CN108570104A - 重组脂联素抗原、抗体及脂联素纳米胶乳增强免疫比浊法试剂盒 - Google Patents

重组脂联素抗原、抗体及脂联素纳米胶乳增强免疫比浊法试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组脂联素抗原，其制备包括以下步骤：a.将高表达重组人全长脂联素蛋白的细胞株在高糖DMEM培养基中培养，培养条件为0.25～0.75L/min通氧量、3～6％二氧化碳量、5‑10％牛血清量、100～200rpm转速，使细胞株达到1～3×107的细胞数；b.将培养基更换为无血清培养基，添加0.5％维他命C，使细胞株维持1～3×107的细胞数，持续表达脂联素4～10天。本发明还公开了脂联素抗体、脂联素抗体纳米乳胶颗粒和含所述抗原、抗体纳米乳胶颗粒的试剂盒。所述试剂盒采用纳米胶乳增强免疫比浊法检测脂联素的准确度高、数据真实可靠，且对2型糖尿病及糖尿病前期的预测效果好。

Description

重组脂联素抗原、抗体及脂联素纳米胶乳增强免疫比浊法试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及重组脂联素抗原、抗体及脂联素纳米胶乳增强免疫比浊法试剂盒及其应用。
背景技术
随着社会的进步，人口年龄结构的变化及生活习惯的改变，糖尿病的发病率快速增加，已成为全球范围的流行病(American Diabetes Association,Diabetes care36Suppl 1:S67-74(2013))。根据国际糖尿病联会的资料，目前全球有超过3亿8千万的糖尿病患者，并且有46％的患者直到发生严重的糖尿病并发症之后才被发现。据统计，全球每年花费在糖尿病健康医疗方面的经费超过5480亿美元(International DiabetesFederation,IDF Diabetes Atlas,6th edition/2013update(2013))。根据最近的流行病学调查，我国糖尿病患病率从1994年的1.4.％上升到2010年的11.6％，目前约有1.139亿糖尿病患者，及超过4亿9千万人处于糖尿病前期(Xu et al.,JAMA 310:948-959(2013))。我国糖尿病相关的直接医疗花费占全国卫生总费用的7.6％，糖尿病已成为威胁国民健康的头号杀手。预计在未来10年中，中国用于糖尿病、心血管疾病及中风等慢性疾病的医疗费用将高达5580亿美元，由这些慢性疾病所致的死亡人数将超过8000万。
糖尿病还是很多疾病的元凶。随着糖尿病的发展，患者往往会出现一系列并发症，包括心血管疾病、神经病变、视网膜病变及肾病，严重时可出现心肌梗塞、中风、足坏疽及肾衰竭。糖尿病一经确诊则无法逆转，目前还没有治愈糖尿病及其并发症的药物，现有药物只能控制血糖、延缓并发症的发生及减轻症状，患者需终生服药。而处在糖尿病前期的患者，大约有30％在十年左右会进展成为糖尿病(Ferrannini E.et al.Lancet DiabetesEndocrinol 2:667-675(2014))。糖尿病防治的关键在于早期发现及预测糖尿病及糖尿病前期人群。
脂联素(Adiponectin)是一种主要由脂肪细胞分泌的蛋白类激素，大量存在于血液循环中，在调节胰岛素敏感性及葡萄糖代谢的过程中扮演重要角色。在代谢性疾病中，脂联素具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化及抗炎症等功能。大量流行病学调查显示，血清/血浆中脂联素水平与胰岛素抵抗、糖尿病前期及2型糖尿病密切相关，脂联素水平在上述疾病中明显降低。了解血清/血浆中脂联素水平与糖尿病、糖尿病前期的关联可以为疾病提供有价值的信息，促进对糖尿病高发人群的跟踪随访及干预治疗，从而实现对糖尿病高风险人群的早发现、早干预、早治疗，降低糖尿病发病率。
然而，脂联素检测的临床推广还面临一系列困难或障碍。首先其临床推广受限于目前脂联素的检测方法。脂联素的检测方法主要包括：酶联免疫分析法(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay,ELISA,脂联素检测试剂盒，CN 105548173 A)，放射免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA,一种脂联素浓度的测定方法,CN103076452A)，化学发光法(chemiluminescence immunoassay,CLIA,脂联素化学发光免疫试剂盒及其制备方法和应用，CN 106199011 A)等，酶联免疫分析法灵敏度高，但操作繁琐，难于实现全自动化检测；放射免疫分析法会对对操作人员产生危害，对环境造成污染，而化学发光法也存在操作繁琐成本高、仪器普及率低等缺点。这些缺点限制了现有脂联素检测方法的推广及应用，使其难于广泛的应用于科研及临床。
纳米胶乳微球增强免疫分析法(Latex enhanced immunoassay)的是近年来出现的一种较为快速、准确、稳定的液相免疫比浊检测方法，例如CN103777023B以及CN202066863U。其基本原理是利用抗原抗体特异性结合，产生免疫沉淀反应引起液相浊度变化，来检测抗原的浓度。在一定范围内，抗原的浓度越高，免疫沉淀反应就越快，液相吸光度变化也越大。该技术通过采用纳米乳胶微球偶联特异性抗体，使抗原抗体形成的免疫沉淀物体积增大，从而放大检测信号，显著提高了检测的灵敏度。
然而，由于血液循环中的天然脂联素存在单体、三聚体、六聚体及多聚体等多种形式，同时也存在很高的糖基化，目前常用的实验室检测方法及市面上已有的脂联素检测方法，受限于其使用的抗体，只能识别血循环中的一种或几种脂联素形式，并且很难识别糖基化后的脂联素。天然脂联素形式的复杂性，导致不同检测方法测得的循环脂联素水平差别较大，即使是同一种检测方法，由于使用的脂联素特异性抗体不同，测得的脂联素水平也存在差别。从而导致脂联素正常值参考范围难于统一，限制了脂联素检测的临床推广。此外，受血循环中天然脂联素的浓度(约6mg/L)所限，天然脂联素仅能用于实验室中少量抗体的生产，无法进行大规模的生产，因此工业应用中利用重组的脂联素蛋白来大量生产抗体。
免疫动物生产脂联素特异性多抗/单抗的重组蛋白主要是通过以下几种蛋白表达***，包括：原核细胞表达***、酵母表达***、昆虫细胞表达***及哺乳动物细胞表达***，表达***越高级，能完成的翻译后修饰就越全面、越复杂，其表达出的重组蛋白就越接近于人体血循环中的天然蛋白。目前脂联素重组蛋白是主要通过原核表达***生产，由于原核表达***过于简单，不能完成复杂的翻译后修饰，所表达的蛋白在三级结构上与天然蛋白可能存在差异，而且该***只能表达脂联素单体，不能形成三聚体、多聚体等四级结构。这些重组抗原在结构上与人体血循环中的脂联素有很大不同，使用这样的重组抗原来制备脂联素特异性抗体，会导致抗体的特异性和灵敏度都不足，从而影响到下游试剂的灵敏度和特异性。而通过哺乳动物细胞表达***，特别是采用人胚胎肾细胞HEK293所生产的脂联素重组蛋白，不仅其三级结构与人体中的天然蛋白完全一致，并且除单体外，也能形成三聚体、六聚体及多聚体等四级结构，与人体血循环中的天然脂联素在结构上高度一致。采用该重组脂联素免疫动物产生的抗体，特别是多抗，能识别人体血循环中所有形式的脂联素；同时，采用该重组脂联素作为检测试剂的校准品，能够最准确的反映人体血循环中脂联素的水平，是作为确定脂联素正常值参考范围的最理想选择。然而目前国际上通过哺乳动物***生产重组脂联素产量低、成本高(产量约2mg/L，专利：US 7,365,170 B2)，限制了该重组抗原在脂联素检测方面的推广运用。
更重要的是，目前大部分对脂联素的研究例如上述专利，并没有对所生产的试剂进行详细的临床验证，未阐述测得脂联素正常水平及参考范围，未能明确脂联素异常值的范围以及测得异常值的意义，更未通过临床验证确定脂联素对2型糖尿病及糖尿病前期的预测功能，也进一步限制了脂联素检测的临床推广及运用。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种重组脂联素抗原、用重组脂联素抗原制备的抗体、用该抗体制备的脂联素抗体纳米胶乳颗粒、含脂联素抗体纳米乳胶颗粒的试剂盒及其在预测糖尿病前期和2型糖尿病中的应用。
