CN102526561B

CN102526561B - 一种三金制剂的检测方法

Info

Publication number: CN102526561B
Application number: CN 201110028317
Authority: CN
Inventors: 邹节明; 周艳林; 云强
Original assignee: Guilin Sanjin Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Guilin Sanjin Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2031-01-26
Also published as: CN102526561A

Abstract

本发明涉及一种三金制剂的质量控制方法，包括采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量的步骤，其中，该方法还包括采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的步骤。本发明在HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷含量的基础上增加了HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量，使三金制剂的质量控制指标更加全面；本发明方法精密度、重现性、稳定性好。

Description

一种三金制剂的检测方法

技术领域

本发明涉及一种药物制剂的检测方法，特别是涉及一种中药制剂，三金片的检测方法。

背景技术

三金制剂是由金樱根、金刚刺（菝葜）、金沙藤、羊开口、积雪草等五味中药经过提取加工制成的中药制剂，市场上已有销售，其药理作用为：抗菌，抗炎，消肿，清热，利尿，镇痛，抗氧自由基，提高机体免疫力等。功能主治为：清热解毒，利湿通淋，益肾。用于下焦湿热、热淋，小便短赤，淋沥涩痛；急、慢性肾盂肾炎、膀胱炎、***属肾虚湿热下注证者。三金片的配方和质量控制方法已经列入2000年版中国药典。并于2003年修订增加了含量测定项，修订后的质量标准中对三金片的描述如下：

【处方】金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草

【制法】以上五味，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.15～1.20（50～60℃）的清膏，干燥；加入辅料适量，混匀，制成颗粒，压制成1000片（小片）或600片（大片），包衣，即得。

【性状】本品为糖衣片或薄膜衣片，除去包衣后，显棕色至黑褐色；味酸、涩、微苦。

【鉴别】（1）取本品15片（小片）或10片（大片），除去包衣，研细，加乙醇15ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.01mol/L的氢氧化钠溶液20ml，微热使溶解，用***10ml振摇提取，弃去***提取液，水层再用醋酸乙酯10ml振摇提取，醋酸乙酯提取液浓缩至1ml，作为供试品溶液（水层备用）。另取金樱根对照药材2.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2000年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇（17:3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显一个以上相同的斑点。

（2）取【鉴别】（1）项下的水层，用水饱和的正丁醇15ml提取，分取正丁醇层，用正丁醇饱和的水5ml洗涤，弃去水层，正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取积雪草苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2000年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（7:3:0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

【检查】应符合片剂项下有关的各项规定（中国药典2000年版一部附录I D）

【含量测定】取本品50片（小片）或30片（大片），除去包衣，精密称取，研细，取约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，密塞，精密称定，超声处理（功率160W，频率50kHz）45分钟，放冷，精密称定，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液50ml，蒸干，残渣加0.05mol/L的氢氧化钠溶液30ml，使溶解，用水饱和的正丁醇提取3次，每次20ml，弃去水层，合并正丁醇层，用正丁醇饱和的水洗涤两次，每次10ml，弃去水层，正丁醇液减压蒸发至干，残渣加适量甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，作为供试品溶液。另取积雪草苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2000年版一部附录VI B）进行扫描，波长：λS=550nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。

