CN112798790A - 一种测定c反应蛋白浓度的试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定C反应蛋白浓度的试剂盒及制备方法,试剂盒中的胶乳抗体复合物为偶联有抗体、生物素、链霉亲和素的胶乳微球,抗体选自可以结合至C‑反应蛋白的抗体。本发明利用链霉亲和素和生物素实现了胶乳信号的放大,提高了检测试剂的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域,具体涉及一种测定C反应蛋白浓度的试剂盒及制备方法。
背景技术
现有的测定C反应蛋白浓度的方法主要包括以下两种:
1、胶乳微球直接偶联抗体。其主要缺陷在于:这种方式得到的胶乳试剂测试的灵敏度较低,测试低值部分的灵敏度达不到超敏的要求。
2、胶乳微球直接包被多抗。其主要缺陷在于:这种方式测试的特异性没有包被单抗的特异性好,容易产生非特异性的结合。
因此,现有技术无法准确测定C反应蛋白浓度。
发明内容
本发明提供一种测定C反应蛋白浓度的试剂盒及制备方法。
根据第一方面,一种实施例中提供一种胶乳抗体复合物,所述胶乳抗体复合物为偶联有抗体、生物素、链霉亲和素的胶乳微球,所述抗体选自可以结合至C-反应蛋白的抗体。
根据第二方面,一种实施例中提供第一方面所述胶乳抗体复合物的制备方法,包括:
抗体-生物素复合物制备步骤,包括将抗体与生物素混合,制得抗体-生物素复合物;
链霉亲和素-胶乳微球复合物制备步骤,包括将链霉亲和素与胶乳微球混合,制得链霉亲和素-胶乳微球复合物;
偶联步骤,包括将所述抗体-生物素复合物与所述链霉亲和素-胶乳微球复合物混合,制得偶联有抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球,即为所述胶乳抗体复合物。
根据第三方面,在一些实施例中,提供一种试剂,所述试剂含有第一方面所述胶乳抗体复合物。
根据第四方面,在一些实施例中,提供一种试剂组合,包括第一方面所述胶乳抗体复合物或第三方面所述试剂,第三方面所述试剂即为R2试剂。
根据第五方面,在一些实施例中,提供一种试剂盒,包括第四方面所述试剂组合。
根据第六方面,在一些实施例中,提供第一方面所述胶乳抗体复合物,或第三方面所述试剂,或第四方面所述试剂组合,或第五方面所述试剂盒在检测C-反应蛋白中的应用。
依据上述实施例的测定C反应蛋白浓度的试剂盒及制备方法,利用链霉亲和素和生物素实现了胶乳信号的放大,提高了检测试剂的灵敏度、特异性。
附图说明
图1显示为实施例1的测试结果图;
图2显示为实施例2的测试结果图;
图3显示为实施例3的测试结果图;
图4显示为实施例4的测试结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中,很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而,本领域技术人员可以毫不费力的认识到,其中部分特征在不同情况下是可以省略的,或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下,本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述,这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没,而对于本领域技术人员而言,详细描述这些相关操作并不是必要的,他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外,说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时,方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此,说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例,并不意味着是必须的顺序,除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身,例如“第一”、“第二”等,仅用于区分所描述的对象,不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”,如无特别说明,均包括直接和间接连接(联接)。
本文中,C-反应蛋白(C-reactive protein,简称CRP)是在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白),通过激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用,可以清除入侵机体的病原微生物和损伤、坏死、凋亡的组织细胞。
本文中,链霉亲和素(streptavidin,简称SA)是与亲和素(avidin下称AV)有相似生物学特性的一种蛋白质,是streptomyces avidinii菌的分泌物,其分子量及结合生物素的能力与鸡蛋清中的亲和素相似,等电点6.0,非特异性结合远比亲和素低。SA是Streptomyces avicllrdi菌培养过程中的分泌产物,主要通过2一亚氨基生物素亲和层析法提纯,1L培养液中含蛋白10~60mg。链霉亲和素是四聚体蛋白,大小为66KDa。一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合,两者之间的亲和力极为强烈,链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于10-14mol/L数量级。其中一条完整的SA肽链中有159个氨基酸残基,分子量为16450。
