CN101791366A - 一种对不同产地穿龙薯蓣及同属药材进行质量检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种对不同产地穿龙薯蓣及同属药材进行质量检测的方法，包括以下步骤，将待测药材粉末按样品溶液制备操作，在一定的色谱条件下测定，以外标法计算各样品中指标的含量，其特征在于选取薯蓣皂苷和原薯蓣皂苷作为含量测定指标。薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷是薯蓣属药材中的主要皂苷类成分，为穿龙薯蓣降血脂作用的有效成分，对控制药材和制剂的质量非常必要。本发明采用RP-HPLC分析方法检测所收集不同来源的穿龙薯蓣及薯蓣属药材中薯蓣皂苷和原薯蓣皂苷的含量，该方法灵敏、准确、专属，可用于药材、提取物及其制剂的质量控制。

Description

一种对不同产地穿龙薯蓣及同属药材进行质量检测的方法

技术领域

本发明涉及中药材质量检测的领域，尤其涉及一种对不同产地穿龙薯蓣及同属药材进行质量检测的方法。

背景技术

穿龙薯蓣以根茎入药，其有效成分主要为甾体皂苷类，包括薯蓣皂苷(dioscin)和延龄草苷(trillin)等异螺甾烷醇类皂苷，原薯蓣皂苷(protodioscin)和原纤细皂苷(protogracillin)等呋甾烷醇类皂苷。总皂苷水解产生薯蓣皂苷元(diosgenin，Dio)的平均含量为0.93％～2.26％。水溶性成分被分离出对-羟苄基酒石酸(Piscidicacid)，有较强的镇咳作用。根茎中尚分离出少量2，5-D-螺甾-3，5-二烯(25-D-Spirosta-3，5-diene)，此外，尚含有葡萄糖、鼠李糖、甾醇、尿囊素、树脂、淀粉和蛋白质等成分。

穿龙薯蓣具有消炎、祛痰、平喘、增加冠脉流量、降低血脂、改善心血管功能及抗菌和抗病毒等药理活性，还可减慢心率，增强心肌收缩力，增加每日尿量，改善冠脉循环，降低动脉血压，尤其适用于轻度动脉硬化。主治冠心病、风湿热、风湿关节炎、筋骨麻木、跌打损伤和支气管炎等症。近年来经研究证明，穿龙薯蓣还具有避孕和抗癌等作用，药用价值很高，是国内各大药厂开发新药、特药和中成药的主要原料之一，也是我国传统出口商品。

《中国药典》收载的穿龙薯蓣的鉴别和含量测定项下均是对薯蓣皂苷元的检测，同属其它四种药材均未收载含量测定项，而穿龙薯蓣及同属药材中含有的皂苷种类繁多，结构复杂，虽然制备含量测定用对照品比较困难，但它们都具有相同的基本骨架和官能团，可以借助骨架的通性或官能团的特性，对其进行测定，常采用重量法、比色法、旋光法、库仑法和薄层扫描法，陶莉等采用气相色谱法测定盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元的含量、赵景婵等采用正相高效液相色谱测定穿龙薯蓣中薯蓣皂苷元的含量、都述虎等采用反相高效液相色谱、二极管阵列检测器测定穿龙总皂苷中薯蓣皂苷元的含量，唐晓清等采用反相高效液相色谱、蒸发光散射检测器测定麦冬中甾体皂苷的含量。但这些定量方法操作繁杂，方法专属性不强，测定准确度不高。

穿龙薯蓣临床应用广泛，有着较好的开发前景。穿龙薯蓣的有效成分主要为甾体皂苷类，而甾体皂苷目前主要是用其苷元作为合成激素类药物的原料，以皂苷的形式作为药用的不多。因此对穿龙薯蓣中含有的活性化合物进行研究将有着重要的应用前景。此外，现有的穿龙薯蓣药材的质量标准比较粗糙，需要建立更完善的质量控制方法。

发明内容

本发明提供了一种对不同产地穿龙薯蓣及同属药材进行质量检测的方法，包括以下步骤，将待测药材粉末按样品溶液制备操作，在一定的色谱条件下测定，以外标法计算各样品中指标的含量，其特征在于选取薯蓣皂苷作为含量测定指标。

其中，样品溶液是将药材粉末用8～10倍量60～70％乙醇超声提取15～40min后，过滤制备得到。优选提取工艺为10倍量65％乙醇超声提取30min，可将药材中薯蓣皂苷提取完全，并且操作简单，重复性好。