本品每片含积雪草以积雪草苷（C₄₈H₇₈O₁₉）计，小片不得少于0.18mg；大片不得少于0.30mg。

【功能与主治】清热解毒，利湿通淋，益肾。用于下焦湿热，热淋，小便短赤、淋沥涩痛；急、慢性肾盂肾炎，膀胱炎，***属肾虚湿热下注证者。

【用法与用量】口服，大片一次3片，小片一次5片，一日3～4次。

【规格】（1）小片相当于原药材2.1g（2）大片相当于原药材3.5g

【贮藏】密封。

由于上述标准采用的质量控制含量测定方法是传统的薄层色谱法（TLCS法），存在精密度、重现性、稳定性较差，显色不稳定、测定偏差大的不足。

申请号为200510200471.8的中国专利申请涉及一种治疗泌尿***等疾病的三金药物制剂及制备方法和质量控制方法,它是将金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草制成药剂学上可以接受的剂型,得到的制剂崩解性好,生物利用度高,特别是它们的辅料用量都比较少,特别适合老年人及吞服药片或胶囊有困难的患者服用,本发明还提供了这种制剂的质量控制方法,能够保证制备的制剂质量并方便工业化生产的要求;与现有技术相比,提供的药物制剂用于对急、慢性肾盂肾炎,慢性***等疾病的治疗,有比较好的效果;本发明提供的制备工艺先进,简单易行;而且本发明提供的这些制剂不良反应小、可供病人长期使用。该申请中所涉及的质量控制方法包括（1）金樱根药材、积雪草苷、薯蓣皂苷元的薄层色谱鉴别测试方法；（2）三金制剂中积雪草苷、羟基积雪草苷全部或部分成分的含量测试方法。该方法依旧采用了薄层色谱法（TLCS法），依旧存在精密度、重现性、稳定性较差，显色不稳定、测定偏差大的不足。

由于上述缺陷，申请人于2004年7月2日提出了申请号为200410050066.8的中国专利申请，并授予了发明专利权。该专利公开了一种三金制剂的新的质量控制方法，该方法包括含量测定项，含量测定采用的是HPLC-ELSD法。

本发明人在此基础上又进行了大量的研究，并经***的分离研究发现，野蔷薇苷与蔷薇苷为金樱根的特征性活性成分，而金樱根又是三金制剂的必须组分，故增加野蔷薇苷与蔷薇苷为控制三金制剂质量的指标成分是十分必要的。而现有的质量标准及质量控制方法均不含野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的测定，可见，现有的质量标准及质量控制方法对三金制剂的质量检测不够全面，对质量控制依旧存在着一定的缺陷，势必存在一定的用药风险。鉴于此，本发明人提供一种新的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三金制剂的检测方法，在ZL200410050066.8的基础上改进了含量测定方法，通过有效成分野蔷薇苷和/或蔷薇苷的HPLC-ELSD法含量测定，更加准确的把握有关药品的质量，降低用药风险，提高产品质量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种三金制剂的检测方法，包括采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量的步骤，其中，该方法还包括采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的步骤。

本发明人经***的分离研究发现，野蔷薇苷与蔷薇苷为金樱根的特征性活性成分，而金樱根又是三金制剂的必须组分，故增加野蔷薇苷与蔷薇苷为控制三金制剂质量的指标成分是十分必要的。本发明首次引入野蔷薇苷和/或蔷薇苷的质量含量，从而使三金制剂的质量控制指标更加全面。

根据前述的检测方法，其中，所述的采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的步骤包括色谱条件与***适应性试验、对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定。

根据前述的检测方法，其中，所述色谱条件与***适应性试验是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为48:52的甲醇-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测，理论板数按野蔷薇苷峰计算应不低于2000。

根据前述的检测方法，其中，所述对照品溶液的制备采用以下方法：分别取野蔷薇苷与蔷薇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，即得。

本发明所述野蔷薇苷与蔷薇苷对照品采用如下方法自制：将金樱根的根茎，粉碎，用提取溶剂提取后，将提取液减压浓缩，进行溶剂萃取或上大孔树脂吸附，并依次用水、30％、40～90％乙醇洗脱，收集40～90％乙醇洗脱物，回收溶剂，再将萃取物或洗脱物经过柱层析分离，或将提取液浓缩至干后，直接经过柱层析分离；将含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分再次经过硅胶柱层析分离，收集含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，得野蔷薇苷和蔷薇苷粗晶，再加入重结晶试剂反复重结晶即得。

根据前述的检测方法，其中，所述供试品溶液的制备采用以下方法：取三金片30片小片或20片大片，除去包衣，精密称定，研细，取约1.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz条件下超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

根据前述的检测方法，其中，所述野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定的步骤中，含量测定采用以下方法，分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl与供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算野蔷薇苷、蔷薇苷的含量，即得；本品每片含金樱根以野蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，小片不得少于0.10mg；大片不得少于0.16mg；含金樱根以蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，小片不得少于0.10mg；大片不得少于0.16mg。

根据前述的检测方法，其中所述采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量包括如下步骤：

照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ D）测定；

色谱条件与***适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为48:52的甲醇-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测或使用紫外检测器检测，检测波长210nm，理论板数按羟基积雪草苷峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：分别取羟基积雪草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含0.2mg的溶液和每1ml含0.6mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本品30小片或20大片，除去包衣，精密称定，研细，取约1.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz的条件下超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取上述两种浓度的对照品溶液各10μl与供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得；本品每片含积雪草以羟基积雪草苷（C₄₈H₇₈O₂₀）计，小片不得少于0.22mg；大片不得少于0.35mg。