本文中,生物素(Biotin)为B族维生素之一,又称维生素H、维生素B7、辅酶R(Coenzyme R)等。它是合成维生素C的必要物质,是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。是一种维持人体自然生长、发育和正常人体机能健康必要的营养素。生物素可与亲和素结合而被检测。在检测的过程中,生物素只用作固定连接,而不用作信号检测。
本文中,胶乳微球是指聚苯乙烯微球。
在一些实施例中,使用CRP单克隆抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球,可以测试血清、血浆、全血等样本类型,使得测试的灵敏度大幅提高,同时增强试剂的特异性。
根据第一方面,在一些实施例中,提供一种胶乳抗体复合物,所述胶乳抗体复合物为偶联有抗体、生物素、链霉亲和素的胶乳微球,所述抗体选自可以结合至C-反应蛋白的抗体。胶乳抗体复合物也可称为胶乳微球偶联物。
在一些实施例中,所述抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体中的至少一种。
在一些实施例中,所述抗体包括但不限于鼠抗人CRP单克隆抗体、兔抗人CRP多克隆抗体、羊抗人CRP多克隆抗体中的至少一种。此处仅仅是示例性列举,其他具有类似功能的CRP单克隆抗体、CRP多克隆抗体也适用于本发明。
在一些实施例中,所述胶乳微球包括但不限于聚苯乙烯。
在一些实施例中,所述胶乳微球的粒径可以为50-400nm。具体可以包括但不限于50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm等等。
在一些实施例中,所述胶乳微球的表面修饰基团包括但不限于氨基、羧基、醛基、羟基中至少一种。
在一些实施例中,所述抗体的质量与生物素的质量之比为(0.2-5):1。具体可以包括但不限制于0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、3:1、4:1、5:1等等。
在一些实施例中,所述胶乳微球的质量与链霉亲和素的质量之比为(0.5-2):1,具体可以包括但不限制于0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1等等。
在一些实施例中,所述胶乳抗体复合物是由链霉亲和素-胶乳微球复合物与抗体-生物素复合物偶联得到,所述链霉亲和素-胶乳微球复合物的质量与抗体-生物素复合物的质量之比为(0.2-5):1。具体可以包括但不限制于0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、3:1、4:1、5:1等等。
根据第二方面,在一些实施例中,提供第一方面所述胶乳抗体复合物的制备方法,包括:
抗体-生物素复合物制备步骤,包括将抗体与生物素混合,制得抗体-生物素复合物;
链霉亲和素-胶乳微球复合物制备步骤,包括将链霉亲和素与胶乳微球混合,制得链霉亲和素-胶乳微球复合物;
偶联步骤,包括将所述抗体-生物素复合物与所述链霉亲和素-胶乳微球复合物混合,制得偶联有抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球,即为所述胶乳抗体复合物。
抗体-生物素复合物制备步骤与链霉亲和素-胶乳微球复合物制备步骤无先后顺序之分,可以先进行两个步骤中的任意一个步骤,也可以同时进行这两个步骤。
在一些实施例中,所述抗体-生物素复合物制备步骤中,包括使用反应液稀释抗体,得到抗体稀释液,使用有机试剂溶解生物素,得到生物素溶解液,再将所述抗体稀释液与生物素溶解液混合,反应制得抗体-生物素复合物。
在一些实施例中,所述反应液包括但不限于吗啉乙磺酸(又名MES、2-吗啉乙磺酸、CAS号:4432-31-9)缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液中的至少一种中的至少一种。
在一些实施例中,所述有机试剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的至少一种。
在一些实施例中,所述生物素溶解液中生物素的浓度为10-50g/L。
在一些实施例中,所述抗体稀释液中,抗体的浓度为0.2-20mg/mL。具体可以包括但不限制于0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL等等。
在一些实施例中,所述抗体稀释液与生物素溶解液混合,反应结束后,过滤处理,去除多余的生物素等小分子,收集大分子,得到抗体-生物素复合物。
在一些实施例中,过滤时采用的器具可以包括但不限于超滤管、透析袋。
在一些实施例中,所述链霉亲和素-胶乳微球复合物制备步骤中,包括先用稀释液稀释胶乳微球,得到胶乳微球稀释液,再将所述胶乳微球稀释液与链霉亲和素混合,反应制得所述链霉亲和素-胶乳微球复合物。
在一些实施例中,所述稀释液包括但不限于吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液中的至少一种。