样品经溶剂提取后，可以直接进样、正丁醇萃取后进样、乙酸乙酯-正丁醇两步萃取后进样，优选直接进样，操作简单，杂质无干扰，重复性好。

色谱条件为以ODS为固定相，体积比为55∶45的乙腈-水为流动相，检测波长为203nm，流速为1.0mL·min^-1，柱温为35℃，进样量为20μL。

理论塔板数按薯蓣皂苷计算不低于3000；薯蓣皂苷与相邻峰的分离度大于1.5；对称因子按薯蓣皂苷计算均在0.95～1.05之间。

按薯蓣皂苷确定标准曲线方程为：y＝4.139×10⁶x-7.023×10⁴(r＝0.9999)。

本发明提供了另一种对不同产地穿龙薯蓣及同属药材进行质量检测的方法，包括以下步骤，将待测药材粉末按样品溶液制备操作，在一定的色谱条件下测定，以外标法计算各样品中指标的含量，其特征在于选取原薯蓣皂苷作为含量测定指标。

其中，样品溶液是将药材粉末用8～10倍量20～50％乙醇超声提取15～40min后，过滤，乙酸乙酯-正丁醇两步萃取后制备得到。优选10倍量35％乙醇超声提取30min。当以35％乙醇作为提取溶剂时，原薯蓣皂苷提取效率高，干扰峰较少，分离度较好。样品经溶剂提取后，可以直接进样、正丁醇一步萃取后进样、乙酸乙酯-正丁醇两步萃取后进样，优选乙酸乙酯-正丁醇两步萃取后进样，杂质无干扰，重复性好。

色谱条件是：以ODS为固定相，体积比为27∶73的乙腈-水为流动相，检测波长为203nm，流速为1.0mL·min^-1，柱温为35℃，进样量为20μL。

理论塔板数按原薯蓣皂苷计算不低于1800；原薯蓣皂苷与相邻峰的分离度大于1.5；对称因子按原薯蓣皂苷计算均在0.95～1.05之间。

按原薯蓣皂苷确定标准曲线方程为：y＝4.462×10⁶x-1.428×10⁴(r＝0.9999)。

该属药材中所含甾体皂苷类成分种类繁多，结构相似，在紫外区处于末端吸收，分离难度较大。但是对于原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷的检测限和分析方法的精密度、重现性来说，紫外检测器可以达到药典对方法学的要求，考虑到紫外检测器较为常用，故选择其作为检测器。对于液相色谱条件，曾考察了不同填料的色谱柱，不同比例的甲醇-水，乙腈-水，乙腈-醋酸水溶液，乙腈-甲醇-水等流动相，结果表明以Xterra^TM ODS为固定相，乙腈-水为流动相，分离效果最好，灵敏度高。通过二极管阵列检测器检测，色谱峰纯度高，分析方法具有专属性。

薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷是薯蓣属药材中的主要皂苷类成分，为穿龙薯蓣降血脂作用的有效成分，因此用薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷作为含量测定指标，对控制药材和制剂的质量非常必要。本发明采用RP-HPLC分析方法测定所收集的27个不同来源的穿龙薯蓣及薯蓣属药材中薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷的含量，该方法灵敏、准确、专属，可用于药材、提取物及其制剂的质量控制。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例详细介绍本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

实验材料：

2695型高效液相色谱仪                美国Waters公司

2996型二级管阵列检测器              美国Waters公司

Empower工作站                       美国Waters公司

BP210S电子天平                      德国Sartorius公司

RE-52A旋转蒸发仪                    上海亚荣生化仪器厂

HH-2数字显示恒温水浴锅              常州国华仪器有限公司

甲醇(色谱纯)                        天津康科德科技有限公司

乙腈(色谱纯)                        天津四友生物医学技术有限公司

无水乙醇(分析纯)                    广州化学试剂厂

重蒸水                              自制

原薯蓣皂苷对照品(纯度99.5％)        自制

薯蓣皂苷对照品(纯度99.5％)          自制

样品收集：本研究收集了不同产地穿龙薯蓣及同属药材黄山药、山药、粉荜薢、绵荜薢样品共27个。

样品预处理：将干燥样品粉碎，过40目筛，置广口瓶中，密闭保存。一、薯蓣皂苷含量的测定

1、色谱条件

色谱柱：  Xterra^TM ODS(250mm×4.6mm，5μm)，美国Waters公司

流动相：  乙腈-水(55∶45，v/v)

检测波长：203nm

流速：  1.0mL·min^-1

柱温：  35℃

进样量：20μL

2、***适用性试验

取供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，理论塔板数按薯蓣皂苷计算不低于3000；薯蓣皂苷与相邻峰的分离度大于1.5；对称因子按薯蓣皂苷计算均在0.95～1.05之间；重复性好。