本发明人意外地发现，采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量的过程其供试品溶液的制备与采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量时其供试品溶液的制备方法完全一样，在采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量的基础上不需要另外配制供试品溶液，从而简化了质量控制过程，节约了成本。

本发明所述的检测方法还进一步包括对三金制剂进行鉴别的步骤。

所述鉴别采用薄层色谱法。

所述的薄层色谱法包括如下步骤：

（1）取三金片15小片或10大片，除去包衣，研细，加乙醇15ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.01mol／L氢氧化钠溶液20ml，微热使溶解，用***10ml振摇提取，弃去***液，水液再用乙酸乙酯1Oml振摇提取，水溶液备用；乙酸乙酯液浓缩至约1ml，作为供试品溶液；另取金樱根对照药材2.5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各1Oμl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷–甲醇(17：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显两个或两个以上相同颜色的主斑点；

（2）取（1）项下的水溶液，用水饱和的正丁醇15ml提取，分取正丁醇液，用正丁醇饱和的水5ml洗涤，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取积雪草苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（7:3:0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（3）取三金片10小片或6大片，除去包衣，研细，加乙醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液加盐酸5ml，加热回流2小时，放冷，用40％氢氧化钠溶液调至中性，蒸至无醇味，残渣加热水40ml使溶解，用二氯甲烷振摇提取2次(40ml，30ml)，合并二氯甲烷提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取菝葜对照药材5g，同法制成对照药材溶液；再取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷–乙酸乙酯(4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显两个或两个以上相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（4）取三金片15小片或10大片，研细，加甲醇100ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约10ml，加在100～200目、5g、内径1cm的中性氧化铝柱上，用甲醇50ml洗脱，收集流出液与洗脱液，蒸干，残渣加水20ml溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取羊开口对照药材5g，加水100ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷–丙酮–水(6：14：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

本发明所述方法不仅可检测三金片，还可以检测三金制剂的任何其他剂型，如：糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。还可以检测以积雪草、蔷薇苷、野蔷薇苷为原料的制剂、积雪草药材及其提取物、蔷薇苷药材及其提取物、野蔷薇苷及其提取物。

本发明的特点在于：

1、本发明在HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷含量的基础上增加了HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量，使三金制剂的质量控制指标更加全面；

2、本发明方法精密度、重现性、稳定性好。

附图说明

图1为野蔷薇苷对照品线性回归方程，其回归方程为：Y=0.6482X-7.3328，r=0.9992；

图2为蔷薇苷对照品线性回归方程，其回归方程为：Y=0.8516X-8.9913，r=0.9993；

图3为野蔷薇苷与蔷薇苷混合对照液相色谱图（ELSD），其中野蔷薇苷Rt=42.394min;蔷薇苷Rt=32.135min；

图4为样品液相色谱图（ELSD），其中野蔷薇苷Rt=42.256min;蔷薇苷Rt=32.086min；

图5为三金片0910136批（ELSD）；

图6为三金片0910144批（ELSD）；

图7为三金片0910160批（ELSD）；

图8为三金片0910167批（ELSD）；

图9为三金片0910175批（ELSD）；

图10为三金片0910181批（ELSD）；

图11为三金片0910183批（ELSD）；

图12为三金片0910191批（ELSD）；

图13为三金片0910192批（ELSD）；

图14为三金片0911005批（ELSD）；

图15为三金片0911006批（ELSD）；

图16为三金片0911021批（ELSD）；

图17为野蔷薇苷与蔷薇苷混合对照液相色谱图（UV），其中野蔷薇苷Rt=42.394min;蔷薇苷Rt=32.135min；

图18为三金片0910136批（UV）；

图19为三金片0910144批（UV）；

图20为三金片0910160批（UV）；

图21为三金片0910167批（UV）；

图22为三金片0910175批（UV）；

图23为三金片0910181批（UV）；

图24为三金片0910183批（UV）；

图25为三金片0910191批（UV）；

图26为三金片0910192批（UV）；

图27为三金片0911005批（UV）；

图28为三金片0911006批（UV）；

图29为三金片0911021批（UV）。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。

【实施例1】

野蔷薇苷与蔷薇苷含量测定为新增的【含量测定】标准。

金樱根为三金片方中主要药味，本发明人经***的分离研究发现，野蔷薇苷与蔷薇苷为金樱根的特征性活性成分，故增加野蔷薇苷与蔷薇苷为控制本品质量的指标成分是十分必要的。本标准在羟基积雪草苷含量测定的基础上增加了HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷与蔷薇苷的含量，使三金片的质量控制指标更加全面。

