CN111315747B - 二氢吡唑酮并嘧啶类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种二氢吡唑酮并嘧啶类化合物，其制备方法及其用途。具体地，本申请涉及式I所示化合物，含有所述化合物的药物组合物和药物制剂，以及所述化合物的制备方法及其用于制备预防或治疗Wee1蛋白相关疾病的药物的用途。
Description
技术领域
本申请涉及一种二氢吡唑酮并嘧啶类化合物，其制备方法及其用途。
背景技术
细胞周期是一个高度调节和控制的过程，由一系列蛋白质、新陈代谢和微环境相互作用形成的复杂网络密切调控，目的在于使细胞仅按照特定的刺激和适当的条件进行增殖(S.Diaz-Moralli，M.Tarrado-Castellarnau，A.Miranda，M.Cascante，Pharmacology&Therapeutics，2013，138：255-271)。标准的细胞周期依次会经历G1期、S期(DNA合成期)、G2期和M期(细胞***期)。在G1-S转换、S期、G2-M转换等期间具有若干周期阻滞检查点，用于维持基因组的完整性，并在进入有丝***前为修复损伤性DNA提供时间。作为对DNA损伤的回应，细胞周期检查点可以在G1/S期、S期和G2/M期等阶段激活，并诱导细胞周期停滞，直到完成修复；如果修复不成功，将驱动细胞衰老或细胞凋亡(R.Visconti，M.R.Della，D.Grieco，Journal of Experimental&Clinical Cancer Research，2016，35：153)。
Wee1蛋白激酶是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员，是细胞周期G2/M检查点的关键元件，在细胞***的调度上起关键作用(C.J.Matheson，D.S.Backos，P.Reigan，Trendsin Pharmacological Sciences，2016，37：872)。从G2/M检查点进入到有丝***取决于CDK1(也称CDC2)的磷酸化状态和细胞周期素B的结合状态。在有丝***前，Wee1磷酸化CDK1的Tyr15位点，然后髓磷脂转录因子(MYT1)磷酸化CDK1的Thr14位点，维持CDK1的非活性状态，抑制细胞进入M期。故Wee1是细胞从G2期进入M期的负向调节器。
因此，抑制Wee1激酶活性从而移除G2/M检查点的功能是一种有潜力的策略来驱动肿瘤细胞进入到计划外的有丝***，从而经历有丝***障碍而导致细胞死亡。这种细胞未完成DNA复制而被迫进入有丝***的方式，对细胞的毒性很大，代表一种新颖的诱导肿瘤细胞死亡的机制。因此，Wee1抑制剂作为药物具有良好的应用前景。专利WO2007126128报道了某些化合物表现出Wee1蛋白激酶抑制剂的活性。
为了满足更好的肿瘤治疗效果、更安全或低副作用的药物需求，本申请将提供一种新型结构的Wee1蛋白激酶抑制剂，并发现此类结构的化合物表现出优异的Wee1蛋白抑制作用和药效持续时间。
发明内容
本申请的一方面提供一种具有Wee1蛋白激酶抑制活性的二氢吡唑酮并嘧啶类化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，所述化合物具有以下式I的结构：
其中，
X选自CH和N；
R1选自羟基-C1-6烷基-、C1-6烷氧基-C1-6烷基-和氰基-C3-6环烷基-；
R2选自7-10元稠杂环基，所述7-10元稠杂环基任选被一个或多个C1-6烷基取代，各C1-6烷基可以相同或不同；或R2选自哌啶基，所述哌啶基任选被一个或多个-NR5R6取代；R5、R6各自独立地选自C1-6烷基；
R3选自C1-6烷基和C2-6烯基；
R4选自氢和卤素。
在部分优选的实施方案中，所述化合物具有以下式I-1的结构：
其中，X、R1、R2、R3和R4定义如通式I所述。
在部分优选的实施方案中，所述化合物具有以下式I-2的结构：
其中，R1和R2定义如通式I所述。
本申请的另一方面提供一种制备式(I)化合物的方法：
式中，Hal1为卤素(例如F、Cl或Br)；Hal2为卤素(例如Cl、Br或I)、硼酸基团或硼酸酯基团；R1、R2、R3、R4和X的意思与上述通式I相同。
在部分实施方案中，本申请还提供了一种制备式I-2化合物的方法：
式中，Hal1为卤素(例如F、Cl或Br)；Hal2为卤素(例如Cl、Br或I)、硼酸基团或硼酸酯基团；PG为保护基，可选自苄基、对甲氧基苄基、叔丁氧羰基、苄氧基羰基，优选叔丁氧羰基；R1和R2的定义与前文通式I-2相同。
本申请的另一方面提供一种药物组合物，其含有所述化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，以及一种或多种药学上可接受的载体。
本申请的另一方面提供一种制备所述药物组合物的方法，所述方法包括将所述化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药与一种或多种药学上可接受的载体组合。
本申请的另一方面提供一种药物制剂，其含有所述化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，或者所述药物组合物。
本申请的另一方面提供所述化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、所述药物组合物或所述药物制剂在制备用于预防或治疗Wee1蛋白激酶相关疾病中的用途，优选地，所述疾病为癌症。
本申请的另一方面提供所述化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药或者所述药物组合物，其用于治疗Wee1蛋白激酶相关疾病，优选地，所述疾病为癌症。
本申请的另一方面提供预防或治疗Wee1蛋白激酶相关疾病的方法，所述方法包括向有此需要的个体给药有效量的所述化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，或者所述药物组合物；优选地，所述疾病为癌症。
定义
除非在下文中另有定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本文中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
如本文中所使用，术语“烷基”定义为直链或支链的饱和脂肪族烃基。在一些实施方案中，烷基具有1至12个，例如1至6个碳原子。例如，如本文中所使用，术语“C1-6烷基”指具有1至6个碳原子的直链或支链的基团(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基或正己基)，其任选地被一个或多个(诸如1至3个)适合的取代基如卤素取代(此时该基团被称作“卤代烷基”，例如CF3、C2F5、CHF2、CH2F、CH2CF3、CH2Cl或-CH2CH2CF3等)。
如本文中所使用，术语“环烷基”指饱和或部分不饱和的非芳族单环或多环(诸如双环)烃环(例如单环，诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基，或双环，包括螺环、稠合或桥连***(诸如双环[1.1.1]戊基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.2.1]辛基或双环[5.2.0]壬基、十氢化萘基等)，其任选地被一个或多个(诸如1至3个)适合的取代基取代。所述环烷基具有3至15个，例如3至6个碳原子。例如，术语“C3-6环烷基”指具有3至6个成环碳原子的饱和或部分不饱和的非芳族单环或多环(诸如双环)烃环(例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基)，其任选地被一个或多个(诸如1至3个)适合的取代基取代，例如甲基取代的环丙基。
如本文中所使用，术语“卤代”或“卤素”基团定义为包括氟、氯、溴或碘。
如本文中所使用，术语“烷氧基”意指通过氧原子连接至母体分子部分的如上文所定义的烷基。C1-6烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。
如本文中所使用，术语“杂环基”指饱和或部分不饱和的单环或多环基团，例如其在环中具有2、3、4、5、6、7、8或9个碳原子和一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，例如但不限于环氧乙烷基、氮丙啶基、氮杂环丁基(azetidinyl)、氧杂环丁基(oxetanyl)、四氢呋喃基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、咪唑烷基、吡唑烷基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、二噻烷基(dithianyl)、硫吗啉基、哌嗪基、三噻烷基(trithianyl)等，相应地，术语“稠杂环基”指每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环基，其中的一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子***，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。
术语“取代”指所指定的原子上的一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)氢被从所指出的基团的选择代替，条件是未超过所指定的原子在当前情况下的正常原子价并且所述取代形成稳定的化合物。取代基和/或变量的组合仅仅当这种组合形成稳定的化合物时才是允许的。
如果取代基被描述为“任选地被....取代”，则取代基可(1)未被取代或(2)被取代。如果取代基的碳被描述为任选地被取代基列表中的一个或多个取代，则碳上的一个或多个氢(至存在的任何氢的程度)可单独和/或一起被独立地选择的任选的取代基替代。如果取代基的氮被描述为任选地被取代基列表中的一个或多个取代，则氮上的一个或多个氢(至存在的任何氢的程度)可各自被独立地选择的任选的取代基替代。
如果取代基被描述为“独立地选自”一组基团，则各取代基独立于另一者被选择。因此，各取代基可与另一(其他)取代基相同或不同。
如本文中所使用，术语“一个或多个”意指在合理条件下的1个或超过1个，例如2个、3个、4个、5个或10个。
除非指明，否则如本文中所使用，取代基的连接点可来自取代基的任意适宜位置。
当取代基的键显示为穿过环中连接两个原子的键时，则这样的取代基可键连至该可取代的环中的任一成环原子。