3、检测波长选择

取适量薯蓣皂苷对照品，用流动相溶解配成溶液，绘制紫外吸收光谱，薯蓣皂苷的最大吸收波长为203nm，本研究选择203nm为检测波长。

4、样品溶液制备

取药材粉末约0.5g，精密称定，置具塞100mL锥形瓶中，加入10倍量65％乙醇，密塞，超声处理30min。提取液滤过后，滤液置蒸发皿中蒸干，残渣加流动相溶解并定量转移至25mL量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液备用。此作为样品溶液。

5、标准曲线绘制

取薯蓣皂苷对照品约100mg，精密称定，置100mL量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，制成每1mL含薯蓣皂苷1.0mg的对照品溶液，摇匀。分别精密量取对照品溶液1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，6.0mL，8.0mL置于10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，分别得0.1mg·mL^-1，0.2mg·mL^-1，0.3mg·mL^-11，0.4mg·mL^-1，0.6mg·mL^-1，0.8mg·mL^-1系列对照品溶液。分别精密吸取各系列对照品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以对照品峰面积为纵坐标(y)，以对照品溶液浓度(mg·mL^-1)为横坐标，绘制标准曲线，结果表明：薯蓣皂苷在0.1～0.8mg·mL^-1范围内线性良好，所得回归曲线方程为：

y＝4.139×10⁶x-7.023×10⁴(r＝0.9999)，

6、仪器精密度试验

精密吸取薯蓣皂苷对照品溶液20μL，重复进样6次，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按上述色谱条件测定色谱峰面积，计算薯蓣皂苷色谱峰面积的相对标准差RSD＝0.2％(n＝6)。

7、重复性试验

称取同一批穿龙薯蓣样品(河南新乡)6份，精密称定，按“样品溶液的制备”项下方法操作，在上述色谱条件下，记录色谱图，以外标法计算含量，计算薯蓣皂苷含量的相对标准差RSD＝0.4％(n＝6)。

8、回收率试验

采用加样回收法，称取已知含量的穿龙薯蓣样品(河南新乡)9份，每份约0.25g，精密称定，分别精密加入低、中、高三种浓度薯蓣皂苷对照品溶液，按“样品溶液制备”项下操作。在上述色谱条件下测定，计算方法平均回收率。结果见表1。

表1、穿龙薯蓣样品的薯蓣皂苷的回收率

编号	原料(mg)	样品含量(mg)	加入量(mg)	回收率(％)	平均回收率(％)	RSD(％)
							1	8.22	5.567	2.805	94.6
2	8.23	5.489	2.805	97.8
							3	8.27	5.589	2.805	95.7
4	10.98	5.580	5.610	96.2
							5	11.14	5.542	5.610	99.7	97.9	2.0
6	11.13	5.489	5.610	100.0
							7	13.86	5.516	8.41	99.1
8	13.86	5.562	8.41	98.6
							9	13.90	5.583	8.41	98.8

9、稳定性

取同一对照品溶液，在室温下放置，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h和72h在上述色谱条件下进样分析，每次20μL，记录色谱峰面积，计算薯蓣皂苷峰面积的RSD＝1.7％，结果表明薯蓣皂苷对照品溶液在72h内稳定。

10、样品测定

取所收集的穿龙薯蓣及其薯蓣属干燥药材粉末，按“样品溶液制备”项下操作，在上述色谱条件下测定，以外标法计算各样品中薯蓣皂苷的含量，结果见表3。

二、原薯蓣皂苷含量的测定

1、色谱条件

色谱柱：  Xterra^TM ODS(250mm×4.6mm i.d.，5μm)美国Waters公司

流动相：  乙腈-水(27∶73，v/v)

检测波长：203nm

流速：    1.0mL·min^-1

柱温：    35℃

进样量：  20μL

2、***适用性试验

取供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，理论塔板数按原薯蓣皂苷计算不低于1800；原薯蓣皂苷与相邻峰的分离度大于1.5；对称因子按原薯蓣皂苷计算均在0.95～1.05之间；重复性好。

3、检测波长选择

取适量原薯蓣皂苷对照品，用流动相溶解配成溶液，绘制紫外吸收光谱，原薯蓣皂苷的最大吸收波长为203nm，本研究选择203nm为检测波长。

4、样品溶液制备

取药材粉末约0.5g，精密称定，置具塞100mL锥形瓶中，加入10倍量35％乙醇，密塞，超声处理30min。提取液滤过后蒸干，残渣加水20mL溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，合并水层，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20mL，合并正丁醇液，减压挥干溶剂，残渣加水溶解并定量转移至25mL量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液备用。此作为样品溶液。