1、仪器与试剂

仪器：Waters2695高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器（Alltech-ELSD2000），(紫外检测器为Waters996),Empower色谱工作站。

试剂：甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

对照品：自制，因《中国药典》未收载野蔷薇苷与蔷薇苷化学对照品，故本发明人对野蔷薇苷与蔷薇苷进行了分离制备，并按《中药新药质量标准研究用对照品研究技术要求》进行了结构确证和纯度检查，在选定的色谱条件下测定，按归一化法计算含量为98.5％，结果表明所制备的野蔷薇苷和蔷薇苷化学对照品符合含量测定用对照品要求。

野蔷薇苷与蔷薇苷对照品采用如下方法自制：将金樱根的根茎，粉碎，用提取溶剂提取后，将提取液减压浓缩，进行溶剂萃取或上大孔树脂吸附，并依次用水、30％、40～90％乙醇洗脱，收集40～90％乙醇洗脱物，回收溶剂，再将萃取物或洗脱物经过柱层析分离，或将提取液浓缩至干后，直接经过柱层析分离；将含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分再次经过硅胶柱层析分离，收集含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，得野蔷薇苷和蔷薇苷粗晶，再加入重结晶试剂反复重结晶即得。

具体地说采用如下方法自制：取新鲜金樱根根茎10Kg，粉碎，用60%乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，浓缩得浸膏。浸膏加蒸馏水1000mL使均匀分散，加同样体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯，浓缩回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏。乙酸乙酯浸膏用硅胶柱层析粗分离，以氯仿/甲醇（10：0～0：10）梯度洗脱，每个梯度洗脱3000mL，TLC检测合并相同部分，得到9个主要部分。其中富含野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，以氯仿/甲醇（10：1）为洗脱剂进行硅胶柱层析，收集富含野蔷薇苷的馏分，在体积比为10:1的氯仿/甲醇混合溶液中重结晶，得白色不定型固体，即野蔷薇苷；收集富含蔷薇苷的馏分，以55%甲醇为洗脱剂反复进行中压反相柱层析，在体积比为10:1的氯仿/甲醇混合溶液中重结晶，得白色不定型固体，即蔷薇苷。

2、色谱条件的选择

色谱柱：Nova-pak C18（3.9×150mm，4um）;

流动相：甲醇-水（48：52）;流速：0.8ml/min;

漂移管温度：90℃；气体流速：2.4L/min；

在流动相选择中，试验了不同比例的甲醇-水***的分离效果，结果以甲醇-水（48：52）为最佳，保留时间适宜，分离效果能满足要求。

在选定的条件下，三批供试品的野蔷薇苷与蔷薇苷色谱峰的分离度、理论板数的结果见表1。

表1、野蔷薇苷与蔷薇苷理论板数和分离度的结果

野蔷薇苷与左侧蔷薇苷峰分离度：R₁=2（t_R-t_R1）/（W+W₁）

t_R—为相邻两峰中后一峰的保留时间

t_R1—为相邻两峰中前一峰的保留时间

W、W₁此相邻两峰的峰宽

根据试验结果，考虑到仪器、色谱柱、流动相的配制和温度等***因素的影响，规定理论板数按野蔷薇苷峰计算，应不低于2000。

3、线性范围的考察

对照品溶液的制备：取经105℃干燥至恒重的野蔷薇苷与蔷薇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液（野蔷薇苷实取54.25mg，蔷薇苷实取51.20mg，定容至50ml，即分别为1.085mg/ml、1.024mg/ml），即得。

测定：分别精密吸取混合对照品溶液溶液1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积的自然对数为横坐标，以进样量的自然对数为纵坐标，回归计算，得线性方程，测定结果见表2，表3。

表2、野蔷薇苷对照品线性考察结果

以上结果表明，在进样量1.085～10.85μg范围内，野蔷薇苷峰面积的自然对数与进样量的自然对数有良好的线性关系。

表3、蔷薇苷对照品线性考察结果

以上结果表明，在进样量1.024～10.24μg范围内，蔷薇苷峰的自然对数与进样量的自然对数有良好的线性关系。

4、供试品溶液制备方法的研究

（1）提取溶剂的选择

分别考察50%甲醇，80%甲醇，甲醇，乙醇作为提取试剂，对比不同溶剂对提取效果的影响。具体方法为：

取本品（批号0910021）60片，除去包衣，精密称定，研细，分别取约1.5g，精密称定，精密加入不同提取溶剂50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）45分钟，放冷，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，进样10μl，结果见表4。