本发明还包括所有药学上可接受的同位素标记的化合物，其与本发明的化合物相同，除了一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于在自然界中占优势的原子质量或质量数的原子替代。适合包含入本发明的化合物中的同位素的实例包括(但不限于)氢的同位素(例如2H、3H)；碳的同位素(例如11C、13C及14C)；氯的同位素(例如37Cl)；氟的同位素(例如18F)；碘的同位素(例如123I及125I)；氮的同位素(例如13N及15N)；氧的同位素(例如15O、17O及18O)；磷的同位素(例如32P)；及硫的同位素(例如35S)。某些同位素标记的本发明的化合物(例如掺入放射性同位素的那些)可用于药物和/或底物组织分布研究(例如分析)中。放射性同位素氚(即3H)及碳-14(即14C)因易于掺入且容易检测而特别可用于该目的。用正电子发射同位素(例如11C、18F、15O及13N)进行取代可在正电子发射断层显像术(PET)研究中用于检验底物受体占据情况。被同位素标记的本发明的化合物可通过与描述于随附路线和/或实施例及制备中的那些类似的方法通过使用适当的被同位素标记的试剂代替之前采用的非标记的试剂来制备。本发明的药学上可接受的溶剂合物包括其中结晶溶剂可被同位素取代的那些，例如，D2O、丙酮-d6或DMSO-d6。
术语“立体异构体”表示由于至少一个不对称中心形成的异构体。在具有一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)不对称中心的化合物中，其可产生外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单独的非对映异构体。特定个别分子也可以几何异构体(顺式/反式)存在。类似地，本发明的化合物可以两种或更多种处于快速平衡的结构不同的形式的混合物(通常称作互变异构体)存在。互变异构体的代表性实例包括酮-烯醇互变异构体、苯酚-酮互变异构体、亚硝基-肟互变异构体、亚胺-烯胺互变异构体等。例如，二氢嘧啶基团在溶液中可以下列互变异构形式平衡存在。要理解，本申请的范围涵盖所有这样的以任意比例(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的异构体或其混合物。
本文中可使用实线(——)、实楔形
或虚楔形
描绘所述化合物的碳-碳键。使用实线以描绘键连至不对称碳原子的键欲表明，包括该碳原子处的所有可能的立体异构体(例如，特定的对映异构体、外消旋混合物等)。使用实或虚楔形以描绘键连至不对称碳原子的键欲表明，存在所示的立体异构体。当存在于外消旋混合物中时，使用实及虚楔形以定义相对立体化学，而非绝对立体化学。除非另外指明，否则所述化合物意欲可以立体异构体(其包括顺式及反式异构体、光学异构体(例如R及S对映异构体)、非对映异构体、几何异构体、旋转异构体、构象异构体、阻转异构体及其混合物)的形式存在。所述化合物可表现一种以上类型的异构现象，且由其混合物(例如外消旋混合物及非对映异构体对)组成。
本申请涵盖所述化合物的所有可能的结晶形式或多晶型物，其可为单一多晶型物或多于一种多晶型物的任意比例的混合物。
还应当理解，本申请的某些化合物可以游离形式存在用于治疗，或适当时，以其药学上可接受的衍生物形式存在。在本申请中，药学上可接受的衍生物包括但不限于：药学上可接受的盐、溶剂合物、代谢物或前药，在将它们向需要其的患者给药后，能够直接或间接提供本发明的化合物或其代谢物或残余物。因此，当在本文中提及“本申请的化合物”或“所述化合物”时，也意在涵盖所述化合物的上述各种衍生物形式。
本申请的化合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐及碱加成盐。
适合的酸加成盐由形成药学可接受盐的酸来形成。实例包括乙酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐(naphthylate)、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐及其它类似的盐。
适合的碱加成盐由形成药学可接受盐的碱来形成。实例包括铝盐、精氨酸盐、胆碱盐、二乙胺盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐及其它类似的盐。
适合的盐的综述参见Stahl及Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use”(Wiley-VCH，2002)。用于制备本申请的化合物的药学上可接受的盐的方法为本领域技术人员已知的。
本申请的化合物可以溶剂合物(优选水合物)的形式存在，其中本申请的化合物包含作为所述化合物晶格的结构要素的极性溶剂，特别是例如水、甲醇或乙醇。极性溶剂特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比存在。
本申请还包括所述化合物的代谢物，即在给药所述化合物时体内形成的物质。这样的产物可由例如被给药的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、脱酯化、酶解等产生。因此，本申请包括所述化合物的代谢物，包括通过使所述化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的时间的方法制得的化合物。
本申请进一步包括所述化合物的前药，其为自身可具有较小药理学活性或无药理学活性的所述化合物的某些衍生物当被给药至身体中或其上时可通过例如水解裂解转化成具有期望活性的所述化合物。通常这样的前药会是所述化合物的官能团衍生物，其易于在体内转化成期望的治疗活性化合物。关于前药的使用的其他信息可参见“Pro-drugs asNovel Delivery Systems”，第14卷，ACS Symposium Series(T.Higuchi及V.Stella)及“Bioreversible Carriers in Drug Design，”Pergamon Press，1987(E.B.Roche编辑，American Pharmaceutical Association)。所述前药可例如通过用本领域技术人员已知作为“前-部分(pro-moiety)(例如“Design of Prodrugs”，H.Bundgaard(Elsevier，1985)中所述)”的某些部分替代本申请的化合物中存在的适当官能团来制备。
本申请还涵盖含有保护基的所述化合物。在制备所述化合物的任何过程中，保护在任何有关分子上的敏感基团或反应基团可能是必需的和/或期望的，由此形成所述化合物的化学保护的形式。这可以通过常规的保护基实现，例如，在Protective Groups inOrganic Chemistry，ed.J.F.W.McOmie，Plenum Press，1973；和T.W.Greene&P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley&Sons，1991中所述的那些保护基，这些参考文献通过援引加入本文。使用本领域已知的方法，在适当的后续阶段可以移除保护基。
术语“约”是指在所述数值的±10％范围内，优选±5％范围内，更优选±2％范围内。
化合物
本申请的一个目的在于提供一种化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，所述化合物具有以下式I的结构：
其中，
X选自CH和N；
R1选自羟基-C1-6烷基-、C1-6烷氧基-C1-6烷基-和氰基-C3-6环烷基-；
R2选自7-10元稠杂环基，所述7-10元稠杂环基任选被一个或多个C1-6烷基取代，各C1-6烷基可以相同或不同；或R2选自哌啶基，所述哌啶基任选被一个或多个-NR5R6取代；R5、R6各自独立地选自C1-6烷基；
R3选自C1-6烷基和C2-6烯基；
R4选自氢和卤素。
在部分优选的实施方案中，所述化合物具有式I-1所示结构，
其中，X、R1、R2、R3和R4定义如通式I所述。
在部分实施方案中，式I或式I-1中X为CH。
在部分实施方案中，式I或式I-1中X为N。
在部分实施方案中，式I或式I-1中R1选自羟基-C1-4烷基-、C1-3烷氧基-C1-4烷基-和氰基-C3-6环烷基-。在一些优选的实施方案中，R1选自2-羟基丙-2-基、2-甲氧基丙-2-基和1-氰基环丙-1-基。
在部分实施方案中，式I或式I-1中R2选自7-10元双环稠杂环基，所述7-10元双环稠杂环基任选被一个或多个C1-6烷基(例如C1-4烷基、C1-2烷基)取代。在一些实施方案中，R2选自8元稠杂环基，所述8元稠杂环基被一个C1-6烷基(例如C1-4烷基、C1-2烷基)取代。在一些优选的实施方案中，R2选自8元双环稠杂环基，所述8元双环稠杂环基被一个C1-6烷基(例如C1-4烷基、C1-2烷基)取代。在一些优选的实施方案中，R2选自
在一些优选的实施方案中，R2为5-甲基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基。
在部分实施方案中，式I或式I-1中R2为哌啶基，所述哌啶基被一个或多个-NR5R6取代，R5、R6各自独立地选自C1-4烷基。在一些优选的实施方案中，R2为哌啶基，所述哌啶基被一个或多个-NR5R6取代，R5、R6各自独立地选自C1-2烷基。在一些优选的实施方案中，R2为
R5、R6各自独立地选自C1-6烷基(例如C1-4烷基、C1-2烷基)。在一些优选的实施方案中，R2为4-二甲氨基哌啶-1-基。
在部分实施方案中，式I或式I-1中R3选自C1-4烷基和C2-4烯基。在一些优选的实施方案中，R3选自烯丙基和异丙基。
在部分实施方案中，式I或式I-1中R4选自氢、氟、氯和溴。在部分实施方案中，R4选自氢和氟。在部分实施方案中，R4为氢。在部分实施方案中，R4为氟。
在部分实施方案中，所述化合物具有式I-2所示结构，
其中，R1和R2定义如通式I中所定义。
在部分实施方案中，R1选自羟基-C1-6烷基-、C1-6烷氧基-C1-6烷基-和氰基-C3-6环烷基-。
在部分实施方案中，R2选自7-10元稠杂环基，所述7-10元稠杂环基任选被一个或多个C1-6烷基取代，各C1-6烷基可以相同或不同；或R2选自哌啶基，所述哌啶基被一个或多个-NR5R6取代，R5、R6各自独立地选自C1-6烷基。
在部分实施方案中，R1选自羟基-C1-4烷基-、C1-3烷氧基-C1-4烷基-和氰基-C3-6环烷基-；优选地，R1选自2-羟基丙-2-基、2-甲氧基丙-2-基和1-氰基环丙-1-基。
在部分实施方案中，R2选自8元稠杂环基，所述8元稠杂环基被一个C1-6烷基取代；
优选地，R2选自8元双环稠杂环基，所述8元双环稠杂环基被一个C1-6烷基(例如C1-4烷基、C1-2烷基)取代；
优选地，R2选自
更优选地，R2为5-甲基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基。
在部分实施方案中，R2选自
R5、R6各自独立地选自C1-6烷基(例如C1-4烷基、C1-2烷基)；优选地，R2为4-二甲氨基哌啶-1-基。
在部分实施方案中，所述化合物具有上述式I-2的结构，
其中，R1选自羟基-C1-6烷基-、C1-6烷氧基-C1-6烷基-和氰基-C3-6环烷基-；
