×250mm，10μm ；流速：1.5ml/min ；进样量：30μg；***条件：流动相甲醇-水体积比例40:60 ，检测波长：254nm；面积归一化法计算含量，主成分（根皮苷 C21H24O10）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例5
一种高纯度根皮苷的制备方法，具体包括如下步骤 ：
1) 多穗柯的干燥叶片粉末1 kg，用7倍重量的体积浓度为 80%的乙醇回流提取6次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，弃去石油醚层，水液部分再用乙酸乙酯萃取，静置，合并乙酸乙酯层，浓缩得乙酸乙酯萃取物 ；
3）乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱，收集含根皮苷的流分，所述的甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱条件为：0-5min，洗脱***为二氯甲烷 ；5-15min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:100；15-60min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:20；60-70min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:15，70-110min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:10；
4）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，即得纯度为70～80％的根皮苷粗提物 ；
5）将根皮苷粗提物，经凝胶柱层析，用甲醇-三氯甲烷体积比1:1***洗脱，收集洗脱液，每10ml流份为一份；
6）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，重结晶，即得纯度为80～90％的根皮苷粗结晶 ；
7）将根皮苷粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集根皮苷组分；制备高效液相色谱的色谱柱为 C-18 柱，甲醇-水体积比例 25:75为流动相洗脱，流速为 8mL/min，检测波长为 250nm，柱温为 30℃；
8）对所收集的每一份根皮苷组分利用 HPLC 检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98% 之间和纯度大于 98% 以上的根皮苷，减压浓缩，得到纯度为 92% 以及 99% 的根皮苷。
所述步骤 4）和所述步骤 6）中TLC 检测方法为：取根皮苷粗品加甲醇制成每 1ml含 1mg 的溶液，在同一硅胶 G 薄层板上，分别按 2μg、5μg、10μg、20μg、25μg 不同的浓度梯度点样，以二氯甲烷–甲醇（7:3）、石油醚–乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:18:2:1）、乙酸乙酯-甲酸-水（14:1:1）三种***为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3% 三氯化铝乙醇溶液，在 105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光（365nm）下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
所述步骤 8）的 HPLC检测方法为：色谱条件 ：色谱柱 C-18，4.6×250mm，10μm ；流速：0.8ml/min ；进样量：10μl；***条件：流动相甲醇-水40：60，检测波长 370nm ；面积归一化法计算含量，主成分（根皮苷 C21H24O10）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例 6
一种高纯度根皮苷的制备方法，具体包括如下步骤 ：
1) 多穗柯的干燥叶片粉末500g，用5倍重量体积浓度为90%的乙醇回流提取3次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，弃去石油醚层，水液部分再用乙酸乙酯萃取，静置，合并乙酸乙酯层，浓缩得乙酸乙酯萃取物 ；
3）乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱，收集含根皮苷的流分，所述的甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱条件为：0-5min，洗脱***为二氯甲烷 ；5-15min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:100；15-60min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:20；60-70min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为 1:15，70-110min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为 1:10；
4）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，即得纯度为70～80％的根皮苷粗提物 ；
5）将根皮苷粗提物，经凝胶柱层析，用甲醇-三氯甲烷体积比1:1***洗脱，收集洗脱液，每10ml流份为一份；
6）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，重结晶，即得纯度为80～90％的根皮苷粗结晶 ；
7）将根皮苷粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集根皮苷组分；制备高效液相色谱的色谱柱为 C-18 柱，甲醇-水体积比例40:60为流动相洗脱，流速为6 mL/min，检测波长为 254nm，柱温为 25℃；
8）对所收集的每一份根皮苷组分利用 HPLC 检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98% 之间和纯度大于 98% 以上的根皮苷，减压浓缩，得到纯度为 92% 以及 99% 的根皮苷。