上述的糖尿病前期是指介乎正常和糖尿病之间的中间地带，包括空腹血糖异常(空腹血糖值介乎6.1至6.9mmol/l之间)和糖耐量异常(接受口服葡萄糖耐量测试两小时后的血糖值为7.8至11.0mmol/l)。当糖尿病患者被诊断有2型糖尿病时，该疾病往往已到了中期甚至晚期，并错过了高效益的治病期。而2型糖尿病前期是治疗糖尿病以至心脑血管疾病的黄金时期。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：一种重组脂联素抗原，其制备包括以下步骤：
a.将高表达重组人全长脂联素蛋白的细胞株培养在培养基中，培养环境的二氧化碳浓度为3～6％，培养转速为100～200rpm，所述培养基为含质量百分比5～10％的牛血清的高糖DMEM培养基，培养中通氧量为0.25～0.75L/min，使细胞株达到1～3×107的细胞数；
b.将所述培养基全部更换为添加了质量百分比为0.5％的维他命C的无血清培养基，使细胞株维持在1～3×107的细胞数，持续表达。
优选地，还包括c.每2～3天更换一半体积的培养基，所述培养基为添加了质量百分比为0.5％的维他命C的无血清培养基。
更优选地，所述重组人全长脂联素蛋白采用的表达载体骨架为pRSET A；所述通氧量为0.5L/min、所述二氧化碳的浓度为5％、所述牛血清的质量百分比为10％、所述转速为120rpm，所述持续表达的时间为4～10天，优选为7天；和/或，所述高表达为表达量10mg/ml以上，优选为20mg/ml以上，更优选40mg/ml以上。
上述方法制备的重组脂联素呈多聚体、三聚体、单体共存状态，在结构上与人体血循环中的脂联素高度一致，产量、纯度高，且用其制备的脂联素抗体比现有技术中哺乳动物细胞生产的脂联素抗原(US 7,365,170B2)制备的脂联素抗体效果好，将有利于后续的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：一种脂联素抗体，其是利用所述的重组脂联素抗原制备的脂联素抗体；优选为多克隆抗体；更优选地，所述多克隆抗体抗体是羊或兔多克隆抗体。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：脂联素抗体的制备方法，其可以采用现有抗体、特别是多克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：
a.以等量弗氏完全佐剂乳化重组脂联素抗原，背部皮下多点注射山羊或兔；
b.其后每隔1～2周以弗氏不完全佐剂乳化重组脂联素抗原，同法重复注射进行加强免疫2～4次；
c.抽取血液，获得血清后纯化即得。
优选地，所述兔为新西兰大白兔。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：一种脂联素抗体纳米乳胶颗粒的制备方法，其包括以下步骤：将胶乳颗粒溶液与所述的脂联素抗体混合，进行交联反应；优选地，所述胶乳颗粒为苯乙烯和丙烯酸聚合而成的聚苯乙烯微球(俗称功能性聚苯乙烯微球)，所述乳胶颗粒表面存在羧基基团；优选为购自Bangslab的聚苯乙烯微球(俗称功能性聚苯乙烯微球)；更优选地，所述乳胶颗粒的平均粒径范围为120～200nm。
所述交联使用的交联剂可以选自EDC、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳化亚胺、酰肼、异氰酸钾或其组合，优选地，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；所述脂联素抗体的终浓度为0.5～5mg/ml；优选地，所述脂联素抗体的终浓度为3mg/ml；所述交联剂的终浓度为200mM；和/或，所述交联在室温下进行4～12小时。所述的终浓度指其在交联反应体系中的终浓度。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：一种脂联素抗体纳米乳胶颗粒，其由上述的制备方法获得。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：一种用于检测脂联素的试剂盒，所述试剂盒包括所述的脂联素抗体纳米乳胶颗粒。
优选地，所述试剂盒为纳米胶乳增强免疫比浊法试剂盒，还包括上述的重组脂联素抗原为校准品、R1试剂和R2试剂，所述R1试剂包含电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液，所述R2试剂包含电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、缓冲液和所述的脂联素抗体纳米乳胶颗粒。
更优选地，所述R1试剂含下述组分：0.5～2％的氯化钠，5～30g的PEG8000，0.05～1％的叠氮钠，100～300mmol的MOPS缓冲液，pH为7.0～8.0；R2试剂含下述组分：1～3mg/mL的脂联素抗体纳米乳胶颗粒，1～2％氯化钠，1～2％的BSA，0.5～1％的曲拉通X-100，0.05～0.5％叠氮钠，100～300mmol的MOPS缓冲液，pH为7.4～8.0，所述％为质量百分比；
优选地，所述R1试剂含下述组分：所述氯化钠为1％，所述PEG8000为15g，所述叠氮钠为0.09％，和MOPS缓冲液为250mmol，pH为7.4；所述R2含下述组分：1mg/mL的包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒，1％氯化钠，1％的BSA，0.5％的曲拉通X-100，0.09％的叠氮钠，pH为8.0和250mmol的MOPS缓冲液，所述％为质量百分比。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：一种非诊断目的的脂联素浓度的检测方法，其特征在于，所述检测方法为使用所述的试剂盒的纳米胶乳增强免疫比浊法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：所述的脂联素抗体、所述的脂联素纳米乳胶颗粒、或所述的试剂盒在制备预测糖尿病前期或2型糖尿病的试剂中的应用。
优选地，所述糖尿病前期的预测标准为脂联素含量为4～6.5mg/L；所述2型糖尿病的预测标准为脂联素含量小于4mg/L。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：1.准确度高：特异性抗体能识别人体循环中各种形式的脂联素，以及高糖基化后的脂联素，能准确反映真实脂联素水平，特异性及灵敏度高；2.测得脂联素水平真实可靠：采用哺乳动物表达***生产的脂联素作为校准品，与人体循环中脂联素高度一致，避免了由于采用脂联素单体作为校准品产生的检测结果与真实水平的偏差。3.免疫沉淀反应简单直接，从开始反应到达到平衡检测点的时间只需要5分钟，省却了ELISA、CLIA等方法需要孵育、清洗等操作步骤；4.精密度高：利用生化分析仪自动检测，步骤简单，避免了人为操作及繁琐步骤带来的干扰，重复性好。5.检测结果能准确反映人体循环中脂联素的真实水平，对糖尿病前期及2型糖尿病的预测效果好。
附图说明
图1为本发明的哺乳动物细胞表达脂联素抗原；
图2为不同浓度的抗体制备的脂联素试剂的校准品反应曲线；
图3为试剂盒的标准曲线；
图4为试剂盒的线性范围，其中4A为脂联素浓度0.8～8mg/L时的线性，4B为脂联素浓度8～80mg/L时的线性；
图5为人群中的血清脂联素水平
图6为利用本发明的试剂盒对2型糖尿病和糖尿病前期进行诊断。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1脂联素抗原的表达
1)现有技术中哺乳动物细胞表达的重组脂联素抗原
参考文献报道(US 7,365,170 B2；Xu A,et al.Testosterone selectivelyreduces the high molecular weight form of adiponectin by inhibiting itssecretion from adipocytes.J Biol Chem.2005May 6；280(18):18073-80)中重组脂联素抗原的表达方法。首先，使用上游引物：5′-GCCCG CGGAT CCATG CTGTT GCTGG GAGCT GTTC-3′和下游引物：5′-GGCCG CGAAT TCTCA CTTGT CATCG TCGTC CTTGT AGTCG TTGGT GTCATGGTAG AGAAG-3′从人脂肪细胞DNA文库(Clontech公司，美国)中扩增编码脂联素蛋白的基因。通过限制性内切酶BamHI/EcoRI处理后，将人脂联素基因***到比文献中报道的载体pcDNA3.1启动子更强的表达载体pRSET A中，并在脂联素基因羧基端***表达FLAG标签的DNA序列，构建全长脂联素融合蛋白的表达载体pR-Ad-F。将该表达载体转染到哺乳动物细胞HEK293细胞中，使用1mg/ml浓度的遗传霉素G418(购自Life Technology)筛选高表达人脂联素的稳定细胞株，保存在液氮中。从细胞中收集无血清的条件培养基DMEM培养基，使用抗FLAG M2单克隆抗体亲和凝胶纯化FLAG标记的重组脂联素抗原。
2)本发明哺乳动物细胞表达的重组脂联素抗原
由于1)的方法表达的重组脂联素抗原产量低、成本高，因此在1)的前提下，每次解冻细胞时，再次使用遗传霉素G418对细胞株进行筛选2周，杀死不能表达脂联素的细胞；然后通过恒温生物发酵罐(品牌：Sartorius stedim biotech,B)培育细胞株，通过优化通氧量(0.5L/min)、二氧化碳量(5％)、牛血清量(5-10％)、转速(120rpm)、以及优化培养基配方(高糖DMEM培养基，购于Thermo)，使细胞株在发酵罐中达到1×107的细胞数，发酵温度为37℃；然后换成无血清养料配方(SFM培养基，购自Thermo，并添加0.5％维他命C)，促进细胞株脂联素分泌。维持细胞株在高于1×107的细胞数水平分泌脂联素一周，从而大大提高脂联素的产量(40mg/L)。最后通过高压液相色谱仪(购自Bio-Rad)，使用FLAG亲和层析柱(购自Sigma)从培养基中亲和提纯脂联素融合蛋白。图1A为纯化后的本发明的重组脂联素抗原，其中泳道1为蛋白marker，2为完全还原处理后的脂联素，表现为单体，3为半还原处理后的脂联素，表现为三聚体和单体形式，4为未经还原处理的脂联素，表现为多聚体、三聚体、单体共存。上述的结果中，“还原”指：将脂联素单体与单体之间连接构成多聚体及三聚体的二硫键打开，重新成为脂联素单体。从而证实通过所述方法制备的脂联素是多聚体、三聚体、单体共存，而现有通用技术生产的脂联素多为单体。图1B即现有技术制备的脂联素抗原SDS-PAGE图，其主要表现为单体(33kDa位置)，并且纯度不够，即使经过亲和纯化等工艺后，依然有不少小分子杂蛋白，会影响后续生产抗体的质量。此外，现有技术中的脂联素表达量小于5mg/L，本发明通过工艺改进，使得脂联素的表达量达到40-50mg/L。从而降低生产成本，并减少重组脂联素的批间差，提高后续抗体生产及试剂的一致性。
实施例2脂联素抗体的制备
分别取现有技术公开的天然脂联素抗原(CN 103777023 B，购自Bio-Rad公司，简称抗原A，用其生产的抗体简称抗体A)、现有技术的重组脂联素抗原(US 7,365,170 B2，简称抗原B，用其生产的抗体简称抗体B)，以及本发明的哺乳动物细胞表达脂联素抗原各300μg，以等量弗氏完全佐剂(购自Sigma)乳化抗原，背部皮下多点注射饲养在无特定病原体(Specefic pathogen Free,SPF)动物房中的2.2～2.5kg新西兰大白兔，其后每隔两周以弗氏不完全佐剂(Sigma)乳化抗原，同法重复注射进行加强免疫3次，共计免疫4次。然后分别从不同处理组的兔子静脉抽取100ml血液，离心获得血清。各取10ml兔血清通过Protein G(Thermo，以下未特别说明的试剂或耗材均购自Thermo)免疫亲和层析柱，用1000ml TBS(20mM Tris,pH7.4,500mM NaCl,0.05％Tween-20)缓冲液反复冲洗层析柱，弃去流出液，冲洗完毕后，用10ml 100mM的glycine/HCl(pH2.5)缓冲液洗脱结合的抗体，收集于透析袋中，并放置于1000ml TBS(20mM Tris,pH7.4,500mMNaCl,0.05％Tween-20)缓冲液中，冰箱中4℃透析过夜，重复透析步骤共3次，获得纯化的三种抗人脂联素IgG多克隆抗体：抗体A、抗体B和本发明的抗体。
实施例3包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒的制备
将实施例2中获得的3种抗体即抗体A、抗体B和本发明的抗体通过化学键联的方法偶联于胶乳颗粒表面，乳胶颗粒购自Bangslab，乳胶颗粒表面已经过处理，链接有羧基化学基团。并采用本发明所述哺乳动物细胞表达的脂联素抗原制备的抗体，用于优化制备胶乳颗粒的抗体浓度。
具体步骤如下：
1)100mg含羧基的胶乳颗粒溶解到5ml MOPS缓冲液中(50mM，pH 6.4)，得到胶乳颗粒溶液。
2)将待交联脂联素特异性抗体溶解于5ml MOPS缓冲液中(50mM，pH 6.4)，浓度达到1～5mg/ml得到抗体溶液；经过优化后的抗体为浓度3mg/ml。
3)将胶乳颗粒溶液和抗体溶液充分混合，然后加入最终浓度20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于混合液中，室温下进行交联反应2～4h。
4)加入终浓度1ml 1M pH10的Tris，孵育10分钟终止交联反应。
5)收集交联了抗体的乳胶颗粒于透析袋(Thermo)中，并放置于1000mlMOPS(50mM,PH 8.0)缓冲液中，冰箱中4℃透析过夜，重复层析步骤3次。
6)使用MOPS(50mM,pH 8.0)稀释交联了抗体的乳胶颗粒，最终浓度达1mg/ml。
采用上述步骤分别获得包被所述抗体的3种胶乳颗粒：抗体乳胶颗粒A、抗体乳胶颗粒B和本发明的抗体乳胶颗粒。
表1用不同浓度的本发明的抗体来制备试剂获得的信号值
如表1所示：采用本发明所述浓度在1mg/ml到5mg/ml的脂联素抗体制备的试剂，检测不同浓度的脂联素校准品均能获得较高信号值及检测上限，其中3mg/ml浓度抗体时效果最佳。抗体浓度低于1mg/ml，比如0.5mg/ml，测得信号值明显下降；而当抗体浓度高于5mg/ml，例如浓度为6mg/ml时，其检测上限受到影响，在40mg/L浓度下出现信号值低于20mg/L浓度的勾带效应。
实施例4试剂盒的制备和性能测试
1)R1和R2试剂的制备
R1试剂由下述重量百分比的组分制成：氯化钠浓度可以为0.5～2％、本发明中为1％，PEG 8000用量可为5～30g、本发明中为15g；叠氮钠浓度可以为0.05～1％、本发明中为0.09％，pH可以为7.0～8.0，本发明中为7.4，MOPS缓冲液浓度可以为100～300mmol、本发明中为250mmol。
R2试剂由下述重量百分比的组分制成：实施例3制得包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒0.5-1.25mg/mL、本发明中为1mg/ml，1％氯化钠，1％的BSA，0.5％的曲拉通X-100，叠氮钠0.05～0.5％、本发明中为0.09％，pH可以为7.4～8.0，本发明中为8.0，MOPS缓冲液可以为100～300mmol、本发明中为250mmol。
2)试剂盒的性能测试
试剂盒测定使用日立7100全自动生化分析仪检测主波长：630nm，副波长：800nm，反应方向：上升。
试剂用量：样本1.5μ1；R1试剂150μ1；R2试剂50μ1。
测定方法(两点终点法)：150μ1R1试剂加入1.5μl样本，于37℃反应3-5分钟，然后加入50μ1R2试剂加入R2后混匀10-30秒测定吸光度A1，再5分钟后测定吸光度A2，计算信号值即吸光度差值ΔA＝A2-A1。
3)不同来源抗原制备的抗体所生产的试剂盒性能对比
不同抗体乳胶颗粒制备的试剂盒的信号值如表2所示。
表2不同抗体乳胶颗粒制备的试剂盒(单位：吸光度×10000)
使用不同来源的抗体乳胶颗粒制备增强免疫比浊试剂盒进行性能比对，发现用本发明抗体乳胶颗粒制备出的试剂盒，在相同的制备工艺及制备参数下，性能明显优于其他2种抗体乳胶颗粒生产的试剂盒，测得不同浓度校准品信号值平均是用抗体乳胶颗粒A制备的试剂盒的4.65倍，是用抗体乳胶颗粒B制备的试剂盒信号值的2.16倍，从而显著提高试剂的性能，提高灵敏度及精密度。
实施例5本发明制备的试剂盒的详细性能测试
5.1标准曲线的制定：
采用本发明的校准品，用生理盐水配制6个不同浓度的校准品溶液，浓度分别为40mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L、2mg/L和1mg/L，以及空白对照，按照上述步骤测得本发明重组脂联素校准品的标准曲线，如图3所示。图3中曲线上的每个点代表一个含量的校准品，其中x轴表示脂联素的浓度，y轴表示吸光度的差值。标准曲线方程为：y＝-1.4434x2+215.08x-38.69，相关系数r＝0.9999。
5.2质控品结果：
采用本发明的试剂，在已定标的日立7100全自动生化分析仪测试本发明的两个已知浓度的质控品各3次，记录测得脂联素浓度值，计算获得平均值，结果如表3所示。
表3质控脂联素水平
测得的质控脂联素水平均在质控品浓度范围内，说明试剂装机位置、仪器参数设置及定标符合标准。
5.3批内精密度：
按本发明试剂盒测定4份血清，同一份血清样本测试20次，计算测定均值和批内精密度，如表4所示。结果显示批内精密度为1.1％～3.96％。
表4批内精密度
5.4线性范围：
将接近线性范围上限的实施例1制备的本发明重组脂联素高浓度样本80mg/L及重组脂联素低浓度样本8mg/L，用生理盐水按9/10,8/10,7/10,6/10,5/10,4/10,3/10,2/10,1/10稀释，分别配制成10个不同浓度的校准品溶液。用实施例4所述方法检测各浓度，将测定浓度值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程为：y＝1.0109x-0.1865，相关系数r＝0.9956，表明本发明试剂盒在0.8～40mg/L线性范围内相关性好，样本浓度达80mg/L不出现钩状效应。如图4和表5所示，其中图4A为重组脂联素浓度0.8～8mg/L的线性范围，图4B为脂联素浓度8～80mg/L的线性范围。
表5脂联素线性范围
5.5分析灵敏度：
分析灵敏度是指检测方法可检测出的最低被测量浓度，也称检测限或最小检出浓度，实验方法为在一次运行中将空白样本重复测定20次，计算20次结果的均值Mean与标准差SD，以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限(Mean+2SD)。本发明分析灵敏度为0.3mg/L，具体内容参见表6。
表6灵敏度分析
5.6血红蛋白干扰实验：
干扰物选择配方和测试结果如表7所示。结果显示，使用本发明试剂盒及上机参数150μ1R1试剂，1.5μl样本，50μ1R2，试剂的抗干扰能力良好，在血红素浓度达500mg/dL时对结果无明显影响。
表7本发明抗体试剂的抗干扰能力
实施例6糖尿病样品的检测数据
前瞻性数据分析：收集到1476例健康人血样，根据实例4和5中所述方法，使用已定标的日立7100全自动生化分析仪检测血清中脂联素的水平。经检测可知，脂联素的水平分布在0.55-35.43mg/L之间(见图5)。
2型糖尿病和糖尿病前期预测：收集到1649例正常人群(年龄分布为30岁到81岁)血样并保存，对人群随访5年，每年采集血样，检测其血清中脂联素的水平。经分析发现，5年内有522例发展成为糖尿病前期，88例发展成为2型糖尿病(见图6)，发现进展为糖尿病的患者其基线脂联素水平明显低于健康组和糖尿病前期，进展为糖尿病前期的患者其基线脂联素水平明显低于健康组。经SPSS软件统计学分析，归纳了本发明的评判标准为：大于6.5mg/L的为健康组，4～6.5mg/L的为糖尿病前期高风险组，小于4mg/L的则为糖尿病高风险组。本发明实验结果表明，脂联素水平可以作为预测2型糖尿病及糖尿病前期的指标。

Claims (10)

1.一种重组脂联素抗原，其特征在于，其制备包括以下步骤：
a.将高表达重组人全长脂联素蛋白的细胞株培养在培养基中，培养环境的二氧化碳浓度为3～6％，培养转速为100～200rpm，所述培养基为含质量百分比5～10％的牛血清的高糖DMEM培养基，培养中通氧量为0.25～0.75L/min，使细胞株达到1～3×107的细胞数；
b.将所述培养基全部更换为添加了质量百分比为0.5％的维他命C的无血清培养基，使细胞株维持在1～3×107的细胞数，持续表达；
优选地，还包括c.每2～3天更换一半体积的培养基，所述培养基为添加了质量百分比为0.5％的维他命C的无血清培养基；
更优选地，所述重组人全长脂联素蛋白采用的表达载体骨架为pRSET A；所述通氧量为0.5L/min、所述二氧化碳的浓度为5％、所述牛血清的质量百分比为10％、所述转速为120rpm，所述持续表达的时间为4～10天，优选为7天；和/或，所述高表达为表达量10mg/L以上，优选为20mg/L以上，更优选40mg/L以上。
2.一种脂联素抗体，其特征在于，其是利用如权利要求1所述的重组脂联素抗原制备的脂联素抗体；优选为多克隆抗体；更优选地，所述多克隆抗体抗体是羊或兔多克隆抗体。
3.如权利要求2所述的脂联素抗体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
a.以等量弗氏完全佐剂乳化所述重组脂联素抗原，背部皮下多点注射山羊或兔；
b.其后每隔1～2周以弗氏不完全佐剂乳化重组脂联素抗原，同法重复注射进行加强免疫2～4次；
c.抽取血液，获得血清后纯化即得；
优选地，所述兔为新西兰大白兔。
4.一种脂联素抗体纳米乳胶颗粒的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：将胶乳颗粒溶液与如权利要求2所述的脂联素抗体混合，进行交联反应；优选地，所述胶乳颗粒为苯乙烯和丙烯酸聚合而成的聚苯乙烯微球，所述乳胶颗粒表面存在羧基基团；优选为购自Bangslab的聚苯乙烯微球；更优选地，所述乳胶颗粒的平均粒径范围为120～200nm。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述交联使用的交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；所述脂联素抗体的终浓度为0.5～5mg/ml；优选地，所述脂联素抗体的终浓度为3mg/ml；所述交联剂的终浓度为200mM；和/或，所述交联在室温下进行4～12小时。
6.一种脂联素抗体纳米乳胶颗粒，其特征在于，其由如权利要求4或5所述的制备方法获得。
7.一种用于检测脂联素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求6所述的脂联素抗体纳米乳胶颗粒；
优选地，所述试剂盒为纳米胶乳增强免疫比浊法试剂盒，还包括如权利要求1所述的重组脂联素抗原为校准品、R1试剂和R2试剂，所述脂联素抗体纳米乳胶颗粒属于所述R2试剂中，所述R1试剂包含电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液，所述R2试剂还包含电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂含下述组分：0.5～2％的氯化钠，5～30g的PEG8000，0.05～1％的叠氮钠，100～300mmol的MOPS缓冲液，pH为7.0～8.0；R2试剂含下述组分：1～3mg/mL的脂联素抗体纳米乳胶颗粒，1～2％氯化钠，1～2％的BSA，0.5～1％的曲拉通X-100，0.05～0.5％叠氮钠，100～300mmol的MOPS缓冲液，pH为7.4～8.0，所述％为质量百分比；
优选地，所述R1试剂含下述组分：所述氯化钠为1％，所述PEG8000为15g，所述叠氮钠为0.09％，和MOPS缓冲液为250mmol，pH为7.4；所述R2含下述组分：1mg/mL的包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒，1％氯化钠，1％的BSA，0.5％的曲拉通X-100，0.09％的叠氮钠，pH为8.0和250mmol的MOPS缓冲液，所述％为质量百分比。
9.一种非诊断目的的脂联素浓度的检测方法，其特征在于，所述检测方法为使用如权利要求7或8所述的试剂盒的纳米胶乳增强免疫比浊法。
10.如权利要求2所述的脂联素抗体、权利要求6所述的脂联素抗体纳米乳胶颗粒、或权利要求7或8所述的试剂盒在制备预测糖尿病前期或2型糖尿病的试剂中的应用；
优选地，所述糖尿病前期的预测标准为血脂联素含量为4～6.5mg/L；所述2型糖尿病的预测标准为血脂联素含量小于4mg/L。
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