表4、提取溶剂的选择

实验结果表明80%甲醇与甲醇提取效果基本相当，但80%甲醇提取时，杂质较多，后期处理容易乳化。故选择甲醇作为提取溶剂。

（2）提取方法及提取时间的考察。

试验考察超声提取，索氏提取，加热回流提取三种提取方法，不同提取时间对提取达平衡的影响。

超声提取具体为：取本品（批号0910021）60片，除去包衣，精密称定，研细，分别取约1.5g，精密称定，精密加入甲醇溶剂50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）不同时间，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。

索氏提取具体为：取本品（批号0910021）60片，除去包衣，精密称定，研细，分别取约1.5g，精密称定，置索氏提取器中，精密加入甲醇50ml，分别提取4小时，8小时，12小时。提取液回收溶剂至干，从“残渣加水20ml”起与超声处理同法操作，制成供试品溶液。

加热回流提取具体为：取本品（批号0910021）60片，除去包衣，精密称定，研细，分别取约1.5g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，分别加热回流1小时，2小时，4小时。从“放冷，再称定重量”起与超声处理同法操作，制成供试品溶液。

上述供试品溶液进样10μl，测定结果见表5。

表5、不同提取方法及提取时间的考察

不同提取方法及时间	野蔷薇苷的含量（μg/片）	蔷薇苷的含量（μg/片）
			超声提取30分钟	302.4	323.7
超声提取45分钟	345.3	378.8
			超声提取60分钟	348.1	379.4
索氏提取4小时	292.5	313.6
			索氏提取8小时	326.9	355.8
索氏提取12小时	345.4	374.2
			加热回流1小时	316.8	339.5

加热回流2小时	344.2	376.1
			加热回流4小时	346.3	377.8

实验结果表明，超声处理45min已达平衡状态，且与索氏提取12小时，加热回流提取2小时效果基本相当。故提取方法定为：超声处理45min。

（3）纯化方法的考察

试验采用传统的皂苷纯化方法。即：样品的甲醇提取液，蒸干后的残渣用碱水溶解，以水饱和正丁醇振摇提取，继以水洗涤正丁醇提取液的方法。

试验另选用乙酸乙酯作为提取液，作为比较。结果见表6。

表6、纯化方法考察

纯化溶剂	正丁醇	乙酸乙酯
			野蔷薇苷的含量（μg/片）	344.6	345.2
蔷薇苷的含量（μg/片）	378.5	376.7

结果表明，正丁醇或乙酸乙酯提取效果基本一致，但是在试验操作过程中发现，乙酸乙酯提取时，溶液更容易乳化，处理时间较长，且从提取溶液颜色及供试品色谱图来看，乙酸乙酯提取的杂质更多。因此，选用正丁醇作为纯化的提取溶剂。

（4）正丁醇提取次数的选择

为考察正丁醇提取次数，在提取3次后，继续用水饱和的正丁醇提取第4次、第5次，分别减压蒸发至干，残渣用甲醇1ml溶解，进样，结果表明第4次水饱和正丁醇振摇提取液中已无野蔷薇苷及蔷薇苷，故振摇提取3次，野蔷薇苷及蔷薇苷已能提取完全。故纯化方法采用水饱和正丁醇提取3次。

5、精密度试验

取本品（批号0910021）20片，按正文[含量测定]项下方法制备供试品溶液，进样20μl，重复进样6次，测定野蔷薇苷与蔷薇苷面积值，并分别计算含量，结果见表7。

表7、精密度试验结果

以上结果表明，所用液相色谱仪的精密度良好。

6、稳定性试验

取供试品溶液（批号0910021），在室温下保存，分别于0、1、2、4、6、8、24小时的时间间隔，精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定野蔷薇苷与蔷薇苷峰面积值，并分别计算含量，结果见表8。

表8、稳定性试验结果

试验结果表明，供试品溶液在24小时内测定，其相对偏差分别为2.78%、2.83%，说明供试品溶液在24小时内测定，结果保持稳定。

7、重现性试验

取同一批号(0910021批)的三金片6份，分别依法制备供试品溶液，分别测得峰面积值，并分别计算野蔷薇苷与蔷薇苷含量，RSD分别为：3.38%、3.73%，结果见表9。试验结果表明，方法重现性良好。

表9、重现性试验结果

8、加样回收试验

取与重现性试验同一批号的三金片（含量测定结果为：野蔷薇苷335.3μg/片，蔷薇苷379.6μg/片，平均片重：0.2790g）约0.75g，平行6份，精密称定，分别精密加入野蔷薇苷与蔷薇苷混合对照品溶液（浓度分别为：1.085μg/ml、1.024μg/ml）1ml，依法制备加样回收供试品溶液，测定结果，以下列公式计算回收率，结果见表10，表11。

表10、野蔷薇苷加样回收试验结果

表11、蔷薇苷加样回收试验结果

试验结果表明：回收率在95％～100％之间，加样回收良好。

9、样品测定

（1）按照野蔷薇苷与蔷薇苷【含量测定】方法测定十二批三金片（薄膜衣大片）中野蔷薇苷与蔷薇苷的含量，测定结果见表12。

表12、三金片（大片）十二批含量测定结果

根据以上测定结果，所测的共12批三金片（大片）中野蔷薇苷的含量波动范围为89.3～354.0μg/片，蔷薇苷的含量波动范围为85.4～376.3μg/片。可见含量波动较大，平均含量分别为204.7μg/片、202.6μg/片；为避免由于药材含量差异、操作等因素造成的含量波动，以平均含量的80％制定限度，故含量限度暂定为：本品每片含金樱根以野蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，大片不得少于0.16mg；含金樱根以蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，大片不得少于0.16mg。

因暂未有小片样品供测定，故按处方量折算，将小片含量暂定为：本品每片含金樱根以野蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，小片不得少于0.10mg；含金樱根以蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，小片不得少于0.10mg。与大片的含量限度相统一。

虽然所测的成分无明显的紫外吸收，但在本实验的分离条件下，采用紫外检测器，在210nm检测波长下，也能实现有效测定，同时采用紫外检测器检测并计算十二批样品含量结果见表13。

表13、三金片（大片）十二批含量测定结果（紫外检测方法）

根据以上测定结果可见，紫外检测方法结果与蒸发光散射检测器检测方法结果基本一致，因此，上述两种检测器，均可作为本品种的含量测定检测器。（紫外检测方法谱图详见图17至图29）

实施例2

该实施例所提供的三金片的检测方法包括采用高效液相色谱法测定三金片中的药物有效成分积雪草苷和羟基积雪草苷的含量和采用高效液相色谱法测定三金片中的药物有效成分野蔷薇苷和蔷薇苷的含量。具体方法如下：

三金片，按照药典提供的方法制备，或购买于广西或中国的任何一家医药商店，由桂林三金制药有限公司生产并提供。

含量测定：

（1）采用高效液相色谱法测定三金片中的药物有效成分积雪草苷和羟基积雪草苷，具体操作方法见中国药典2010年版一部附录VI D。

供试品溶液的制备：取本品20大片，除去包衣，精密称定，研细，取约1.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz的条件下超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取上述两种浓度的对照品溶液各10μl与供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得；本品每片含积雪草以羟基积雪草苷（C₄₈H₇₈O₂₀）计，大片不得少于0.35mg。

（2）采用高效液相色谱法测定三金片中的药物有效成分野蔷薇苷和蔷薇苷，具体操作方法见中国药典2010年版一部附录VI D。

色谱条件与***适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水（48:52）为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按野蔷薇苷峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备：分别取野蔷薇苷与蔷薇苷对照品（采用实施例1中所述的方法自制）适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,即得。

供试品溶液的制备：取三金片20大片，除去包衣，精密称定，研细，取约1.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl与供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算野蔷薇苷、蔷薇苷的含量，即得。

本品每片含金樱根以野蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，大片不得少于0.16mg；含金樱根以蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，大片不得少于0.16mg。

实施例3

含量测定：

供试品溶液的制备：取三金片30小片，除去包衣，精密称定，研细，取约1.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz的条件下超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取上述两种浓度的对照品溶液各10μl与供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得；本品每片含积雪草以羟基积雪草苷（C₄₈H₇₈O₂₀）计，小片不得少于0.22mg。

供试品溶液的制备：取三金片30小片，除去包衣，精密称定，研细，取约1.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

本品每片含金樱根以野蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，小片不得少于0.10mg；含金樱根以蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，小片不得少于0.10mg。

实施例4

该实施例所提供的三金片的检测方法包括采用高效液相色谱法测定三金片中的药物有效成分积雪草苷和羟基积雪草苷的含量、采用高效液相色谱法测定三金片中的药物有效成分野蔷薇苷和蔷薇苷的含量、以及对三金片进行鉴别的步骤，其中积雪草苷和羟基积雪草苷的含量测定、野蔷薇苷和蔷薇苷的含量测定同实施例2，鉴别的步骤是采用薄层色谱法鉴别，具体步骤如下：

（1）取三金片10大片，除去包衣，研细，加乙醇15ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.01mol／L氢氧化钠溶液20ml，微热使溶解，用***10ml振摇提取，弃去***液，水液再用乙酸乙酯1Oml振摇提取，水溶液备用；乙酸乙酯液浓缩至约1ml，作为供试品溶液；另取金樱根对照药材2.5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各1Oμl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷–甲醇(17：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显两个或两个以上相同颜色的主斑点；

（3）取三金片6大片，除去包衣，研细，加乙醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液加盐酸5ml，加热回流2小时，放冷，用40％氢氧化钠溶液调至中性，蒸至无醇味，残渣加热水40ml使溶解，用二氯甲烷振摇提取2次(40ml，30ml)，合并二氯甲烷提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取菝葜对照药材5g，同法制成对照药材溶液；再取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷–乙酸乙酯(4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显两个或两个以上相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（4）取三金片10大片，研细，加甲醇100ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约10ml，加在100～200目、5g、内径1cm的中性氧化铝柱上，用甲醇50ml洗脱，收集流出液与洗脱液，蒸干，残渣加水20ml溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取羊开口对照药材5g，加水100ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷–丙酮–水(6：14：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

实施例5

该实施例所提供的三金片的检测方法包括采用高效液相色谱法测定三金片中的药物有效成分积雪草苷和羟基积雪草苷的含量、采用高效液相色谱法测定三金片中的药物有效成分野蔷薇苷和蔷薇苷的含量、以及对三金片进行鉴别的步骤，其中积雪草苷和羟基积雪草苷的含量测定、野蔷薇苷和蔷薇苷的含量测定同实施例3，鉴别的步骤是采用薄层色谱法鉴别，具体步骤如下：

（1）取三金片15小片，除去包衣，研细，加乙醇15ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.01mol／L氢氧化钠溶液20ml，微热使溶解，用***10ml振摇提取，弃去***液，水液再用乙酸乙酯1Oml振摇提取，水溶液备用；乙酸乙酯液浓缩至约1ml，作为供试品溶液；另取金樱根对照药材2.5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各1Oμl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷–甲醇(17：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显两个或两个以上相同颜色的主斑点；

（3）取三金片10小片，除去包衣，研细，加乙醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液加盐酸5ml，加热回流2小时，放冷，用40％氢氧化钠溶液调至中性，蒸至无醇味，残渣加热水40ml使溶解，用二氯甲烷振摇提取2次(40ml，30ml)，合并二氯甲烷提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取菝葜对照药材5g，同法制成对照药材溶液；再取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷–乙酸乙酯(4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显两个或两个以上相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（4）取三金片15小片，研细，加甲醇100ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约10ml，加在100～200目、5g、内径1cm的中性氧化铝柱上，用甲醇50ml洗脱，收集流出液与洗脱液，蒸干，残渣加水20ml溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取羊开口对照药材5g，加水100ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷–丙酮–水(6：14：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

试验例1

该试验例对采用本发明实施例1中所述的方法自制的野蔷薇苷和蔷薇苷对照品的化学结构进行了鉴定。

gjy-4：2α,3β,19α-三羟基乌苏-12烯-28酸,28-O-β-D-葡萄糖苷；野蔷薇苷；Rosamultin；

¹H-NMR（CD₃OD）δ：0.77（3H，s），0.81（3H，s），0.93（3H，d，J=6.5Hz，H-30），1.01（6H，s），1.20（3H，s），1.33（3H，s），2.51（1H，s，H-18），2.91（1H，d，J=9.6Hz，H-3），5.31（1H，brs，H-12），5.32（1H，d，J=8.0Hz，H-1′）；

¹³C-NMR（CD₃OD）δ：48.2（t，C-1），69.5（d，C-2），84.5（d，C-3），40.5（s，C-4），56.7（d，C-5），19.7（t，C-6），34.1（t，C-7），41.3（s，C-8），48.6（d，C-9），39.2（s，C-10），24.8（t，C-11），129.5（d，C-12），139.7（s，C-13），42.7（s，C-14），29.6（t，C-15），26.5（t，C-16），49.5（s，C-17），54.9（d，C-18），73.7（s，C-19），42.9（d，C-20），27.2（t，C-21），38.3（t，C-22），29.4（q，C-23），16.7（q，C-24），17.2（q，C-25），17.7（q，C-26），24.7（q，C-27），178.5（s，C-28），27.1（q，C-29），17.5（q，C-30），95.8（d，C-1′），73.8（d，C-2′），78.5（d，C-3′），71.1（d，C-4′），78.3（d，C-5′），62.4（t，C-6′）。

gjy-6：2α,3α,19α-三羟基乌苏-12-烯-28酸,28-O-β-D-葡萄糖苷；蔷薇苷；Euscaphicoside；刺梨苷；Kajiichigoside F1；

1H-NMR（CD3OD）δ：0.76（3H，s），0.88（3H，s），0.92（3H，d，J=6.5Hz，H-30），0.97（3H，s），0.98（3H，s），1.25（3H，s），1.32（3H，s），2.50（1H，s，H-18），3.32（1H，brs，H-3），3.92（1H，m，H-2），5.30（1H，brs，H-12），5.32（1H，d，J=8.0Hz，H-1′）；

13C-NMR（CD3OD）δ：42.8（t，C-1），67.2（d，C-2），80.1（d，C-3），39.5（s，C-4），49.3（d，C-5），19.3（t，C-6），34.0（t，C-7），41.4（s，C-8），48.2（d，C-9），39.4（s，C-10），24.7（t，C-11），129.6（d，C-12），139.7（s，C-13），42.7（s，C-14），29.6（t，C-15），26.6（t，C-16），49.6（s，C-17），55.0（d，C-18），73.6（s，C-19），43.0（d，C-20），27.3（t，C-21），39.0（t，C-22），29.3（q，C-23），22.4（q，C-24），16.9（q，C-25），17.6（q，C-26），24.8（q，C-27），178.5（s，C-28），27.0（q，C-29），16.6（q，C-30），95.8（d，C-1′），73.8（d，C-2′），78.6（d，C-3′），71.1（d，C-4′），78.3（d，C-5′），62.4（t，C-6′）。

Claims

1.一种三金制剂的检测方法，包括采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量的步骤，其特征在于，该方法还包括采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的步骤；所述的采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的步骤包括色谱条件与***适应性试验、对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定；所述野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定的步骤中，含量测定采用以下方法:分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl与供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算野蔷薇苷、蔷薇苷的含量，即得；本品每片含金樱根以野蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，小片不少于0.10mg；大片不少于0.16mg；含金樱根以蔷薇苷（C₃₆H₅₈O₁₀）计，小片不少于0.10mg；大片不少于0.16mg。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件与***适应性试验是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为48:52的甲醇-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测，理论板数按野蔷薇苷峰计算不低于2000。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备采用以下方法：分别取野蔷薇苷与蔷薇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，即得。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述野蔷薇苷与蔷薇苷对照品采用如下方法自制：将金樱根的根茎，粉碎，用提取溶剂提取后，将提取液减压浓缩，进行溶剂萃取或上大孔树脂吸附，并依次用水、30％、40～90％乙醇洗脱，收集40～90％乙醇洗脱物，回收溶剂，再将萃取物或洗脱物经过柱层析分离，或将提取液浓缩至干后，直接经过柱层析分离；将含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分再次经过硅胶柱层析分离，收集含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，得野蔷薇苷和蔷薇苷粗晶，再加入重结晶试剂反复重结晶即得。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备采用以下方法：取本品30片小片或20片大片，除去包衣，精密称定，研细，取约1.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz条件下超声处45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量包括如下步骤：

照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定；

色谱条件与***适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为48:52的甲醇-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测或使用紫外检测器检测，检测波长210nm，理论板数按羟基积雪草苷峰计算不低于2000；

测定法：分别精密吸取上述两种浓度的对照品溶液各10μl与供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得；本品每片含积雪草以羟基积雪草苷（C₄₈H₇₈O₂₀）计，小片不少于0.22m_g；大片不少于0.35m_g。