R2选自7-10元稠杂环基，所述7-10元稠杂环基任选被一个或多个C1-6烷基取代，各C1-6烷基可以相同或不同；或R2选自哌啶基，所述哌啶基被一个或多个-NR5R6取代，R5、R6各自独立地选自C1-6烷基。
在部分实施方案中，所述化合物具有上述式I-2的结构，
其中，R1选自羟基-C1-4烷基-、C1-3烷氧基-C1-4烷基-和氰基-C3-6环烷基-；优选地，R1选自2-羟基丙-2-基、2-甲氧基丙-2-基和1-氰基环丙-1-基；
R2选自8元稠杂环基，所述8元稠杂环基被一个C1-6烷基取代；优选地，R2选自
优选地，R2为5-甲基六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-基；
或者，R2选自
R5、R6各自独立地选自C1-6烷基；优选地，R2为4-二甲氨基哌啶-1-基。
在部分实施方案中，所述化合物具有以下结构：
制备方法
本申请的另一目的是提供制备式(I)化合物的方法：
式中，Hal1为卤素(例如F、Cl或Br)；Hal2为卤素(例如Cl、Br或I)、硼酸基团或硼酸酯基团；R1、R2、R3、R4和X的意思与前文通式I相同。
(1)使化合物IN-1与肼类化合物反应以得到化合物IN-2；
在一些实施方案中：化合物IN-1可以与烷基肼类化合物反应得到化合物IN-2，所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二噁烷及其任意组合，优选四氢呋喃。所述反应优选在适合的有机碱存在下进行。所述有机碱可选自三乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、二异丙基乙胺，优选二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为50-70℃。所述反应优选进行合适的时间，例如6-16小时。
在另一些实施方案中：化合物IN-1也可以先与水合肼反应，再与醛类化合物通过还原反应得到化合物IN-2。与水合肼的反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二噁烷及其任意组合，优选乙醇。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为0-25℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-6小时。与醛类化合物的还原反应优选在适合的有机溶剂中和还原剂的存在下进行。所述溶剂可选自甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、乙腈，优选甲醇。所述还原剂可选自氰基硼***、三乙酰氧基硼氢化钠、硼氢化钠等，优选氰基硼***。反应温度通常优选为0-25℃，反应时间通常优选为1-3小时。
(2)使化合物IN-2环化以得到化合物IN-3；
所述环化反应优选在适合的有机溶剂中进行。有机溶剂可选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、二噁烷及其任意组合，优选乙醇。所述环化使用的碱可选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾等无机碱，优选氢氧化钠。所述环化反应温度通常优选为室温(20-30℃)，所述环化反应时间通常优选为0.5-2小时。
(3)使化合物IN-3与化合物IN-4反应以得到化合物IN-5；
使化合物IN-3与化合物IN-4发生偶联反应以得到化合物IN-5。所述偶联反应优选在金属催化剂和碱的存在下进行。优选地，所述金属催化剂是铜盐催化剂，优选为碘化亚铜、醋酸铜等。所述碱是无机碱，例如碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、2，2-联吡啶、磷酸钾，优选碳酸钾。所述偶联反应的配体选自反式-N，N’-二甲基-1，2-环己二胺、N，N’-二甲基乙二胺，优选反式-N，N’-二甲基-1，2-环己二胺。所述偶联反应的溶剂选自苯、甲苯、二噁烷、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚等或其混合溶剂，优选二噁烷和二甲基甲酰胺。所述偶联反应温度通常优选为80-110℃。反应时间通常优选为4-6小时。
(4)使化合物IN-5氧化得到化合物IN-6；
该氧化反应可以优选在适合的有机溶剂中和氧化剂的存在下进行。所述溶剂可选自苯、甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、二甲基甲酰胺等，优选乙腈。所述氧化剂可选自间氯过氧苯甲酸、过一硫酸氢钾复合盐等，优选过一硫酸氢钾复合盐。反应温度通常优选为室温(20-30℃)，反应时间通常优选为0.5-3小时。
(5)使化合物IN-6与化合物IN-7反应以得到式I的化合物；
所述反应优选在惰性溶剂中进行，包括甲苯、苯、氯仿、二噁烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜等或其混合溶剂，优选甲苯。所述反应优选在适合的有机碱存在下进行，所述有机碱可选自三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶等，优选二异丙基乙胺。反应温度通常优选为60-120℃，反应时间通常优选为4-12小时。
本申请的又一目的是提供制备式I-2化合物的方法：
式中，Hal1为卤素(例如F、Cl或Br)；Hal2为卤素(例如Cl、Br或I)、硼酸基团或硼酸酯基团；PG为保护基，可选自苄基、对甲氧基苄基、叔丁氧羰基、苄氧基羰基，优选叔丁氧羰基；R1和R2的定义与前文通式I-2相同。
(1)使化合物IN-1与化合物IN-8反应以得到化合物IN-9；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二噁烷及其任意组合，优选四氢呋喃。所述反应优选在适合的有机碱存在下进行。所述有机碱可选自三乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、二异丙基乙胺，优选二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为50-70℃。所述反应优选进行合适的时间，例如6-16小时。
(2)使化合物IN-9去除保护基PG以得到化合物IN-10；
该去除保护基PG的反应可以应用在有机化学领域中熟知的羧酸酯的水解反应方法，在其中保护基PG为叔丁氧羰基的实施方案中，所述反应优选在酸存在下通过酯的酸解反应来进行。所述酸可以是无机酸或者合适的有机酸包括但不限于盐酸、硫酸、甲酸、三氟乙酸；所述反应溶剂可选自二噁烷、二氯甲烷、乙酸乙酯或他们的混合溶剂，酸也可作为反应溶剂，优选三氟醋酸。所述反应温度通常优选为40-70℃。所述反应时间通常优选为1-3小时。
(3)使化合物IN-10环化以得到化合物IN-11；
所述环化反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、二噁烷及其任意组合，优选乙醇。所述环化反应使用的碱可选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾等无机碱，优选氢氧化钠。所述环化反应温度通常优选为室温(20-30℃)，所述环化反应时间通常优选为0.5-2小时。
(4)使化合物IN-11与化合物IN-12反应以得到化合物IN-13；
使化合物IN-11与化合物IN-12发生偶联反应以得到化合物IN-13。所述偶联反应优选在金属催化剂和碱的存在下进行。所述金属催化剂是铜盐催化剂，优选为碘化亚铜、醋酸铜等。所述碱是无机碱，例如碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、2，2-联吡啶、磷酸钾，优选碳酸钾。所述偶联反应的配体选自反式-N，N’-二甲基-1，2-环己二胺、N，N’-二甲基乙二胺，优选反式-N，N’-二甲基-1，2-环己二胺。所述偶联反应的溶剂选自苯、甲苯、二噁烷、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚等或其混合溶剂，优选二噁烷和二甲基甲酰胺。所述偶联反应温度优选为80-110℃。反应时间优选为4-6小时。
(5)使化合物IN-13氧化得到化合物IN-14；
该氧化反应可以优选在适合的有机溶剂中和氧化剂的存在下进行。所述溶剂可选自苯、甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、二甲基甲酰胺等，优选乙腈。所述氧化剂可选自间氯过氧苯甲酸、过一硫酸氢钾复合盐等，优选过一硫酸氢钾复合盐。反应温度通常优选为室温(20-30℃)，反应时间通常优选为0.5-3小时。
(6)使化合物IN-14与化合物IN-15反应以得到式I-2的化合物；
所述反应优选在惰性溶剂中进行，所述惰性溶剂选自甲苯、苯、氯仿、二噁烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜等或其混合溶剂，优选甲苯。所述反应优选在适合的有机碱存在下进行，所述有机碱可选自三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶等，优选二异丙基乙胺。所述反应温度优选为60-120℃，所述反应时间通常优选为4-12小时。
在制备通式I或通式I-2的化合物时，可能需要保护中间体的远端官能团(例如羟基或氨基)。对这种保护的需要可随着远端官能团的性质以及制备方法的条件而改变。关于保护基的概述及它们的用途，参见T.W.Greene，Protective Groups in OrganicSynthesis，John Wiley&Sons，New York，1991。
药物组合物和药物制剂
本申请的另一目的在于提供一种药物组合物，其包含预防或治疗有效量的所述化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，以及一种或多种药学上可接受的载体。
本文中“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。
所述药物组合物中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物通过静脉内给药时，水是示例性载体。还可以使用生理盐水和葡萄糖及甘油水溶液作为液体载体，特别是用于注射液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述组合物还可以视需要包含少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。口服制剂可以包含标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药学上可接受的载体的实例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)中所述。