在一些实施例中,所述胶乳微球稀释液中,胶乳微球的固含量为0.02wt%-2wt%。具体可以包括但不限制于0.02wt%、0.03wt%、0.04wt%、0.05wt%、0.06wt%、0.07wt%、0.08wt%、0.09wt%、0.1wt%、0.2wt%、0.3wt%、0.4wt%、0.5wt%、0.6wt%、0.7wt%、0.8wt%、0.9wt%、1wt%、1.1wt%、1.2wt%、1.3wt%、1.4wt%、1.5wt%、1.6wt%、1.7wt%、1.8wt%、1.9wt%、2wt%等等。外购的胶乳微球的初始固含量通常为5wt%-10wt%,具体使用时,先使用缓冲液将外购的胶乳微球稀释至固含量为0.05wt%-0.2wt%,然后进行后续步骤。
在一些实施例中,所述链霉亲和素-胶乳微球复合物制备步骤中,所述胶乳微球稀释液与链霉亲和素混合,反应结束后,固液分离处理,收集固体,得到所述链霉亲和素-胶乳微球复合物。
在一些实施例中,固液分离处理后,弃去上清,收集固体,即为所述链霉亲和素-胶乳微球复合物。
在一些实施例中,所述固液分离处理包括但不限于离心处理。
在一些实施例中,所述偶联步骤中,包括将链霉亲和素-胶乳微球复合物制备步骤制得的链霉亲和素-胶乳微球复合物稀释,得到链霉亲和素-胶乳微球复合物稀释液,然后将所述链霉亲和素-胶乳微球复合物稀释液与所述抗体-生物素复合物混合,反应得到所述胶乳微球偶联物。
在一些实施例中,使用缓冲液稀释所述链霉亲和素-胶乳微球复合物。
在一些实施例中,所述缓冲液包括但不限于吗啉乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液中的至少一种。
根据第三方面,在一些实施例中,提供一种试剂,所述试剂含有保存液以及第一方面所述胶乳抗体复合物。该试剂可以作为C-反应蛋白检测试剂盒的R2试剂。保存液的作用主要包括用于储存所得胶乳抗体复合物的液体,使其长期稳定,保存液通常含有缓冲剂。
在一些实施例中,所述保存液含有第二缓冲剂、第二表面活性剂、第二防腐剂、稳定剂中的至少一种。
在一些实施例中,所述保存液含有如下浓度的组分:5-50mmol/L第二缓冲剂、0.5-10g/L第二表面活性剂、0.5-5g/L第二防腐剂、0.5-10g/L稳定剂。
在一些实施例中,所述保存液中第二缓冲剂的浓度具体可以包括但不限于5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L等等。
在一些实施例中,所述保存液中第二表面活性剂的浓度具体可以包括但不限于0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等等。
在一些实施例中,所述保存液中第二防腐剂的浓度具体可以包括但不限于0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L等等。
在一些实施例中,所述保存液中稳定剂的浓度具体可以包括但不限于0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等等。
在一些实施例中,所述第二缓冲剂包括但不限于磷酸缓冲盐溶液(PBS)、氨基丁三醇(Tris)、甘氨酸、硼酸盐、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、吗啉乙磺酸(MES)中的至少一种。
在一些实施例中,所述第二表面活性剂包括但不限于聚乙烯吡络烷酮、丙三醇、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、吐温20、吐温40、吐温80中的至少一种。
在一些实施例中,所述第二防腐剂包括但不限于叠氮化钠、ProClin-950、ProClin-300、KroVin100、KroVin300、KroVin500、KroVin750、硫柳汞中的至少一种。
在一些实施例中,所述稳定剂包括但不限于蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘露醇、明胶中至少一种。
在一些实施例中,所述试剂中胶乳微球的固含量为0.05wt%-0.2wt%,具体可以包括但不限制于0.05wt%、0.06wt%、0.07wt%、0.08wt%、0.09wt%、0.1wt%、0.11wt%、0.12wt%、0.13wt%、0.14wt%、0.15wt%、0.16wt%、0.17wt%、0.18wt%、0.19wt%、0.2wt%等等。
根据第四方面,在一些实施例中,提供一种试剂组合,包括第一方面所述胶乳抗体复合物或第三方面所述试剂,第三方面所述试剂即为R2试剂。
在一些实施例中,还包括R1试剂,所述R1试剂含有第一缓冲剂、第一表面活性剂、第一溶血剂、第一防腐剂中的至少一种。
在一些实施例中,所述R1试剂含有如下浓度的组分:5-50mmol/L第一缓冲剂、0.5-10g/L第一表面活性剂、0.2-5g/L第一溶血剂、0.5-5g/L第一防腐剂。
在一些实施例中,所述R1试剂中的第一缓冲剂的浓度包括但不限于5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L等等。
在一些实施例中,所述R1试剂中的第一表面活性剂的浓度包括但不限于0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等等。
在一些实施例中,所述R1试剂中的第一溶血剂的浓度包括但不限于0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L等等。
在一些实施例中,所述R1试剂中的第一防腐剂的浓度包括但不限于0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L等等。