所述步骤 4）和所述步骤 6）中TLC 检测方法为：取根皮苷粗品加甲醇制成每 1ml含 1mg 的溶液，在同一硅胶 G 薄层板上，分别按 2μg、5μg、10μg、20μg、25μg 不同的浓度梯度点样，以二氯甲烷–甲醇（7:3）、石油醚–乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:18:2:1）、乙酸乙酯-甲酸-水（14:1:1）三种***为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3% 三氯化铝乙醇溶液，在 105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光（365nm）下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
所述步骤 8）的 HPLC检测方法为：色谱条件 ：色谱柱 C-18，4.6×250mm，10μm ；流速：1ml/min ；进样量：10μl；***条件：流动相甲醇-水40：60，检测波长 360nm ；面积归一化法计算含量，主成分（根皮苷 C21H24O10）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例7
一种高纯度根皮苷的制备方法，具体包括如下步骤 ：
1) 多穗柯的干燥叶片粉末500g，用10倍重量体积浓度为40%的乙醇回流提取8次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，弃去石油醚层，水液部分再用乙酸乙酯萃取，静置，合并乙酸乙酯层，浓缩得乙酸乙酯萃取物 ；
3）乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱，收集含根皮苷的流分，所述的甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱条件为：0-5min，洗脱***为二氯甲烷 ；5-15min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:90；15-40min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:30；40-75min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为 1:15，75-110min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为 1:10；
4）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，即得纯度为70～80％的根皮苷粗提物 ；
5）将根皮苷粗提物，经凝胶柱层析，用甲醇-三氯甲烷体积比1:1***洗脱，收集洗脱液，每10ml流份为一份；
6）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，重结晶，即得纯度为80～90％的根皮苷粗结晶 ；
7）将根皮苷粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集根皮苷组分；制备高效液相色谱的色谱柱为 C-18 柱，甲醇-水体积比例 25:75为流动相洗脱，流速为10 mL/min，检测波长为290nm，柱温为35℃；
8）对所收集的每一份根皮苷组分利用 HPLC 检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98% 之间和纯度大于 98% 以上的根皮苷，减压浓缩，得到纯度为 91% 以及 99% 的根皮苷。
所述步骤 4）和所述步骤 6）中TLC 检测方法为：取根皮苷粗品加甲醇制成每 1ml含 1mg 的溶液，在同一硅胶 G 薄层板上，分别按 2μg、5μg、10μg、20μg、25μg 不同的浓度梯度点样，以二氯甲烷–甲醇（7:3）、石油醚–乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:18:2:1）、乙酸乙酯-甲酸-水（14:1:1）三种***为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3% 三氯化铝乙醇溶液，在 105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光（365nm）下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
所述步骤 8）的 HPLC检测方法为：色谱条件 ：色谱柱 C-18，4.6×250mm，10μm ；流速：0.6-1.5ml/min ；进样量：10μl；***条件：乙腈–水体积比25:75检测波长：284nm ；面积归一化法计算含量，主成分（根皮苷 C21H24O10）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例8
一种高纯度根皮苷的制备方法，具体包括如下步骤 ：
1) 多穗柯的干燥叶片粉末，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；乙醇的加入量为药材重量的7 倍，乙醇的体积浓度为 70%，回流提取次数为 8 次；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，弃去石油醚层，水液部分再用乙酸乙酯萃取，静置，合并乙酸乙酯层，浓缩得乙酸乙酯萃取物 ；
3）乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱，收集含根皮苷的流分，所述的甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱条件为：0-5min，洗脱***为二氯甲烷 ；5-15min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:95；15-30min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为1:30；30-55min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为 1:20，55-75min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为 1:15，75-110min，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，比例为 1:10；
4）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，即得纯度为70～80％的根皮苷粗提物 ；
5）将根皮苷粗提物，经凝胶柱层析，用甲醇-三氯甲烷体积比1:1***洗脱，收集洗脱液，每10ml流份为一份；
6）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，重结晶，即得纯度为80～90％的根皮苷粗结晶 ；