所述药物组合物可以***地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以适合的途径给药，例如通过注射(如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射，包括滴注)或经皮给药；或者通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。
对于这些给药途径，可以适合的剂型给药所述药物组合物。所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂等。
所述化合物在药物组合物中的含量或用量可以是约0.01mg至约1000mg，适合地是0.1-500mg，优选0.5-300mg，更优选1-150mg。
本申请的另一目的在于提供一种制备所述药物组合物的方法，所述方法包括将所述化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药与一种或多种药学上可接受的载体组合。
本申请的另一目的在于提供一种药物制剂，其包含所述化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者它们的混合物，或者所述药物组合物。
治疗方法和用途
本申请的另一目的在于提供所述化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者所述药物组合物在制备用于预防或治疗Wee1蛋白激酶相关疾病的药物中的用途。在部分实施方案中，所述Wee1蛋白激酶相关疾病为癌症。
本申请的另一目的在于提供所述化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者所述药物组合物，其用于预防或治疗Wee1蛋白激酶相关疾病。在部分实施方案中，所述Wee1蛋白激酶相关疾病为癌症。
本申请的另一目的在于提供预防或治疗Wee1蛋白激酶相关疾病的方法，所述方法包括向需要其的个体给药有效量的所述化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，或者所述药物组合物。在部分实施方案中，所述Wee1蛋白相关疾病为癌症。
在部分实施方案中，所述癌症包括但不限于头颈癌、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和子宫内膜癌。
如本文中所使用的术语“有效量”指被给药后会在一定程度上缓解所治疗病症的一或多种症状的化合物的量。
可调整给药方案以提供最佳所需响应。例如，可给药单次推注，可随时间给药数个分剂量，或可如治疗情况的急需所表明而按比例减少或增加剂量。要注意，剂量值可随要减轻的病况的类型及严重性而变化，且可包括单次或多次剂量。要进一步理解，对于任何特定个体，具体的给药方案应根据个体需要及给药组合物或监督组合物的给药的人员的专业判断来随时间调整。
所述化合物的给药量会取决于所治疗的个体、病症或病况的严重性、给药的速率、化合物的处置及处方医师的判断。一般而言，有效剂量在每日每kg体重约0.0001至约50mg，例如约0.01至约10mg/kg/日(单次或分次给药)。对70kg的人而言，这会合计为约0.007mg/日至约3500mg/日，例如约0.7mg/日至约700mg/日。在一些情况下，不高于前述范围的下限的剂量水平可以是足够的，而在其它情况下，仍可在不引起任何有害副作用的情况下采用较大剂量，条件是首先将所述较大剂量分成数个较小剂量以在一整天中给药。
除非另外说明，否则如本文中所使用，术语“治疗”意指逆转、减轻、抑制这样的术语所应用的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种症状的进展，或预防这样的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种症状。
如本文所使用的“个体”包括人或非人动物。示例性人个体包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人个体(称为患者)或正常个体。本文中“非人动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。
具体实施方式
实施例
为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，以下结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。并且，下列实施例中未提及的具体实验方法，均按照常规实验方法进行。
本文中的缩写具有以下含义：
| 缩写 | 含义 |
| TLC | 薄层色谱法 |
| LC-MS | 液相色谱-质谱联用 |
| DIPEA | N，N-二异丙基乙胺 |
| <![CDATA[CD<sub>3</sub>OD]]> | 氘代甲醇 |
| <![CDATA[CDCl<sub>3</sub>]]> | 氘代氯仿 |
| <![CDATA[DMSO-d<sub>6</sub>]]> | 六氘代二甲基亚砜 |
| TMS | 四甲基硅烷 |
| NMR | 核磁共振 |
| MS | 质谱 |
| s | 单峰(singlet) |
| d | 二重峰(doublet) |
| t | 三重峰(triplet) |
| q | 四重峰(quartet) |
| dd | 双二重峰(double doublet) |
| m | 多重峰(multiplet) |
| J | 偶合常数 |
| Hz | 赫兹 |
以下实施例中记载的化合物的结构通过1H-NMR或MS来确证。1H-NMR的测定仪器使用Bruker 400MHz核磁共振仪，测定溶剂为CD3OD、CDCl3或DMSO-d6，内标物质为TMS，全部δ值用ppm值表示。质谱(MS)的测定仪器使用Agilent(ESI)质谱仪，型号为Agilent 6120B。
薄层色谱硅胶板(TLC)使用Merck产的铝板(20×20cm)，薄层层析分离纯化采用的是GF254(0.4～0.5mm)。
反应的监测采用薄层色谱法(TLC)或LC-MS，使用的展开剂体系有：二氯甲烷和甲醇体系，正己烷和乙酸乙酯体系，石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节或者加入三乙胺等进行调节。
微波反应使用
Initiator+(400W，RT～300℃)微波反应器。
柱层析一般使用200～300目硅胶为载体。洗脱剂的体系包括：二氯甲烷和甲醇体系，石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺进行调节。
制备高效液相色谱仪，仪器型号：Agilent 1260，色谱柱：Waters XBridge PrepC18 OBD(19mm×150mm×5.0μm)；色谱柱温：25℃；流速：20.0mL/min；检测波长：214nm；洗脱梯度：(0min：10％A，90％B；16.0min：90％A，10％B)；流动相A：100％乙腈；流动相B：0.05％碳酸氢铵水溶液。
除非特别指出，实施例的反应温度为室温(20℃～30℃)。
本申请中所使用的试剂购自Acros Organics、Aldrich Chemical Company、上海特伯化学科技有限公司等。
中间体的制备：
中间体制备例1：2-烯丙基-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
第一步：4-(2-烯丙基-2-(叔丁氧基羰基)肼基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯的制备
4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(20g，85.8mmol)、1-烯丙基肼碳酸叔丁酯(15g，85.8mmol)和DIPEA(28g，215mmol)加入四氢呋喃(200mL)中并加热回流搅拌18小时。反应液冷却，减压蒸馏除去反应溶剂，向残渣中加入***(100mL)，过滤析出的固体，滤液浓缩得到本步的标题化合物(31.7g，收率：100％)。
MS m/z(ESI)：369.2[M+H]+。
第二步：4-(2-烯丙基肼基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯的制备
在冰浴下向4-(2-烯丙基-2-(叔丁氧基羰基)肼基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(31.7g，85.8mmol)中加入三氟乙酸(60mL)，室温搅拌1小时，70℃加热1小时，浓缩反应液得到本步的标题化合物(23g，收率：100％)。
MS m/z(ESI)：269.1[M+H]+。
第三步：2-烯丙基-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
4-(2-烯丙基肼基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(10g，38.2mmol)溶于乙醇(70mL)，冰浴下加入6N氢氧化钠的水溶液(140mL)，室温搅拌15分钟，用浓盐酸调pH值至1，减压蒸馏除去乙醇，过滤，所得固体用***洗，干燥后得到标题化合物(16g，收率：83％)。
MS m/z(ESI)：223.1[M+H]+。
中间体制备例2：2-(6-溴吡啶-2-基)丙-2-醇的制备
6-溴吡啶-2-甲酸甲酯(5g，23.1mmol)溶于***(100mL)中，氮气保护下加入甲基碘化镁(17mL，50.8mmol)，室温搅拌0.5小时，向反应液中加水和2N盐酸，乙酸乙酯萃取3次，有机层合并后依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩滤液得到标题化合物(5g，收率：100％)。
MS m/z(ESI)：216.0[M+H]+。
中间体制备例3：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
第一步：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
2-烯丙基-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(2g，9.0mmol)、2-(6-溴吡啶-2-基)丙-2-醇(2.5g，11.7mmol)、碘化亚铜(1.7g，9.0mmol)、碳酸钾(1.7g，12.6mmol)和反式-N，N’-二甲基-1，2-环己二胺(1.4g，9.9mmol)加入二氧六环(35mL)中，95℃反应4小时，冷却至室温后，加入氨水，乙酸乙酯萃取3次，有机相合并浓缩，残渣用硅胶柱层析色谱分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1)，得到本步的标题化合物(2.6g，收率：81％)。