在一些实施例中,所述R1试剂中的第一缓冲剂包括但不限于磷酸缓冲盐溶液(PBS)、氨基丁三醇(Tris)、甘氨酸、硼酸盐、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、吗啉乙磺酸(MES)中的至少一种。
在一些实施例中,所述R1试剂中的第一表面活性剂包括但不限于聚乙烯吡络烷酮(CAS登录号9003-39-8)、丙三醇(CAS登录号56-81-5)、皂苷、Triton100、Triton405、聚乙二醇6000(PEG6000)、聚乙二醇8000(PEG8000)、聚乙二醇10000(PEG10000)、聚乙二醇20000(PEG20000)、吐温20(Tween-20)、吐温40(Tween-40)、吐温80(Tween-80)中的至少一种。其中,皂苷具有溶血作用,可与胆甾醇结合生成不溶性分子复合物,破坏血红细胞的渗透性而发生崩解。
在一些实施例中,所述R1试剂中的第一溶血剂选自聚皂苷、Triton X-100、TritonX-405中的至少一种。
在一些实施例中,所述R1试剂中的第一防腐剂包括但不限于叠氮化钠(CAS登录号:26628-22-8)、ProClin-950、ProClin-300、KroVin100、KroVin300、KroVin500、KroVin750、硫柳汞(CAS登录号:54-64-8)中的至少一种。
根据第五方面,在一些实施例中,提供一种试剂盒,包括第四方面所述试剂组合。
在一些实施例中,所述试剂盒还包括用于独立容纳所述R1试剂、R2试剂的容器。
通常情况下,R1试剂与R2试剂独立分装于不同的容器中,或者同一容器的不同腔室中,形成套装试剂盒产品。
在一些实施例中,所述试剂盒还包括包装说明书。
根据第六方面,在一些实施例中,提供第一方面所述胶乳抗体复合物,或第三方面所述试剂,或第四方面所述试剂组合,或第五方面所述试剂盒在检测C-反应蛋白中的应用。
在一些实施例中,所述第一方面所述胶乳抗体复合物,或第三方面所述试剂,或第四方面所述试剂组合,或第五方面所述试剂盒可用于检测样本中C-反应蛋白的浓度。
在一些实施例中,所述样本包括但不限于全血、血清、血浆中的至少一种。
在一些实施例中,本发明利用链霉亲和素和生物素实现了胶乳信号的放大,提高了灵敏度,全血样本检测的线性范围可做到0.1-400mg/L,血清、血浆样本检测的线性范围可做到0.1-280mg/L,并且提高了试剂的特异性。
以下实施例均是在室温(23℃±2℃)下检测吸光度。
以下实施例中,调节pH所使用的试剂为氢氧化钠水溶液、盐酸。
实施例1
本实施例的检测试剂包括R1试剂、R2试剂。
胶乳微球所选粒径为80nm,其表面修饰基团为羧基。
R1和R2试剂的pH为8.0。
本实施例提供测定C反应蛋白浓度的试剂盒制备方法,包括如下步骤:
1、R1试剂的制备
在调配罐中加入适量的水,调节搅拌器至合适转速,依次投入第一缓冲剂、第一表面活性剂、第一溶血剂、第一防腐剂,搅拌10-20分钟至完全溶解,溶液澄清透明无沉淀后,调节pH至8.0,定容至最终体积,制得含有如下终浓度组分的R1试剂:5mmol/L第一缓冲剂、0.5g/L第一表面活性剂、0.2g/L第一溶血剂、0.5g/L第一防腐剂,溶解后,通过微孔滤膜过滤,收集滤液,将过滤后的R1试剂成品放置在储存容器中,进行分装标识。第一缓冲剂为Tris(即氨基丁三醇,亦称三羟甲基氨基甲烷),第一表面活性剂为PEG6000,第一溶血剂为皂苷,第一防腐剂为ProClin-300。皂苷具有溶血作用,可与胆甾醇结合生成不溶性分子复合物,破坏血红细胞的渗透性而发生崩解,皂苷的加入,使得该试剂盒可用于检测全血样本中的C反应蛋白浓度。
2、R2试剂的制备
2.1 CRP鼠抗人单克隆抗体-生物素复合物的制备
使用碳酸氢钠缓冲液稀释CRP鼠抗人单克隆抗体,制得CRP鼠抗人单克隆抗体浓度为2mg/mL的CRP鼠抗人单克隆抗体稀释液,使用DMF(二甲基甲酰胺)溶解生物素,得到生物素浓度为10g/L的生物素溶解液,按照CRP鼠抗人单克隆抗体:生物素=0.2:1的质量比,将CRP鼠抗人单克隆抗体稀释液与生物素溶解液混合,混合一定时间后,使用超滤管进行过滤,结合有生物素的CRP鼠抗人单克隆抗体为大分子,被成功收集,弃去生物素等其他小分子,得到CRP鼠抗人单克隆抗体-生物素复合物。
2.2 CRP鼠抗人单克隆抗体-生物素-链霉亲和素-胶乳微球复合物的制备
使用MES(即吗啉乙磺酸,CAS号:4432-31-9)缓冲液稀释胶乳微球配成20mM的MES溶液,制得的胶乳稀释液中胶乳微球的固含量为0.05wt%,按照胶乳微球:链霉亲和素=1:1的质量比,将链霉亲和素加入到胶乳稀释液中,混合后,通过15000rpm转速离心1小时,去除上清液,得到链霉亲和素-胶乳微球复合物,再加入MES缓冲液,超声重悬,重复3次,得到含有链霉亲和素-胶乳微球复合物的溶液,该溶液中胶乳微球的固含量为0.05wt%。后续实施例所使用的MES缓冲液与本实施例相同。
取上一步制得的链霉亲和素-胶乳微球复合物溶液,边搅拌边滴加CRP单克隆抗体-生物素复合物,按照链霉亲和素-胶乳微球复合物:CRP鼠抗人单克隆抗体-生物素复合物=5:1的质量比例进行混合,反应一定时间后,加入10%BSA溶液(牛血清白蛋白溶液)作为封闭剂,反应一定时间,将混合液以15000rpm转速离心1小时,去除上清液,得到CRP鼠抗人单克隆抗体-生物素-链霉亲和素-胶乳微球复合物,加入保存液,超声重悬,重复3次,所得混合液中胶乳微球的固含量为0.05wt%,过滤、分装,进行标识。本实施例中所使用的保存液中含有如下终浓度的组分:5mmol/L第二缓冲剂、0.5g/L第二表面活性剂、0.5g/L第二防腐剂、1g/L稳定剂,其中,第二缓冲剂为Tris(三羟甲基氨基甲烷),第二表面活性剂为Tween-20,第二防腐剂为ProClin-300,稳定剂为海藻糖、牛血清白蛋白的混合物,海藻糖、牛血清白蛋白在保存液中的浓度均为0.5g/L。
采用本实施例的R1、R2试剂检测全血样本中C-反应蛋白的浓度。
在足量抗体存在时,浊度的高低与全血样本中C反应蛋白的含量成正比,在540nm波长下,通过与已知浓度的全血样本比较,可定量检测出全血样本中C反应蛋白的含量。使用本实施例的方法制备的R1、R2试剂测试已知浓度(使用深圳市国赛生物技术有限公司的Aristo全自动特定蛋白分析仪测试赋值得到)的全血样本,作为实验组1;采用与本实施例相同的R1试剂以及未添加生物素、链霉亲和素的R2试剂(R2试剂的其他组分及浓度与本实施例的R2试剂相同)作为对照组1,测试同样的全血样本,对两者的检测结果进行对比。
结果如图1所示,图1中,横坐标为样本中C反应蛋白的含量,单位为mg/L,纵坐标为540nm波长下的溶液信号值(该信号值由分析仪根据吸光度进行自动换算),可见,本实施例中对全血样本检测的线性范围为0.1-400mg/L,明显比使用未添加生物素与链霉亲和素的R2试剂的对照组的线性范围更宽,对照组在C反应蛋白的浓度大于200mg/L时出现钩状效应,对照组的线性范围仅仅为0.1-200mg/L。
后续实施例中提及的对照组与本实施例的对照组相同。
实施例2
参照实施例1进行,不同之处在于:抗体与生物素的质量比、链霉亲和素-胶乳微球复合物与抗体-生物素复合物的质量比不同,基础缓冲剂的组分浓度有稍微调整。
本实施例的检测试剂包括R1试剂、R2试剂。
胶乳微球所选粒径为80nm,其表面修饰基团为羧基。
R1和R2试剂的pH为8.0。
本实施例提供测定C反应蛋白浓度的试剂盒制备方法,包括如下步骤:
1、R1试剂的制备
在调配罐中加入适量的水,调节搅拌器至合适转速,依次投入第一缓冲剂、第一表面活性剂、第一溶血剂、第一防腐剂,搅拌10-20分钟至完全溶解,溶液澄清透明无沉淀后,调节pH至8.0,定容至最终体积,制得含有如下终浓度组分的R1试剂:20mmol/L第一缓冲剂、2g/L第一表面活性剂、1g/L第一溶血剂、1g/L第一防腐剂,溶解后,通过微孔滤膜过滤,收集滤液,将过滤后的R1试剂成品放置在储存容器中,进行分装标识。第一缓冲剂为Tris(三羟甲基氨基甲烷),第一表面活性剂为PEG6000,第一溶血剂为皂苷,第一防腐剂为ProClin-300。皂苷具有溶血作用,可与胆甾醇结合生成不溶性分子复合物,破坏血红细胞的渗透性而发生崩解,皂苷的加入,使得该试剂盒可用于检测全血样本中的C反应蛋白浓度。
2、R2试剂的制备
2.1 CRP鼠抗人单克隆抗体-生物素复合物的制备
使用碳酸氢钠缓冲液稀释CRP单克隆抗体,制得CRP单克隆抗体浓度为2mg/mL的CRP鼠抗人单克隆抗体稀释液,使用DMF(二甲基甲酰胺)溶解生物素,得到生物素浓度为10g/L的生物素溶解液,按照CRP单克隆抗体:生物素=5:1的质量比,将CRP鼠抗人单克隆抗体稀释液与生物素溶解液混合,混合一定时间后,使用超滤管进行过滤,结合有生物素的CRP单克隆抗体为大分子,被成功收集,弃去生物素等其他小分子,得到CRP鼠抗人单克隆抗体-生物素复合物。
2.2 CRP鼠抗人单克隆抗体-生物素-链霉亲和素-胶乳微球复合物的制备
使用MES缓冲液稀释胶乳微球,制得的胶乳稀释液中胶乳微球的固含量为0.05wt%,按照胶乳微球:链霉亲和素=1:1的质量比,再将链霉亲和素加入到胶乳稀释液中,混合后,通过15000rpm转速离心1小时,去除上清液,得到链霉亲和素-胶乳微球复合物,加入MES缓冲液,超声重悬,重复3次,得到含有链霉亲和素-胶乳微球复合物的溶液,该溶液中胶乳微球的固含量为0.05wt%。
取上一步制得的链霉亲和素-胶乳微球复合物溶液,边搅拌边滴加CRP鼠抗人单克隆抗体-生物素复合物,按照链霉亲和素-胶乳微球复合物:CRP鼠抗人单克隆抗体-生物素复合物=0.5:1的质量比例进行混合,反应一定时间后,加入10%BSA溶液(牛血清白蛋白溶液)作为封闭剂,反应一定时间,将混合液以15000rpm转速离心1小时,去除上清液,得到CRP鼠抗人单克隆抗体-生物素-链霉亲和素-胶乳微球复合物,加入保存液,超声重悬,重复3次,所得混合液中胶乳微球的固含量为0.05wt%,过滤、分装,进行标识。本实施例中所使用的保存液中含有如下终浓度的组分:20mmol/L第二缓冲剂、2g/L第二表面活性剂、1g/L第二防腐剂、1g/L稳定剂,其中,第二表面活性剂为Tween-20,第二防腐剂为ProClin-300,稳定剂为海藻糖、牛血清白蛋白的混合物,海藻糖、牛血清白蛋白在保存液中的浓度均为0.5g/L,第二缓冲剂为Tris(三羟甲基氨基甲烷)。
采用本实施例的R1、R2试剂检测全血样本中C-反应蛋白的浓度。
在足量抗体存在时,浊度的高低与全血样本中C反应蛋白的含量成正比,在540nm波长下,通过与已知浓度的全血样本比较,可定量检测出全血样本中C反应蛋白的含量。使用本实施例的方法制备的R1、R2试剂测试已知浓度(使用深圳市国赛生物技术有限公司的Aristo全自动特定蛋白分析仪测试赋值得到)的全血样本,作为实验组2;与对照组1的检测结果进行对比。