7）将根皮苷粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集根皮苷组分；制备高效液相色谱的色谱柱为 C-18 柱，甲醇-水体积比例40:60为流动相洗脱，流速为 5 mL/min，检测波长为 254nm，柱温为 25℃；
8）对所收集的每一份洗脱液利用 HPLC 检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98% 之间和纯度大于 98% 以上的根皮苷，减压浓缩，得到纯度为 93.8% 以及 98% 的根皮苷。
所述步骤 4）和所述步骤 6）中TLC 检测方法为：取根皮苷粗品加甲醇制成每 1ml含 1mg 的溶液，在同一硅胶 G 薄层板上，分别按 2μg、5μg、10μg、20μg、25μg 不同的浓度梯度点样，以二氯甲烷–甲醇（7:3）、石油醚–乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:18:2:1）、乙酸乙酯-甲酸-水（14:1:1）三种***为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3% 三氯化铝乙醇溶液，在 105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光（365nm）下检视。在薄层色谱中，三种展开剂***，五个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
所述步骤 8）的 HPLC检测方法为：色谱条件 ：色谱柱 C-18，4.6×250mm，10μm ；流速：0.6-1.5ml/min ；进样量：10μl；面积归一化法、主成分自身对照法定量；***条件为：流动相：甲醇-水体积比例35:65 ，检测波长 ：222nm；面积归一化法计算含量，主成分（根皮苷 C21H24O10）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上对实验方法、含量测定及结构确证所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种高纯度根皮苷的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1) 多穗柯的干燥叶片粉末，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2）浸膏再经石油醚萃取，静置，弃去石油醚层，水液部分再用乙酸乙酯萃取，静置，合并乙酸乙酯层，浓缩得乙酸乙酯萃取物；
3）乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱，收集含根皮苷的流分，所述的甲醇-二氯甲烷***梯度洗脱条件为：0～A分钟，洗脱***为二氯甲烷 ；B～C 分钟，洗脱***为甲醇-二氯甲烷，甲醇:二氯甲烷的比例为1:100～1:10 ；所述A 为 5～20，所述 B 为 5～21，所述 C 为 70～110；
4）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，即得纯度为70～80％的根皮苷粗提物；
5）将根皮苷粗提物，经凝胶柱层析，用甲醇-三氯甲烷体积比1:1***洗脱，收集洗脱液，每10ml流份为一份；
6）流分用 TLC 检测，将含有根皮苷的流份合并，浓缩，重结晶，即得纯度为80～90％的根皮苷粗结晶；
7）将根皮苷粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集根皮苷组分；
8）对所收集的每一份根皮苷组分利用 HPLC 检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98% 之间和纯度大于 98% 以上的根皮苷，减压浓缩，得到纯度 90%-98% 之间以及大于 98% 以上的根皮苷；
所述步骤 1）中乙醇的加入量为药材重量的 5-10 倍，乙醇的体积浓度为 30-90%，回流提取次数为 3-15 次；
所述步骤 4）和所述步骤 6）中TLC 检测方法为：薄层板：硅胶G；3种展开剂***：***（1）二氯甲烷-甲醇体积比例 7:3，***（2）石油醚–乙酸乙酯-甲醇-甲酸体积比例为2:18:2:1，***（3）乙酸乙酯-甲酸-水体积比例14:1:1；点样：用甲醇制1mg/mL 的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为 2μg、5μg、10μg、20μg、25μg ；置展开缸分别展开，展距：15cm ；定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯，365nm，下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂***，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点；
所述步骤 7）制备高效液相色谱的色谱柱为 C-18 柱，甲醇-水体积比例 25:75-90:10为流动相洗脱，流速为 5～10 mL/min，检测波长为 250～290nm，柱温为 20～35℃；
所述步骤 8）的 HPLC检测方法为：色谱条件 ：色谱柱 C-18，4.6×250mm，10μm；流速：0.6-1.5ml/min；进样量：19～118μg；面积归一化法、主成分自身对照法定量；***条件为以下三个条件的其中之一：
条件（1）流动相：甲醇–水体积比例 30:70-90:10，检测波长：220～370nm；
条件（2）流动相：乙腈–水体积比25:75-80:20，检测波长：220～370nm；
条件（3）流动相：甲醇–水体积比例 20:80-80:20，检测波长：220～370nm。
CN201910644834.9A 2019-07-17 2019-07-17 一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法 Active CN110540558B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910644834.9A CN110540558B (zh) 2019-07-17 2019-07-17 一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910644834.9A CN110540558B (zh) 2019-07-17 2019-07-17 一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110540558A CN110540558A (zh) 2019-12-06
CN110540558B true CN110540558B (zh) 2023-04-25