MS m/z(ESI)：358.1[M+H]+。
第二步：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(200mg，0.56mmol)溶于乙腈(5mL)和水(5mL)中，加入过一硫酸氢钾复合盐(282mg，1.68mmol)，室温搅拌2小时，加水，用乙酸乙酯萃取3次，有机相合并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液得到标题化合物(200mg，收率：96％)。
MS m/z(ESI)：374.1[M+H]+。
中间体制备例4：1-(6-溴吡啶-2-基)环丙基甲腈的制备
第一步：2-(6-溴吡啶-2-基)乙腈的制备
乙腈(1.5mL，28.7mmol)溶于四氢呋喃(20mL)，-78℃下滴入正丁基锂(11.2mL，27.9mmol)，搅拌30分钟，加入2，6-二溴吡啶(2g，8.4mmol)的四氢呋喃(30mL)溶液，继续搅拌45分钟，反应逐渐升至室温，加水和乙酸乙酯萃取，浓缩有机相，得到的残渣用硅胶柱层析色谱纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1)，得到本步的标题化合物(1.28g，收率：77％)。
MS m/z(ESI)：197.0[M+H]+。
第二步：1-(6-溴吡啶-2-基)环丙基甲腈的制备
2-(6-溴吡啶-2-基)乙腈(500mg，2.54mmol)、1，2-二溴乙烷(716mg，3.81mmol)、四丁基硫酸氢铵(164mg，0.51mmol)溶于甲苯(5mL)，加入50％氢氧化钠水溶液(2.5mL)，室温搅拌1小时，反应液中加入水和乙酸乙酯萃取，有机相合并后，依次用水和饱和食盐水洗，浓缩有机相所得的残渣用制备薄层色谱板纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/1)，得到标题化合物(300mg，收率：53％)。
MS m/z(ESI)：223.0[M+H]+。
中间体制备例5：2-溴-6-(2-甲氧基丙-2-基)吡啶的制备
2-(6-溴吡啶-2-基)丙-2-醇(500mg，2.3mmol)和碘甲烷(980mg，6.9mmol)溶于四氢呋喃(15mL)中，加入氢化钠(276mg，6.9mmol)，室温搅拌过夜，反应液加水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用水和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液得到标题化合物(377mg，71％)。
MS m/z(ESI)：230.0[M+H]+。
中间体制备例6：4-(5-甲基六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)-苯胺的制备
第一步：5-(4-硝基苯基)六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-碳酸叔丁酯的制备
将1-氟-4-硝基苯(312.4mg，2.2mmol)溶于乙腈(10mL)中，依次加入六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-碳酸叔丁酯(500mg，2.4mmol)和DIPEA(455.8mg，3.5mmol)后加热回流搅拌5小时。将反应液冷却，抽滤，干燥得到本步的标题化合物(620mg，收率：79.0％)。
MS m/z(ESI)：334.2[M+H]+。
第二步：2-(4-硝基苯基)六氢吡咯[3，4-c]吡咯盐酸盐的制备
将5-(4-硝基苯基)六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-碳酸叔丁酯(620mg，1.9mmol)溶于4N盐酸的1，4二氧六环溶液(20mL)中，室温搅拌2小时，浓缩反应液得到本步的标题化合物(560mg，收率：100％)。
MS m/z(ESI)：234.1[M+H]+。
第三步：2-甲基-5-(4-硝基苯基)六氢吡咯[3，4-c]吡咯的制备
将2-(4-硝基苯基)六氢吡咯[3，4-c]吡咯盐酸盐(560mg，2.4mmol)与40％甲醛水溶液(2.6g，36.0mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，加入醋酸硼氢化钠(1.5g，7.2mmol)后，室温搅拌1小时，加水，用乙酸乙酯萃取3次，有机相合并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液得到本步的标题化合物(600mg，收率：100％)。
MS m/z(ESI)：248.1[M+H]+。
第四步：4-(5-甲基六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)-苯胺的制备
将2-甲基-5-(4-硝基苯基)六氢吡咯[3，4-c]吡咯(600mg，2.4mmol)溶于甲醇(10mL)，依次加入兰尼镍、水合肼(606.6mg，12.1mmol)后，室温搅拌2小时，反应液垫硅藻土过滤，减压蒸馏除去甲醇，加水和二氯甲烷萃取3次，有机层用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液得到标题化合物(342mg，收率：65％)。
MS m/z(ESI)：218.2[M+H]+。
中间体制备例7：2-异丙基-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
第一步：4-肼基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯的制备
将4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(5g，21.5mmol)溶于乙醇(150mL)，冰浴冷却至0℃，加入水合肼(3.2g)，保持0℃搅拌1小时后将反应液减压蒸干，剩余物加入甲基叔丁基醚(100mL)，搅拌30分钟后过滤，滤饼真空干燥得到本步的标题化合物(4.3g，收率：88％)。
MS m/z(ESI)：229.1[M+H]+。
第二步：2-(甲硫基)-4-(2-(丙-2-亚基)肼基)嘧啶-5-甲酸乙酯的制备
将4-肼基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(4.3g，18.8mmol)置于150mL单口瓶中，加入丙酮(100mL)，升温至70℃搅拌过夜，浓缩反应液得到本步的标题化合物(5.1g，收率：100％)。
MS m/z(ESI)：269.1[M+H]+。
第三步：4-(2-异丙基肼基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯的制备
将2-(甲硫基)-4-(2-(丙-2-亚基)肼基)嘧啶-5-甲酸乙酯(5.1g，18.8mmol)溶于甲醇(100mL)，冰浴冷却至0℃，加入氰基硼氢化钠(1.8g，28.2mmol)和浓盐酸(0.1mL)，保持0℃搅拌2小时后向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)，搅拌10分钟后乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干得到本步的标题化合物(4.9g，收率：96％)。
MS m/z(ESI)：271.1[M+H]+。
第四步：2-异丙基-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将4-(2-异丙基肼基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(4.9g，18.1mmol)溶于甲醇(400mL)，加入5N氢氧化钠水溶液(100mL)，室温搅拌过夜，反应液减压蒸去甲醇，剩余水相用乙酸乙酯萃取两次，水相再用5N稀盐酸调pH至2，乙酸乙酯萃取5次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干得到标题化合物(1.3g，收率：31％)。
MS m/z(ESI)：225.1[M+H]+。
中间体制备例8：1-(4-氨基-2-氟苯基)-N，N-二甲基哌啶-4-胺的制备
第一步：1-(4-硝基-2-氟苯基)-N，N-二甲基哌啶-4-胺的制备
将1，2-二氟-4-硝基苯(1g，6.28mmol)、N，N-二甲基哌啶-4-胺(0.96g，7.55mmol)和碳酸钾(1.72g，12.5mmol)加入乙腈(10mL)中，50℃反应16小时，反应液冷却后倒入水中，过滤，干燥固体得到本步的标题化合物(1.2g，收率：71.4％)。
MS m/z(ESI)：268.2[M+H]+。
第二步：1-(4-氨基-2-氟苯基)-N，N-二甲基哌啶-4-胺的制备
将1-(4-硝基-2-氟苯基)-N，N-二甲基哌啶-4-胺(200mg，0.75mmol)溶于甲醇(5mL)中，加入催化量兰尼镍，滴入水合肼(1mL)，室温搅拌2小时，垫少量硅藻土过滤，滤液浓缩后得到标题化合物(170mg，收率：96％)。
MS m/z(ESI)：238.2[M+H]+。
化合物制备实施例：
实施例1：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4-二甲氨基哌啶-1-基)苯基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备(化合物1)
将2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(58mg，0.16mmol)溶于甲苯(5mL)，依次加入(4-二甲氨基哌啶-1-基)苯胺(68mg，0.32mmol)和DIPEA(82.6mg，0.64mmol)，加热至80℃反应4小时，浓缩反应液，剩余物用制备高效液相色谱仪纯化，得到标题化合物(29mg，收率：34％)。
MS m/z(ESI)：529.3[M+H]+
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.84(s，1H)，7.87(t，J＝8.0Hz，1H)，7.74(d，J＝8.0Hz，1H)，7.48(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝7.6Hz，1H)，6.92(d，J＝8.8Hz，2H)，5.73-5.67(m，1H)，5.05(dd，J＝10.0，1.2Hz，1H)，4.94(dd，J＝17.2，1.2Hz，1H)，4.74(d，J＝6.0Hz，2H)，3.74(d，J＝12.4Hz，2H)，2.83-2.71(m，5H)，2.56(s，7H)，2.09(d，J＝12.0Hz，2H)，1.83-1.80(m，2H)，1.59(s，6H)。