结果如图2所示,图2中,横坐标为样本中C反应蛋白的含量,单位为mg/L,纵坐标为540nm波长下的溶液信号值(该信号值由分析仪根据吸光度进行自动换算),可见,本实施例中对全血样本检测的线性范围为0.1-400mg/L,明显比使用未添加生物素与链霉亲和素的R2试剂的对照组的线性范围更大,对照组在C反应蛋白的浓度大于200mg/L时出现钩状效应,对照组的线性范围仅仅为0.1-200mg/L。
实施例3
参照实施例1进行,不同之处在于:所使用抗体不同,实施例3使用的是多克隆抗体。
本实施例的检测试剂包括R1试剂、R2试剂。
胶乳微球所选粒径为80nm,其表面修饰基团为羧基。
R1和R2试剂的pH为8.0。
本实施例提供测定C反应蛋白浓度的试剂盒制备方法,包括如下步骤:
1、R1试剂的制备
在调配罐中加入适量的水,调节搅拌器至合适转速,依次投入第一缓冲剂、第一表面活性剂、第一溶血剂、第一防腐剂,搅拌10-20分钟至完全溶解,溶液澄清透明无沉淀后,调节pH至8.0,定容至最终体积,制得含有如下终浓度组分的R1试剂:40mmol/L第一缓冲剂、5g/L第一表面活性剂、5g/L第一溶血剂、3g/L第一防腐剂,溶解后,通过微孔滤膜过滤,收集滤液,将过滤后的R1试剂成品放置在储存容器中,进行分装标识。第一缓冲剂为Tris(三羟甲基氨基甲烷),第一表面活性剂为PEG6000,第一溶血剂为TritonX405,第一防腐剂为ProClin-300。皂苷具有溶血作用,可与胆甾醇结合生成不溶性分子复合物,破坏血红细胞的渗透性而发生崩解,皂苷的加入,使得该试剂盒可用于检测全血中的C反应蛋白浓度。
2、R2试剂的制备
2.1 CRP羊抗人多克隆抗体-生物素复合物的制备
使用碳酸氢钠缓冲液稀释CRP羊抗人多克隆抗体,制得CRP羊抗人多克隆抗体浓度为2mg/mL的CRP单克隆抗体稀释液,使用DMF(二甲基甲酰胺)溶解生物素,得到生物素浓度为10g/L的生物素溶解液,按照CRP羊抗人多克隆抗体:生物素=0.2:1的质量比,将CRP羊抗人多克隆抗体稀释液与生物素溶解液混合,混合一定时间后,使用超滤管进行过滤,结合有生物素的CRP羊抗人多克隆抗体为大分子,被成功收集,弃去生物素等其他小分子,得到CRP单克隆抗体-生物素复合物。
2.2 CRP单克隆抗体-生物素-链霉亲和素-胶乳微球复合物的制备
使用MES缓冲剂液稀释胶乳微球,制得的胶乳稀释液中胶乳微球的固含量为0.05wt%,按照胶乳微球:链霉亲和素=1:1的质量比,将链霉亲和素加入到胶乳稀释液中,混合后,通过15000rpm转速离心1小时,去除上清液,得到链霉亲和素-胶乳微球复合物,加入MES缓冲液,超声重悬,重复3次,得到含有链霉亲和素-胶乳微球复合物的溶液,该溶液中胶乳微球的固含量为0.05wt%。
取上一步制得的链霉亲和素-胶乳微球复合物溶液,边搅拌边滴加CRP羊抗人多克隆抗体-生物素复合物,按照链霉亲和素-胶乳微球复合物:CRP羊抗人多克隆抗体-生物素复合物=5:1的质量比例进行混合,反应一定时间后,加入10%BSA溶液(牛血清白蛋白溶液)作为封闭剂,反应一定时间,将混合液以15000rpm转速离心1小时,去除上清液,得到CRP羊抗人多克隆抗体-生物素-链霉亲和素-胶乳微球复合物,加入保存液,超声重悬,重复3次,所得混合液中胶乳微球的浓度为为0.05wt%,过滤、分装,进行标识。本实施例中所使用的保存液中含有如下终浓度的组分:40mmol/L第二缓冲剂、5g/L第二表面活性剂、3g/L第二防腐剂、5g/L稳定剂,其中,第二表面活性剂为Tween-20,第二防腐剂为ProClin-300,稳定剂为海藻糖、牛血清白蛋白的混合物,海藻糖、牛血清白蛋白在保存液中的浓度均为2.5g/L,第二缓冲剂为Tris(三羟甲基氨基甲烷)。
采用本实施例的R1、R2试剂检测全血样本中C-反应蛋白的浓度。
在足量抗体存在时,浊度变化的高低与全血样本中C反应蛋白的含量成正比,在540nm波长下,通过与已知浓度的全血样本比较,可定量检测出全血样本中C反应蛋白的含量。使用本实施例的方法制备的R1、R2试剂测试已知浓度(使用深圳市国赛生物技术有限公司的Aristo全自动特定蛋白分析仪测试赋值得到)的全血样本,作为实验组3;与对照组1的检测结果进行对比。
结果如图3所示,图3中,横坐标为样本中C反应蛋白的含量,单位为mg/L,纵坐标为540nm波长下的溶液信号值(该信号值由分析仪根据吸光度进行自动换算),可见,本实施例中对全血样本检测的线性范围为0.1-400mg/L,明显比使用未添加生物素与链霉亲和素的R2试剂的对照组的线性范围更大,对照组在C反应蛋白的浓度大于200mg/L时出现钩状效应,对照组的线性范围仅仅为0.1-200mg/L。
实施例4
参照实施例3进行,不同之处在于:抗体与生物素的质量比、链霉亲和素-胶乳微球复合物与抗体-生物素复合物的质量比不同,基础缓冲剂的组分浓度有稍微调整。
本实施例的检测试剂包括R1试剂、R2试剂。
胶乳微球所选粒径为80nm,其表面修饰基团为羧基。
R1和R2试剂的pH为8.0。
本实施例提供测定C反应蛋白浓度的试剂盒制备方法,包括如下步骤:
1、R1试剂的制备
在调配罐中加入适量的水,调节搅拌器至合适转速,依次投入第一缓冲剂、第一表面活性剂、第一溶血剂、第一防腐剂,搅拌10-20分钟至完全溶解,溶液澄清透明无沉淀后,调节pH至8.0,定容至最终体积,制得含有如下终浓度组分的R1试剂:50mmol/L第一缓冲剂、10g/L第一表面活性剂、5g/L第一溶血剂、5g/L第一防腐剂,溶解后,通过微孔滤膜过滤,收集滤液,将过滤后的R1试剂成品放置在储存容器中,进行分装标识。第一缓冲剂为Tris(三羟甲基氨基甲烷),第一表面活性剂为PEG6000,第一溶血剂为Triton100,第一防腐剂为ProClin-300。皂苷具有溶血作用,可与胆甾醇结合生成不溶性分子复合物,破坏血红细胞的渗透性而发生崩解,皂苷的加入,使得该试剂盒可用于检测全血样本中的C反应蛋白浓度。
2、R2试剂的制备
2.1 CRP羊抗人多克隆抗体-生物素复合物的制备
使用碳酸氢钠缓冲液稀释CRP羊抗人多克隆抗体,制得CRP羊抗人多克隆抗体浓度为2mg/mL的CRP单克隆抗体稀释液,使用DMF(二甲基甲酰胺)溶解生物素,得到生物素浓度为10g/L的生物素溶解液,按照CRP羊抗人多克隆抗体:生物素=5:1的质量比,将CRP羊抗人多克隆抗体稀释液与生物素溶解液混合,混合一定时间后,使用超滤管进行过滤,结合有生物素的CRP单克隆抗体为大分子,被成功收集,弃去生物素等其他小分子,得到CRP单克隆抗体-生物素复合物。
2.2 CRP羊抗人多克隆抗体-生物素-链霉亲和素-胶乳微球复合物的制备
使用MES缓冲剂液稀释胶乳微球,制得的胶乳稀释液中胶乳微球的固含量为0.05wt%,按照胶乳微球:链霉亲和素=1:1的质量比,再将链霉亲和素加入到胶乳稀释液中,混合后,通过15000rpm转速离心1小时,去除上清液,得到链霉亲和素-胶乳微球复合物,加入MES缓冲液,超声重悬,重复3次,得到含有链霉亲和素-胶乳微球复合物的溶液,该溶液中胶乳微球的固含量为0.05wt%。
取上一步制得的链霉亲和素-胶乳微球复合物溶液,边搅拌边滴加CRP单克隆抗体-生物素复合物,按照链霉亲和素-胶乳微球复合物:CRP羊抗人多克隆抗体-生物素复合物=0.5:1的质量比例进行混合,反应一定时间后,加入10%BSA溶液(牛血清白蛋白溶液)作为封闭剂,反应一定时间,将混合液以15000rpm转速离心1小时,去除上清液,得到CRP羊抗人多克隆抗体-生物素-链霉亲和素-胶乳微球复合物,加入保存液,超声重悬,重复3次,所得混合液中胶乳微球的固含量为0.05wt%,过滤、分装,进行标识。本实施例中所使用的保存液中含有如下终浓度的组分:50mmol/L第二缓冲剂、10g/L第二表面活性剂、5g/L第二防腐剂、10g/L稳定剂,其中,第二表面活性剂为Tween-20,第二防腐剂为ProClin-300,稳定剂为海藻糖、牛血清白蛋白的混合物,海藻糖、牛血清白蛋白在保存液中的浓度均为5g/L,第二缓冲剂为Tris(三羟甲基氨基甲烷)。
采用本实施例的R1、R2试剂检测全血样本中C-反应蛋白的浓度。
在足量抗体存在时,浊度的高低与全血样本中C反应蛋白的含量成正比,在540nm波长下,通过与已知浓度的全血样本比较,可定量检测出全血样本中C反应蛋白的含量。使用本实施例的方法制备的R1、R2试剂测试已知浓度(使用深圳市国赛生物技术有限公司的Aristo全自动特定蛋白分析仪测试赋值得到)的全血样本,作为实验组4;与对照组1的检测结果进行对比。
结果如图4所示,图4中,横坐标为样本中C反应蛋白的含量,单位为mg/L,纵坐标为540nm波长下的溶液信号值(该信号值由分析仪根据吸光度进行自动换算),可见,本实施例中对全血样本检测的线性范围为0.1-400mg/L,明显比使用未添加生物素与链霉亲和素的R2试剂的对照组的线性范围更宽,对照组在C反应蛋白的浓度大于200mg/L时出现钩状效应,对照组的线性范围仅仅为0.1-200mg/L。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述,只是用于帮助理解本发明,并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员,依据本发明的思想,还可以做出若干简单推演、变形或替换。
Claims (10)
1.一种胶乳抗体复合物,其特征在于,所述胶乳抗体复合物为偶联有抗体、生物素、链霉亲和素的胶乳微球,所述抗体选自可以结合至C-反应蛋白的抗体。
2.如权利要求1所述的胶乳抗体复合物,其特征在于,所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体中的至少一种;
和/或,所述抗体选自鼠抗人CRP单克隆抗体、兔抗人CRP多克隆抗体、羊抗人CRP多克隆抗体中的至少一种;
和/或,所述胶乳微球选自聚苯乙烯;
和/或,所述胶乳微球的粒径为50-400nm;
和/或,所述胶乳微球的表面修饰基团选自氨基、羧基、醛基、羟基中至少一种。
和/或,所述抗体的质量与生物素的质量之比为(0.2-5):1;
和/或,所述胶乳微球的质量与链霉亲和素的质量之比为(0.5-2):1;
和/或,所述胶乳抗体复合物是由链霉亲和素-胶乳微球复合物与抗体-生物素复合物偶联得到,所述链霉亲和素-胶乳微球复合物的质量与抗体-生物素复合物的质量之比为(0.2-5):1。
3.如权利要求1至2中任一项所述胶乳抗体复合物的制备方法,其特征在于,包括:
抗体-生物素复合物制备步骤,包括将抗体与生物素混合,制得抗体-生物素复合物;
链霉亲和素-胶乳微球复合物制备步骤,包括将链霉亲和素与胶乳微球混合,制得链霉亲和素-胶乳微球复合物;
偶联步骤,包括将所述抗体-生物素复合物与所述链霉亲和素-胶乳微球复合物混合,制得偶联有抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球,即为所述胶乳抗体复合物。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述抗体-生物素复合物制备步骤中,包括使用反应液稀释抗体,得到抗体稀释液,使用有机试剂溶解生物素,得到生物素溶解液,再将所述抗体稀释液与生物素溶解液混合,反应制得抗体-生物素复合物;