Family

ID=68709880

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910644834.9A Active CN110540558B (zh) 2019-07-17 2019-07-17 一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110540558B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111349140B (zh) * 2020-04-27 2022-12-27 广西壮族自治区中医药研究院 一种高纯度重楼皂苷ⅶ的制备方法及质量控制方法
CN111595972A (zh) * 2020-05-29 2020-08-28 广西壮族自治区中医药研究院 一种多穗柯总黄酮提取物的制备方法及质量检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106220693A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 广西苷亮健生物科技有限公司 一种提取多穗石柯根皮苷的方法
CN111349124A (zh) * 2018-12-20 2020-06-30 重庆积玉生物工程有限公司 一种从多穗石柯中提取分离根皮苷的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106220693A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 广西苷亮健生物科技有限公司 一种提取多穗石柯根皮苷的方法
CN111349124A (zh) * 2018-12-20 2020-06-30 重庆积玉生物工程有限公司 一种从多穗石柯中提取分离根皮苷的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D-101大孔树脂纯化多穗柯中根皮苷的工艺研究;李胜华等;《食品科技》;20100720;第35卷(第7期);第217-221页 *
HPLC法同时测定多穗柯提取物中4种黄酮苷类成分的含量;赵亚等;《中药新药与临床药理》;20130125;第24卷(第1期);第88-91页 *
木姜叶柯中根皮苷的提取工艺优选;陈文等;《内蒙古中医药》;20161130(第15期);第138-139页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110540558A (zh) 2019-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hajimehdipoor et al. Development of a validated HPLC method for the simultaneous determination of flavonoids in Cuscuta chinensis Lam. by ultra-violet detection
CN110540558B (zh) 一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法
Głazowska et al. Chromatographic separation, determination and identification of ecdysteroids: Focus on Maral root (Rhaponticum carthamoides, Leuzea carthamoides)
Yang et al. Metabolites of protoberberine alkaloids in human urine following oral administration of Coptidis Rhizoma decoction
Zhang et al. Rapid screening, identification, and purification of neuraminidase inhibitors from Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. by ultrafiltration with HPLC–ESI‐TOF‐MS combined with semipreparative HPLC
Wang et al. Isolation and purification of six iridoid glycosides from gardenia jasminoides fruit by medium‐pressure liquid chromatography combined with macroporous resin chromatography
Liu et al. Quantitative analysis of nine coumarins in rat urine and bile after oral administration of Radix Glehniae extract by high‐performance liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry
CN111089916B (zh) 一种柴芍口服液中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测方法
CN115160337A (zh) 1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物及其制备方法和应用
Chen et al. Simultaneous determination of the content of isoquinoline alkaloids in Dicranostigma leptopodum (Maxim) Fedde and the effective fractionation of the alkaloids by high‐performance liquid chromatography with diode array detection
Zhai et al. Discrimination of toxic ingredient between raw and processed Pinellia ternata by UPLC/Q-TOF-MS/MS with principal component analysis and T-test
Li et al. Qualitative and quantitative analyses of Epimedium wushanense by high‐performance liquid chromatography coupled with diode array detection and electrospray ionization tandem mass spectrometry
Zhang et al. A simple and rapid UPLC-PDA method for quality control of Nardostachys jatamansi
Wei et al. Rapid identification of chemical components in Zhizi Baipi decoction by ultra‐performance liquid chromatography quadrupole time‐of‐flight mass spectrometry coupled with a novel informatics UNIFI platform
Wang et al. A novel chromatographic separation method for rapid enrichment and isolation of novel flavonoid glycosides from Sphaerophysa salsula
CN102688261A (zh) 一种凤尾草提取物及其制备方法和用途
Hui et al. A novel approach to characterize chemical consistency of traditional Chinese medicine Fuzi Lizhong pills by GC-MS and RRLC-Q-TOFMS
Fang et al. Targeted isolation of 1, 1‐diphenyl‐2‐picrylhydrazyl inhibitors from Saxifraga atrata and their antioxidant activities
CN103940942B (zh) 一种肠炎宁制剂的检测方法
CN107064334B (zh) 蒽贝素的质量控制方法
CN111233807B (zh) 一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法及其质量控制方法
CN111349140B (zh) 一种高纯度重楼皂苷ⅶ的制备方法及质量控制方法
Mbeunkui et al. Isolation and structural elucidation of indole alkaloids from Geissospermum vellosii by mass spectrometry
Chen et al. Mass spectrometric analysis strategies for pyrrolizidine alkaloids
Yun et al. Simultaneous determination of eight bioactive compounds in Dianthus superbus by high-performance liquid chromatography

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20191206

Assignee: GUANGXI WUZHOU SANHE PHARMACEUTICAL CO.,LTD.

Assignor: GUANGXI INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE & PHARMACEUTICAL SCIENCE

Contract record no.: X2023980044815

Denomination of invention: Preparation and Quality Detection Method of a High Purity Rhizoside

Granted publication date: 20230425

License type: Common License

Record date: 20231031

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract