CN111235074B - 一种酿酒酵母复合功能菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母复合功能菌剂组合，具有显著的提高免疫力的作用，有助于病毒性疾病的辅助治疗以及预防，并且可以直接应用于食品发酵，不管是制备成纯益生菌制品，还是制备成食品都可以，使用范围广泛，可接受度高。本发明的酿酒酵母复合功能菌剂组合，其特征在于：包括酿酒酵母DJ‑012和干酪乳杆菌LC‑N235。所述酿酒酵母DJ‑012保藏日期：2012年6月8日，保藏号CGMCC No.6200。所述干酪乳杆菌LC‑N235保藏日期：2012年5月10日，保藏编号：CCTCC M 2012157。

Description

一种酿酒酵母复合功能菌剂
技术领域
本发明涉及一种酿酒酵母复合功能菌剂，属于微生物技术领域。
背景技术
人在和病毒、细菌作斗争的过程中，免疫力发挥着至关重要的作用。它是人体识别和消灭病毒和细菌的重要***，也被称作机体的第二道防线。
面对新型冠状病毒，所有人群普遍易感。免疫力低的老人固然要注意防护，平时很少生病的年轻人也要做好防护措施。对于免疫力强的人，新型冠状病毒同样存在很大威胁。
对一个新型病毒来说，人体内没有形成抗体，普通人群需要依靠自身免疫***进行抵抗。老年人等体质较弱的人，或有基础病的人群，如慢阻肺、哮喘、气管炎、糖尿病患者，需要格外提高警惕。
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与***免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。目前研究发现酵母菌具有调节肠道平衡、促进饲料转化以及提高机体免疫功能等良好的益生特性，多作为饲料添加剂用于畜禽养殖。研究较多的酵母菌有酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属。乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。乳酸菌是最常见的益生菌，已经被广泛应用并认为对人和动物是安全的。
本发明的目的是开发一种酿酒酵母复合功能菌剂，通过特定的酿酒酵母和乳杆菌协同作用，产生具有提高免疫力的培养物。
发明内容
本发明的目的是开发一种酿酒酵母复合功能菌剂，具有显著的提高免疫力的作用，有助于病毒性疾病的辅助治疗以及预防，并且可以直接应用于食品发酵，不管是制备成纯益生菌制品，还是制备成食品都可以，使用范围广泛，可接受度高。
中国专利2012102058101公开过一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2012年6月8日，保藏号CGMCC No.6200。该菌株的已知性能为能够有效利用发酵液中的六碳糖和五碳糖生产酒精，从而充分利用发酵原料里的糖类，显著提高了原料利用率和酒精产率，降低生产成本。
本发明实施例用到的对照酿酒酵母，拉丁名称：Saccharomyces cerevisiae，可购置广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM2.200，主要用途：产精氨酸酶、酿酒产乙醇、组蛋白脱乙酰酶、烟酸等物质。
申请人研发团队在研发中发现，一般而言酿酒酵母的发酵液并无显著提高免疫力的作用，而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012的发酵液却具有较为明显的提高免疫力的作用。
中国专利2012101725644公开了一株干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235，已于2012年5月10日，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2012157。该菌株能有效地利用廉价的玉米粉糖化液发酵产L-乳酸，糖酸转化率高。在5L发酵罐中，L-乳酸产量达到了173g/L，比原始出发菌发酵提高了46.6％。
申请人研发团队进一步进行优化，发现干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012在特定的培养条件下共发酵，可以较为显著提高酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012发酵液的提高免疫力的效果。然而经过测试，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235发酵液本身并无显著的提高免疫力的作用，因此推测是其共发酵过程中，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235产生了一些刺激该酿酒酵母的活性物质。测试其他干酪乳杆菌，并无该显著效果。
实施例示例用的对照干酪乳杆菌为干酪乳杆菌市售获得的，菌株保藏编号：CICC6117。
本发明可以直接采用一步共发酵方法，优选采取分段发酵法，首先对干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235进行厌氧发酵，厌氧发酵保证其活性和增殖率，并且对培养基的物质进行预处理。接着接种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012进行好氧发酵，在此过程中，随着一定程度酒精的产生，以及氧气的不利性，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235成为发酵中的弱势菌群，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)DJ-012成为主导菌群。通过控制好培养基的糖分，可以控制酒精浓度，制备成酒精度或高或低的产品。