实施例2：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(5-甲基六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)-苯基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备(化合物2)
将2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(50mg，0.13mmol)溶于甲苯(5mL)，依次加入4-(5-甲基六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)-苯胺(58mg，0.27mmol)和DIPEA(67.1mg，0.52mmol)，加热至80℃反应4小时，浓缩反应液，剩余物用制备高效液相色谱仪纯化，得到标题化合物(9mg，收率：14％)。
MS m/z(ESI)：527.3[M+H]+
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.83(s，1H)，7.87(t，J＝8.0Hz，1H)，7.73(d，J＝8.0Hz，1H)，7.46(d，J＝7.6Hz，2H)，7.35(d，J＝7.2Hz，1H)，6.72(d，J＝8.8Hz，2H)，5.70(d，J＝6.8Hz，1H)，5.35(t，J＝4.8Hz，1H)，5.05(d，J＝9.2Hz，1H)，4.94(d，J＝18.0Hz，1H)，4.73(d，J＝6.4Hz，2H)，3.75(s，3H)，3.44(d，J＝10.0Hz，2H)，3.35(s，2H)，3.17(s，2H)，2.79(s，5H)，1.59(s，6H)。
实施例3：2-烯丙基-1-(6-(1-氰基环丙-1-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4-二甲氨基哌啶-1-基)苯基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备(化合物3)
第一步：2-烯丙基-1-(6-(1-氰基环丙-1-基)吡啶-2-基)-6-甲硫基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将2-烯丙基-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(280mg，1.26mmol)、2-溴-6-(1-氰基环丙-1-基)吡啶(366mg，1.64mmol)、碘化亚铜(239mg，1.26mmol)、碳酸钾(243mg，1.76mmol)和反式-N，N’-二甲基-1，2-环己二胺(197mg，1.39mmol)加入二氧六环(8mL)中，95℃反应4小时，冷却至室温后，加入氨水，乙酸乙酯萃取3次，有机相合并浓缩，残渣用硅胶柱层析色谱分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1)，得到本步的标题化合物(289mg，收率：63％)。
第二步：2-烯丙基-1-(6-(1-氰基环丙-1-基)吡啶-2-基)-6-甲基亚磺酰基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将2-烯丙基-1-(6-(1-氰基环丙-1-基)吡啶-2-基)-6-甲硫基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(289mg，0.8mmol)溶于乙腈(5mL)和水(5mL)中，加入过一硫酸氢钾复合盐(400mg，2.4mmol)，室温搅拌2小时，加水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液得到本步的标题化合物(292mg，收率：96％)。
第三步：2-烯丙基-1-(6-(1-氰基环丙-1-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4-二甲氨基哌啶-1-基)苯基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将2-烯丙基-1-(6-(1-氰基环丙-1-基)吡啶-2-基)-6-甲基亚磺酰基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(62mg，0.16mmol)溶于甲苯(5mL)，依次加入(4-二甲氨基哌啶-1-基)苯胺(72mg，0.33mmol)和DIPEA(84mg，0.65mmol)，加热至80℃反应4小时，浓缩反应液，剩余物用制备高效液相色谱仪纯化，得到标题化合物(30mg，收率：35％)。
MS m/z(ESI)：527.3[M+H]+
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.95(s，1H)，7.35(t，J＝15.2Hz，1H)，7.08(dd，J＝15.2，3.2Hz，1H)，7.03-7.00(m，1H)，6.99-6.97(m，1H)，6.78-6.76(m，1H)，6.75-6.73(m，1H)，6.25(dd，J＝14.8，3.2Hz，1H)，5.96-5.79(m，1H)，5.24-5.16(m，1H)，5.16-5.12(m，1H)，4.95(s，1H)，3.56-3.46(m，2H)，3.44-3.32(m，2H)，3.16-3.05(m，2H)，2.26(s，6H)，1.95-1.82(m，2H)，1.74-1.57(m，5H)，1.51-1.39(m，2H)。
实施例4：2-烯丙基-1-(6-(1-氰基环丙-1-基)吡啶-2-基)-6-((4-(5-甲基六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)-苯基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备(化合物4)
将2-烯丙基-1-(6-(1-氰基环丙-1-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(80mg，0.21mmol)溶于甲苯(5mL)，依次加入4-(5-甲基六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)-苯胺(91.4mg，0.42mmol)和DIPEA(108.5mg，0.84mmol)，加热至80℃反应4小时，浓缩反应液，剩余物用制备高效液相色谱仪纯化，得到标题化合物(32mg，收率：28.6％)。
MS m/z(ESI)：534.6[M+H]+
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.95(s，1H)，7.35(t，J＝7.2Hz，1H)，7.08(dd，J＝7.2，1.6Hz，1H)，7.00(d，J＝7.2Hz，2H)，6.76(d，J＝7.2Hz，2H)，6.25(dd，J＝7.2，1.6Hz，1H)，5.92-5.82(m，1H)，5.20-5.14(m，2H)，4.89(s，1H)，4.89(s，1H)，3.67-3.64(m，2H)，3.51(d，J＝6.0Hz，1H)，3.47(d，J＝6.4Hz，1H)，2.96-2.85(m，4H)，2.18(s，3H)，2.14-2.08(m，2H)，1.84-1.77(m，2H)，1.74-1.67(m，2H)，1.48-1.42(m，2H)。
实施例5：2-烯丙基-1-(6-(2-甲氧基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(5-甲基六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)-苯基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备(化合物5)
第一步：2-烯丙基-1-(6-(2-甲氧基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-甲硫基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将2-烯丙基-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(140mg，0.63mmol)、2-溴-6-(2-甲氧基丙-2-基)吡啶(188.6mg，0.82mmol)、碘化亚铜(119.5mg，0.63mmol)、碳酸钾(121.5mg，0.88mmol)和反式-N，N’-二甲基-1，2-环己二胺(98.5mg，0.70mmol)加入二氧六环(8mL)中，95℃反应4小时，冷却至室温后，加入氨水，乙酸乙酯萃取3次，有机相合并浓缩，残渣用硅胶柱层析色谱分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1)，得到本步的标题化合物(166mg，收率：71％)。
第二步：2-烯丙基-1-(6-(2-甲氧基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-甲基亚磺酰基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将2-烯丙基-1-(6-(2-甲氧基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-甲硫基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(150mg，0.4mmol)溶于乙腈(5mL)和水(5mL)中，加入过一硫酸氢钾复合盐(203.7mg，1.2mmol)，室温搅拌2小时，加水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液得到本步的标题化合物(152mg，收率：98％)。
第三步：2-烯丙基-1-(6-(2-甲氧基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(5-甲基六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)-苯基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将2-烯丙基-1-(6-(2-甲氧基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-甲基亚磺酰基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(75mg，0.19mmol)溶于甲苯(5mL)，依次加入4-(5-甲基六氢吡咯[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)苯胺(84mg，0.39mmol)和DIPEA(100mg，0.77mmol)，加热至80℃反应4小时，浓缩反应液，制备高效液相色谱纯化得到标题化合物(34mg，收率：33％)。