和/或,所述反应液选自吗啉乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液中的至少一种;
和/或,所述有机试剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的至少一种;
和/或,所述生物素溶解液中生物素的浓度为10-50g/L;
和/或,所述抗体稀释液中,抗体的浓度为0.2-20mg/mL;
和/或,所述抗体稀释液与生物素溶解液混合,反应结束后,过滤处理,收集得到抗体-生物素复合物;
和/或,所述链霉亲和素-胶乳微球复合物制备步骤中,包括先用稀释液稀释胶乳微球,得到胶乳微球稀释液,再将所述胶乳微球稀释液与链霉亲和素混合,反应制得所述链霉亲和素-胶乳微球复合物;
和/或,所述稀释液选自吗啉乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液中的至少一种;
和/或,所述胶乳微球稀释液中,胶乳微球的固含量为0.02wt%-2wt%;
和/或,所述链霉亲和素-胶乳微球复合物制备步骤中,所述胶乳微球稀释液与链霉亲和素混合,反应结束后,固液分离处理,收集固体,得到所述链霉亲和素-胶乳微球复合物;
和/或,所述偶联步骤中,包括将链霉亲和素-胶乳微球复合物制备步骤制得的链霉亲和素-胶乳微球复合物稀释,得到链霉亲和素-胶乳微球复合物稀释液,然后将所述链霉亲和素-胶乳微球复合物稀释液与所述抗体-生物素复合物混合,反应得到所述胶乳微球偶联物;
和/或,使用缓冲液稀释所述链霉亲和素-胶乳微球复合物;
和/或,所述缓冲液选自吗啉乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液中的至少一种。
5.一种试剂,其特征在于,所述试剂含有保存液以及如权利要求1至2中任一项所述胶乳抗体复合物。
6.如权利要求5所述的试剂,其特征在于,所述保存液含有第二缓冲剂、第二表面活性剂、第二防腐剂、稳定剂中的至少一种;
和/或,所述保存液含有如下浓度的组分:5-50mmol/L第二缓冲剂、0.5-10g/L第二表面活性剂、0.5-5g/L第二防腐剂、0.5-10g/L稳定剂;
和/或,所述第二缓冲剂选自磷酸缓冲盐溶液、氨基丁三醇、甘氨酸、硼酸盐、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、吗啉乙磺酸中的至少一种;
和/或,所述第二表面活性剂选自聚乙烯吡络烷酮、丙三醇、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、吐温20、吐温40、吐温80中的至少一种;
和/或,所述第二防腐剂选自叠氮化钠、ProClin-950、ProClin-300、KroVin100、KroVin300、KroVin500、KroVin750、硫柳汞中的至少一种;
和/或,所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘露醇、明胶中至少一种;
和/或,所述试剂中胶乳微球的固含量为0.05wt%-0.2wt%。
7.一种试剂组合,其特征在于,包括权利要求1-2任意一项所述胶乳抗体复合物,或权利要求5-6任意一项所述试剂,权利要求5-6任意一项所述试剂即为R2试剂。
8.如权利要求7所述的试剂组合,其特征在于,还包括R1试剂,所述R1试剂含有第一缓冲剂、第一表面活性剂、第一溶血剂、第一防腐剂中的至少一种;
和/或,所述R1试剂含有如下浓度的组分:5-50mmol/L第一缓冲剂、0.5-10g/L第一表面活性剂、0.2-5g/L第一溶血剂、0.5-5g/L第一防腐剂;
和/或,所述R1试剂中的第一缓冲剂选自磷酸缓冲盐溶液、氨基丁三醇、甘氨酸、硼酸盐、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、吗啉乙磺酸中的至少一种;
和/或,所述R1试剂中的第一表面活性剂选自聚乙烯吡络烷酮、丙三醇、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、吐温20、吐温40、吐温80中的至少一种;
和/或,所述R1试剂中的第一溶血剂选自皂苷、Triton X-100、TritonX-405中的至少一种;
和/或,所述R1试剂中的第一防腐剂选自叠氮化钠、ProClin-950、ProClin-300、KroVin100、KroVin300、KroVin500、KroVin750、硫柳汞中的至少一种。
9.一种试剂盒,包括权利要求7或8所述试剂组合;
和/或,所述试剂盒还包括用于独立容纳所述R1试剂、R2试剂的容器;
和/或,所述试剂盒还包括包装说明书。
10.如权利要求1-2任意一项所述胶乳抗体复合物,或权利要求5-6任意一项所述试剂,或权利要求7-8所述试剂组合,或权利要求9所述试剂盒在检测C-反应蛋白中的应用;
和/或,所述应用为检测样本中C-反应蛋白的浓度;
和/或,所述样本选自全血、血清、血浆中的至少一种。
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- 2020-12-24 CN CN202011553367.8A patent/CN112798790A/zh active Pending
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