5、标准曲线绘制

取原薯蓣皂苷对照品约100mg，精密称定，置100mL量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，制成每1mL含原薯蓣皂苷1.0mg的对照品溶液，摇匀。分别精密量取对照品溶液0.2mL，0.5mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，6.0mL置于10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，分别得0.02mg·mL^-1，0.05mg·mL^-1，0.1mg·mL^-1，0.2mg·mL^-1，0.3mg·mL^-1，0.6mg·mL^-1系列对照品溶液。分别精密吸取各系列对照品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以对照品峰面积为纵坐标(y)，以对照品溶液浓度(mg·mL^-1)为横坐标，绘制标准曲线，结果表明：原薯蓣皂苷在0.02～0.6mg·mL^-1范围内线性良好。所得回归曲线方程为：

y＝4.462×10⁶x-1.428×10⁴(r＝0.9999)。

6、仪器精密度试验

精密吸取原薯蓣皂苷对照品溶液20μL，重复进样6次，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按上述色谱条件测定色谱峰面积，计算原薯蓣皂苷色谱峰面积的相对标准差RSD＝0.2％(n＝6)。

7、重复性试验

称取同一批穿龙薯蓣样品(河南新乡)6份，精密称定，按“样品溶液制备”项下方法操作，在上述色谱条件下，记录色谱图，以外标法计算含量，计算原薯蓣皂苷的含量相对标准差RSD＝2.4％(n＝6)。

8、回收率试验

采用加样回收法，称取已知含量的穿龙薯蓣样品(河南新乡)9份，每份约0.25g，精密称定，分别精密加入低、中、高三种浓度原薯蓣皂苷对照品溶液，按“样品溶液制备”项下操作。在上述色谱条件下测定，计算方法平均回收率。结果见表2。

表2、穿龙薯蓣样品的原薯蓣皂苷回收率

9、稳定性

取同一对照品溶液，在室温下放置，分别于0、2、4、6、8、10、12、24、48和72h在上述色谱条件下进样分析，每次20μL，记录色谱峰面积，计算原薯蓣皂苷峰面积的RSD＝1.0％，结果表明原薯蓣皂苷对照品溶液在72h内稳定。

10、样品测定

取所收集的穿龙薯蓣及其薯蓣属干燥样品粉末，按“样品溶液制备”项下操作，在上述色谱条件下测定，以外标法计算各样品中原薯蓣皂苷的含量，结果见表3。

表3、外标法计算各样品中薯蓣皂苷和原薯蓣皂苷的含量

i：批号是121378-200401，ii：批号是121137-200402

“nd”意思是未检测到

结果表明，在5种薯蓣药材中穿龙薯蓣富含原薯蓣皂苷(含量范围为11.24～27.05mg·g^-1)，黄山药中含量次之，山药中含量较少，粉萆薢、绵萆薢中检测不到。在5种薯蓣药材中穿龙薯蓣中薯蓣皂苷含量较高(含量范围为17.31～28.59mg·g^-1)，黄山药中含量较少，而山药、粉萆薢、绵萆薢中检测不到。原因可能与药材的采收季节或药材的种属有关。

Claims (10)

1.一种对不同产地穿龙薯蓣及同属药材进行质量检测的方法，包括以下步骤，将待测药材粉末按样品溶液制备操作，在一定的色谱条件下测定，以外标法计算各样品中指标的含量，其特征在于选取薯蓣皂苷作为含量测定指标。

2.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述样品溶液是将药材粉末用8～10倍量60～70％乙醇超声提取15～40min后，过滤制备得到。

3.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述色谱条件为，以ODS为固定相，体积比为55：45的乙腈-水为流动相，检测波长为203nm。

4.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述理论塔板数按薯蓣皂苷计算不低于3000。

5.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，按薯蓣皂苷确定标准曲线方程为：y＝4.139×10⁶x-7.023×10⁴(r＝0.9999)。

6.一种对不同产地穿龙薯蓣及同属药材进行质量检测的方法，包括以下步骤，将待测药材粉末按样品溶液制备操作，在一定的色谱条件下测定，以外标法计算各样品中指标的含量，其特征在于选取原薯蓣皂苷作为含量测定指标。

7.如权利要求6所述的质量检测方法，其特征在于，所述样品溶液是将药材粉末用8～10倍量20～50％乙醇超声提取15～40min后过滤，乙酸乙酯-正丁醇两步萃取后制备得到。

8.如权利要求6所述的质量检测方法，其特征在于，所述色谱条件是以ODS为固定相，体积比为27∶73的乙腈-水为流动相，检测波长为203nm。

9.如权利要求6所述的质量检测方法，其特征在于，所述理论塔板数按原薯蓣皂苷计算不低于1800。

10.如权利要求6所述的质量检测方法，其特征在于，按原薯蓣皂苷确定标准曲线方程为：y＝4.462×10⁶x-1.428×10⁴(r＝0.9999)。