MS m/z(ESI)：541.7[M+H]+
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.81(s，1H)，7.87-7.75(m，2H)，7.50-7.36(m，3H)，6.68(d，J＝8.8Hz，2H)，5.72-5.61(m，1H)，4.99(d，J＝9.6Hz，1H)，4.92-4.80(m，3H)，3.34-3.21(m，8H)，3.13(s，2H)，2.85(s，4H)，2.53(s，3H)，1.56(s，6H)。
实施例6：2-烯丙基-1-(6-(2-甲氧基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4-二甲氨基哌啶-1-基)苯基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备(化合物6)
将2-烯丙基-1-(6-(2-甲氧基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-甲基亚磺酰基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(75mg，0.19mmol)溶于甲苯(5mL)，依次加入(4-二甲氨基哌啶-1-基)苯胺(85mg，0.39mmol)和DIPEA(100mg，0.77mmol)，加热至80℃反应4小时，浓缩反应液，制备高效液相色谱纯化得到标题化合物(35mg，收率：34％)。
MS m/z(ESI)：543.3[M+H]+
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.83(s，1H)，7.85(t，J＝7.6Hz，1H)，7.77(d，J＝7.6Hz，1H)，7.48(d，J＝8.0Hz，3H)，6.93(d，J＝9.2Hz，2H)，5.72-5.61(m，1H)，4.99(d，J＝9.6Hz，1H)，4.91-4.82(m，3H)，3.73(d，J＝12.4Hz，2H)，3.22(s，3H)，2.79-2.72(m，4H)，2.54(s，6H)，2.08(d，J＝12.0Hz，2H)，1.86-1.74(m，2H)，1.56(s，6H)。
实施例7：6-((4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备(化合物7)
第一步：1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将2-异丙基-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(300mg，1.34mmol)和2-羟丙基-6-溴吡啶(347mg，1.61mmol)溶于1，4-二氧六环(50mL)，加入碘化亚铜(255mg，1.34mmol)、碳酸钾(277mg，2.01mmol)和反式-N，N’-二甲基-1，2-环己二胺(285mg，2.01mmol)，加毕，升温至95℃搅拌过夜，反应液冷却至室温，过滤，滤液浓缩，剩余物用硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1～1/1)得到本步的标题化合物(350mg，收率：72％)。
MS m/z(ESI)：360.1[M+H]+。
第二步：6-((4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将1-(6-(2-羟丙基-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(180mg，0.50mmol)溶于甲苯(12mL)，加入间氯过氧苯甲酸(104mg，0.60mmol)，室温搅拌两小时后加入二异丙基乙胺(258mg，2.00mmol)和(4-二甲氨基哌啶-1-基)苯胺(220mg，1.00mmol)，加毕，升温至80℃搅拌过夜，反应液减压蒸干，剩余物用制备高效液相色谱仪纯化，得到标题化合物(165mg，收率：62.1％)。
MS m/z(ESI)：531.3[M+H]+。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：10.12(s，1H)，8.75(s，1H)，8.07(t，J＝7.2Hz，1H)，7.71(d，J＝8.0Hz，1H)，7.65(d，J＝7.6Hz，1H)，7.54(s，2H)，6.90(d，J＝9.2Hz，2H)，5.33(s，1H)，4.18-4.11(m，1H)，3.64(d，J＝12.4Hz，2H)，2.64-2.58(m，2H)，2.19(s，6H)，2.18-2.14(m，1H)，1.84-1.81(m，2H)，1.52-1.48(m，2H)，1.44(s，6H)，1.37(s，3H)，1.36(s，3H)。
实施例8：2-烯丙基-6-((4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-3-氟苯基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物8)
将2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(亚磺酰基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(100mg，0.27mmol)和1-(4-氨基-2-氟苯基)-N，N-二甲基哌啶-4-胺(80mg，0.32mmol)溶于1，4-二氧六环(5mL)中，滴入三氟乙酸(0.5mL)，加热至95℃反应2小时，冷却至室温后，将反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取杂质，水相用碳酸钾调pH至8-9后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，剩余物用制备高效液相色谱仪纯化，得到标题化合物(48mg，收率：32.8％)。
MS m/z(ESI)：547.3[M+H]+。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.88(s，1H)，8.02(t，J＝8.0Hz，1H)，7.76-7.71(m，2H)，7.64(d，J＝8.0Hz，1H)，7.64(d，J＝8.0Hz，1H)，7.37-7.34(m，1H)，7.03-6.98(t，J＝5.2Hz，1H)，5.70-5.63(m，1H)，5.35(s，1H)，5.01-4.98(m，1H)，4.84-4.80(m，1H)，4.68(d，J＝5.2Hz，1H)，2.65-2.59(t，J＝10.8Hz，2H)，2.21(s，6H)，1.84(d，J＝10.8Hz，2H)，1.57-1.52(m，2H)，1.44(s，6H)。
实施例9：2-烯丙基-6-((4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-1-(3-(2-羟基丙烷-2-基)苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备(化合物9)
第一步：3-(1-羟基-1-甲基乙基)溴苯的制备
氮气保护下将3-溴苯甲酸甲酯(1g，4.65mmol)加入***(20mL)中，冰水浴冷却，滴加甲基碘化镁的***溶液(4mL，3mol/L，12mmol)，滴毕后自然升至室温反应12小时。反应液缓慢倒入饱和氯化铵水溶液中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液得到本步的标题化合物(820mg，收率：82％)。
MS m/z(ESI)：245.0[M+H]+。
第二步：3-(1-羟基-1-甲基乙基)苯基硼酸的制备
氮气保护下将3-(1-羟基-1-甲基乙基)溴苯(500mg，2.32mmol)加入四氢呋喃(10mL)中，-60℃下缓慢滴加正丁基锂的正己烷溶液(3mL，2mol/L，6mmol)，-60℃搅拌1小时，滴加硼酸三甲酯(480mg，4.62mmol)，室温反应12小时，缓慢滴加水(20mL)，乙酸乙酯萃取，水相用1N盐酸调pH至2-3，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液得到本步的标题化合物(220mg，收率：52.6％)。
MS m/z(ESI)：181.0[M+H]+。
第三步：2-烯丙基-1-(3-(2-羟基丙烷-2-基)苯基)-6-(甲硫基)-1H吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将2-烯丙基-6-(甲硫基)-1，2-二氢-3H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-酮(200mg，0.56mmol)、乙酸铜(160mg，0.8mmol)和3-(1-羟基-1-甲基乙基)苯基硼酸(200mg，1.12mmol)依次加入氯仿(3mL)中，滴入吡啶(0.4mL)室温反应48小时，向反应中加入30％的氨水，搅拌30分钟，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，剩余物用硅胶薄层析色谱法纯化得到本步的标题化合物(30mg，收率15％)。
MS m/z(ESI)：357.1[M+H]+。
第四步：2-烯丙基-1-(3-(2-羟基丙烷-2-基)苯基)-6-(甲基亚磺酰基)-1H吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将2-烯丙基-1-(3-(2-羟基丙烷-2-基)苯基)-6-(甲硫基)-1H吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(30mg，0.084mmol)加入乙腈(2mL)和水(2mL)的混合溶剂中，加入过硫酸氢钾复合盐(34mg，0.2mmol)，室温搅拌2小时，反应液用10mL水稀释，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液得到本步的标题化合物(20mg，收率63.6％)
MS m/z(ESI)：373.1[M+H]+。
第五步：2-烯丙基-6-((4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-1-(3-(2-羟基丙烷-2-基)苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮的制备