本发明首次发现酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012的发酵液具有提高免疫力的作用，也首次发现干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235和其共发酵能够进一步显著提高免疫力。
本发明的技术方案如下：
一种酿酒酵母复合功能菌剂组合，其特征在于：
包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235。
所述酿酒酵母DJ-012保藏日期：2012年6月8日，保藏号CGMCC No.6200。
所述干酪乳杆菌LC-N235保藏日期：2012年5月10日，保藏编号：CCTCC M2012157。
作为优选，该复合菌剂组合可以共发酵底物，也可以分段发酵底物。
所述分段发酵的方法为：首先对干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235进行厌氧发酵，厌氧发酵保证其活性和增殖率，并且对培养基的物质进行预处理。接着接种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012进行好氧发酵。
作为优选，按照重量份计，1份酿酒酵母DJ-012、1份干酪乳杆菌LC-N235。
菌种的种子液制备：
酿酒酵母DJ-012：称取保藏的酿酒酵母菌种，接种到酵母固体培养基中24小时。挑取平板中长势较好的单菌落接种至酵母液体培养基中活化，培养24h后定量成5*107(CFU/ml)酵母菌种子液。培养条件：30℃，200r/min。
酵母固体培养基：1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)，2％琼脂粉。
酵母液体培养基：1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)。
干酪乳杆菌LC-N235：取一乳杆菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养后定量成5*107(CFU/ml)干酪乳杆菌种子液。
用上述复合功能菌剂组合发酵的方法，其步骤如下：
(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，1％全脂奶粉，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；
(2)干酪乳杆菌厌氧发酵：
按照2％的接种量接种活化后的干酪乳杆菌LC-N235种子液，厌氧发酵，发酵时间12h、发酵温度30℃；
(3)酿酒酵母进行好氧发酵：
步骤(2)干酪乳杆菌发酵后，按照2％的接种量接种活化后的酿酒酵母DJ-012种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。
(4)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。
本发明的优点：
本发明创新性的提出一种新型酿酒酵母复合功能菌剂组合，可以显著提高免疫力。本发明可以直接采用一步共发酵方法，优选采取分段发酵法，首先对干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235进行厌氧发酵，厌氧发酵保证其活性和增殖率，并且对培养基的物质进行预处理。接着接种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012进行好氧发酵，在此过程中，随着一定程度酒精的产生，以及氧气的不利性，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235成为发酵中的弱势菌群，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)DJ-012成为主导菌群。通过控制好培养基的糖分，可以控制酒精浓度，制备成酒精度或高或低的产品，应用范围广泛。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
本发明所述接种量均为v/v。
实施例1：
菌种的种子液制备：
酿酒酵母DJ-012：称取保藏的酿酒酵母菌种，接种到酵母固体培养基中24小时。挑取平板中长势较好的单菌落接种至酵母液体培养基中活化，培养24h后定量成5*107(CFU/ml)酵母菌种子液。培养条件：30℃，200r/min。
酿酒酵母GIM2.200：称取保藏的酿酒酵母菌种，接种到酵母固体培养基中24小时。挑取平板中长势较好的单菌落接种至酵母液体培养基中活化，培养24h后定量成5*107(CFU/ml)酵母菌种子液。培养条件：30℃，200r/min。
酵母固体培养基：1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)，2％琼脂粉。
酵母液体培养基：1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)。
干酪乳杆菌LC-N235：取一乳杆菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养定量成5*107(CFU/ml)干酪乳杆菌种子液。
干酪乳杆菌CICC 6117：取一乳杆菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养定量成5*107(CFU/ml)干酪乳杆菌种子液。
实施例2：
用复合功能菌剂组合发酵的方法，其步骤如下：
(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，1％全脂奶粉，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；
(2)干酪乳杆菌厌氧发酵：
按照2％的接种量接种活化后的干酪乳杆菌LC-N235种子液，厌氧发酵，发酵时间12h、发酵温度30℃；
(3)酿酒酵母进行好氧发酵：
步骤(2)干酪乳杆菌发酵后，按照2％的接种量接种活化后的酿酒酵母DJ-012种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。
(4)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。
对照组1，只用酿酒酵母DJ-012：
(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，1％全脂奶粉，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；
(2)酿酒酵母进行好氧发酵：
配好培养基后，按照2％的接种量接种活化后的酿酒酵母DJ-012种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。
(3)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。
对照2，只用干酪乳杆菌LC-N235：
用复合功能菌剂组合发酵的方法，其步骤如下：
(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，1％全脂奶粉，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；
(2)干酪乳杆菌厌氧发酵：
按照2％的接种量接种活化后的干酪乳杆菌LC-N235种子液，厌氧发酵，发酵时间12h、发酵温度30℃；
(3)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。
对照3：只用酿酒酵母GIM2.200：
(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，1％全脂奶粉，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；
(2)酿酒酵母进行好氧发酵：
配好培养基后，按照2％的接种量接种活化后的酿酒酵母GIM2.200种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。
(3)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。
对照4：复配的是干酪乳杆菌CICC 6117
(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，1％全脂奶粉，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；
(2)干酪乳杆菌厌氧发酵：
按照2％的接种量接种活化后的干酪乳杆菌CICC 6117种子液，厌氧发酵，发酵时间12h、发酵温度30℃；
(3)酿酒酵母进行好氧发酵：
步骤(2)干酪乳杆菌发酵后，按照2％的接种量接种活化后的酿酒酵母DJ-012种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。
(4)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。
实施例3：
免疫力测试
1、免疫功能低下小鼠制备和给药
70只SPF级雄性KM小鼠，体质量18-22g，小鼠随机分为实施例1组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组、阳性对照组、阴性对照组，同7组，每组10只。实验前小鼠适应实验室环境3天。各组小鼠给药途径方式如下：
实施例1组：灌胃实施例1上清液(100mg/kg)D1-21
对比例1组：灌胃对比例1上清液(100mg/kg)D1-21
对比例2组：灌胃对比例2上清液(100mg/kg)D1-21
对比例3组：灌胃对比例3上清液(100mg/kg)D1-21
对比例4组：灌胃对比例4上清液(100mg/kg)D1-21
阳性对照组：灌胃蒸馏水(100mg/kg)D1-21
阴性对照组：灌胃蒸馏水(100mg/kg)D1-21
在灌胃第17天(D17)，实施例1组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组、阳性对照组小鼠腹腔注射环磷酰胺(100mg/kg)，连续5天；阴性对照组小鼠注射相同体积的生理盐水。
2、各组小鼠脾脏指数和胸腺指数检测
末次给药1h后，将小鼠处死，分离小鼠的胸腺和脾脏，剔除筋膜等组织后称质量。根据以下公式计算脾脏指数和胸腺指数：脏器指数＝脏器质量/动物体质量*100％。结果如表1所示：
表1不同组别脾脏指数和胸腺指数检测
胸腺指数(mg/g) 脾脏指数(mg/g)
实施例1组 1.77±0.20 4.25±0.15
对比例1组 1.43±0.13 3.66±0.33
对比例2组 1.31±0.11 3.38±0.13
对比例3组 1.29±0.11 3.26±0.15
对比例4组 1.45±0.12 3.74±0.14
阳性对照组 1.24±0.14 3.16±0.18
阴性对照组 1.83±0.24 4.53±0.14
结果显示，阴性对照组的胸腺指数和脾脏指数最高。在环磷酰胺导致免疫低下小鼠模型中，阳性对照组的胸腺指数和脾脏指数最低。而对比例1/4组的指数相对于对比例2/3组高，提示可能酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012的发酵液却具有较为明显的提高免疫力的作用，单用乳杆菌并没有任何效果。而实施例1组显著高于其他对比例组，接近阴性对照组，提示干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012在特定的培养条件下共发酵，可以较为显著提高酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012发酵液的提高免疫力的效果。
3、ELISA法测定各组小鼠血清IFN-γ
在末次给药1h后,将小鼠处死,摘除眼球收集血液样品，离心收集上清液，将每个处理组均设3个复孔,并预留空白孔。加入血清和标准品,37℃反应90min洗板2次，加入IFN-γ生物素化抗体工作液,37℃反应60min，加酶结合物工作液，37℃反应60min，洗板3次，加酶结合物工作液(除空白孔外),37℃反应30min，洗板3次，TMB显色，测量OD值(450nm)，测定出小鼠血清IFN-γ水平。结果如表2所示：
表2不同组别小鼠血清IFN-γ水平检测
IFN-γ(pg/ml)
实施例1组 79.21±4.93
对比例1组 37.31±3.31
对比例2组 23.43±2.11
对比例3组 25.87±2.61
对比例4组 41.65±3.63
阳性对照组 20.24±2.14
阴性对照组 90.83±7.22
IFN-γ是重压而免疫调节细胞因子，其水平下降可能引起免疫因子紊乱，导致免疫功能下降结果显示，阴性对照组的IFN-γ最高。在环磷酰胺导致免疫低下小鼠模型中，阳性对照组的IFN-γ最低。而对比例1/4组的IFN-γ水平相对于对比例2/3组高，但是低于实施例1组，提示酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012能够提高免疫低下小鼠的IFN-γ，但是单用干酪乳杆菌LC-N235无明显效果，但是当酿酒酵母DJ-012和干酪乳杆菌LC-N235在特定的培养条件下共发酵，可以较为显著提高酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)DJ-012发酵液的提高免疫力的效果。
可见，一般而言酿酒酵母的发酵液并无显著提高免疫力的作用，而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012的发酵液却具有较为明显的提高免疫力的作用。干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012在特定的培养条件下共发酵，可以较为显著提高酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012发酵液的提高免疫力的效果。然而经过测试，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235发酵液本身并无显著的提高免疫力的作用，因此推测是其共发酵过程中，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235产生了一些刺激该酿酒酵母的活性物质。测试其他干酪乳杆菌，并无该显著效果。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例。
若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种酿酒酵母复合功能菌剂组合，其特征在于：
包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DJ-012和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235；
所述酿酒酵母DJ-012保藏日期：2012年6月8日，保藏号CGMCC No.6200；
所述干酪乳杆菌LC-N235保藏日期：2012年5月10日，保藏编号：CCTCC M 2012157。
2.权利要求1所述的酿酒酵母复合功能菌剂组合，其特征在于：
该菌剂组合可以共发酵底物，也可以分段发酵底物。
3.权利要求2所述的酿酒酵母复合功能菌剂组合，其特征在于，所述分段发酵的方法为：首先对干酪乳杆菌,LC-N235进行厌氧发酵，厌氧发酵保证其活性和增殖率，并且对培养基的物质进行预处理，接着接种酿酒酵母DJ-012进行好氧发酵。
4.用权利要求1所述的酿酒酵母复合功能菌剂进行发酵的方法，其特征在于步骤如下：
(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，1％全脂奶粉，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；
(2)干酪乳杆菌厌氧发酵：
按照2％的接种量接种活化后的干酪乳杆菌LC-N235种子液，厌氧发酵，发酵时间12h、发酵温度30℃；
(3)酿酒酵母进行好氧发酵：
步骤(2)干酪乳杆菌发酵后，按照2％的接种量接种活化后的酿酒酵母DJ-012种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min；
(4)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。
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