将2-烯丙基-1-(3-(2-羟基丙烷-2-基)苯基)-6-(甲基亚磺酰基)-1H吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(20mg，0.053mmol)和(4-二甲氨基哌啶-1-基)苯胺(13mg，0.059mmol)加入1，4-二氧六环(10mL)中，滴入三氟乙酸(0.1mL)，升温至90℃反应4小时，反应冷却至室温，将反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取杂质，水相用碳酸钾调pH至8-9后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，剩余物用制备高效液相色谱仪纯化，得到标题化合物(5mg，收率18％)。
MS m/z(ESI)：528.3[M+H]+。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.80(s，1H)，7.55-7.48(m，5H)，7.29-7.27(m，1H)，6.85(d，J＝8.8Hz，2H)，5.70-5.62(m，1H)，5.18(s，1H)，5.08(d，J＝9.2Hz，1H)，4.27(br，2H)，3.61(d，J＝12.0Hz，2H)，2.59(d，J＝8.0Hz，2H)，2.20(s，6H)，2.20-2.15(m，3H)，2.02-1.97(m，2H)，1.83-1.80(m，2H)，1.46(s，6H)。
药理学测试
实验例1：Wee1激酶的抑制实验：
为测试所述化合物对Wee1激酶的体外活性抑制效果，实验步骤如下：
1)将Wee1蛋白(Carna Biosciences)与不同浓度的待测化合物室温预孵育15分钟后，按照试剂盒说明加入底物(Poly(Lys，Tyr)，Sigma)及10ATP启动反应，于30℃反应90分钟。
2)加入与反应体系等体积的ADP-Glo试剂(Promega)，于室温孵育40分钟使反应终止。
3)加入激酶检测试剂，于室温孵育30分钟。检测产物自发光信号。以溶媒组(DMSO)为阴性对照、Buffer反应缓冲液组(不含酶和化合物)为空白对照，以剩余活性离50％最近的浓度计算化合物的半数抑制浓度(IC50)，结果如表1所示：
表1 化合物对Wee1活性抑制数据
从表1数据可以看出，所述化合物对Wee1激酶具有明显的抑制作用。
实验例2：大鼠药代动力学(PK)分布研究
分别通过静脉(IV)和灌胃(PO)给予雄性SD大鼠处于临床试验阶段的Wee1抑制剂AZD1775和测试化合物，考察测试化合物的药代动力学特点。IV和PO的给药剂量分别是1mg/kg和5mg/kg，IV的溶媒为5％DMSO：5％Solutol：90％生理盐水，PO的溶媒为0.5％MC。IV和PO给药后在不同时间点收集血液。血液采用EDTA-K2抗凝，离心后得到血浆样品。血浆样品经沉淀蛋白处理后进行LC-MS/MS分析。
应用WinNonlin 6.3软件，采用非房室模型计算药代动力学参数，结果见表2和表3。
表2.化合物在大鼠体内的药代动力学参数
表2的数据显示，本申请的化合物2在大鼠体内的生物利用度(F)为49.7％，优于AZD1775，表明本申请的化合物在大鼠体内具有良好的药物暴露量和生物利用度，适合用于口服给药。
表3.化合物在大鼠体内的药物半衰期比较
| 待测物 | 化合物1 | 化合物2 | AZD1775 |
| 给药途径 | 灌胃 | 灌胃 | 灌胃 |
| 性别 | 雄性 | 雄性 | 雄性 |
| 剂量(mg/kg) | 5 | 5 | 5 |
| <![CDATA[T<sub>1/2</sub>(h)]]> | 4.37 | 3.79 | 1.73 |
表3的数据显示，通过以5mg/kg的剂量灌胃给药的本申请的化合物1和化合物2，T1/2分别为4.37小时和3.79小时，表明本申请的化合物的半衰期较化合物AZD1775提高1倍以上，药效作用时间更长，具有显著优势。而且本申请化合物可实现每天给药1次，能减少给药次数，提高患者顺应性。
实验例3：小鼠药代动力学(PK)分布研究
分别通过静脉(IV)和灌胃(PO)给予雌性Balb/c小鼠处于临床试验阶段的Wee1抑制剂AZD1775和测试化合物，考察测试化合物的药代动力学特点。IV和PO的给药剂量分别是1mg/kg和10mg/kg，IV的溶媒为5％DMSO：5％Solutol：90％生理盐水，PO的溶媒为0.5％MC。IV和PO给药后在不同时间点收集血液。血液采用EDTA-K2抗凝，离心后得到血浆样品。血浆样品经沉淀蛋白处理后进行LC-MS/MS分析。
应用WinNonlin 6.3软件，采用非房室模型计算药代动力学参数，结果见表4和表5。
表4.化合物在小鼠体内的药代动力学参数
表4的数据显示，当口服给药10mg/kg时，本申请的化合物1在小鼠体内的AUClast为1770h＊ng/mL，优于同剂量下AZD1775的AUClast，表明本申请的化合物在小鼠体内具有良好的药物暴露量，适合用于口服给药。
表5.化合物在小鼠体内的药物半衰期比较
表5的数据显示，本申请的化合物1在静脉和灌胃给药方式下，T1/2分别为1.15小时和2.90小时，表明本申请的化合物的半衰期较化合物AZD1775提高1倍以上，药效作用时间更长，具有显著优势。而且本申请化合物可实现每天给药1次，能减少给药次数，提高患者顺应性。
Claims (24)
1.化合物或其药学可接受的盐，所述化合物具有以下式I的结构：
其中，
X为N；
R1为羟基-C1-6烷基-；
R2选自7-10元双环稠杂环基，所述7-10元双环稠杂环基任选被一个或多个C1-6烷基取代；或R2为哌啶基，所述哌啶基被一个或多个-NR5R6取代；R5、R6各自独立地选自C1-6烷基；
R3为C2-6烯基；
R4为氢。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R1为羟基-C1-4烷基-。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R1选自2-羟基丙-2-基。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R2选自8元双环稠杂环基，所述8元双环稠杂环基被一个C1-6烷基取代。
5.根据权利要求4所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R2选自
6.根据权利要求5所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R2为5-甲基-八氢-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-基。
7.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R2为哌啶基，所述哌啶基被一个或多个-NR5R6取代，R5、R6各自独立地选自C1-4烷基。
8.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R2为
R5、R6各自独立地选自C1-6烷基。
9.根据权利要求8所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R2为4-二甲氨基哌啶-1-基。
10.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R3为C2-4烯基。
11.根据权利要求10所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R3为烯丙基。
12.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R1选自2-羟基丙-2-基；
R2为5-甲基六氢吡咯[3,4-c]吡咯-2(1H)-基；或者R2选自
R5、R6各自独立地选自C1-6烷基。
13.根据权利要求12所述的化合物或其药学可接受的盐，
其中，R2为4-二甲氨基哌啶-1-基。
14.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，所述化合物具有以下结构：
15.药物组合物，其包含预防或治疗有效量的权利要求1-14中任一项所述的化合物或其药学可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。
16.药物制剂，其包含权利要求1-14中任一项所述的化合物或其药学可接受的盐，或者权利要求15的药物组合物。
17.根据权利要求16所述的药物制剂，
其中，所述药物制剂通过口服、静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内或经皮途径给药。
18.根据权利要求1-14中任一项所述的化合物或其药学可接受的盐、权利要求15所述的药物组合物或权利要求16或17所述的药物制剂在制备用于预防或治疗Wee1蛋白相关疾病的药物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，
其中，所述Wee1蛋白相关疾病为癌症。
20.根据权利要求19所述的用途，所述癌症选自头颈癌、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和子宫内膜癌。
21.制备权利要求1-14中任一项所述的化合物的方法，其包括以下步骤：
其中，Hall为卤素；Hal2选自卤素、硼酸基团或硼酸酯基团；R1、R2、R3、R4和X如权利要求1-14中任一项所定义；
各步骤的反应条件如下：
(1)使化合物IN-1与肼类化合物反应以得到化合物IN-2；
(2)使化合物IN-2环化以得到化合物IN-3；
(3)使化合物IN-3与化合物IN-4反应以得到化合物IN-5；
(4)使化合物IN-5氧化得到化合物IN-6；
(5)使化合物IN-6与化合物IN-7反应以得到式I的化合物。
22.制备权利要求11所述的化合物的方法，其包括以下步骤：
其中，Hal1为卤素；Hal2为卤素、硼酸基团或硼酸酯基团；PG为保护基，选自苄基、对甲氧基苄基、叔丁氧羰基、苄氧基羰基；R1和R2如权利要求11所定义；
各步骤的反应条件如下：
(1)使化合物IN-1与化合物IN-8反应以得到化合物IN-9；
(2)使化合物IN-9去除保护基PG以得到化合物IN-10；
(3)使化合物IN-10环化以得到化合物IN-11；
(4)使化合物IN-11与化合物IN-12反应以得到化合物IN-13；
(5)使化合物IN-13氧化得到化合物IN-14；
(6)使化合物IN-14与化合物IN-15反应以得到式I-2的化合物。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中：
Hal1为F、Cl或Br。
24.根据权利要求21或22所述的方法，其中：
Hal2为Cl、Br、I、硼酸基团或硼酸酯基团。
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