CN106754619A - 一种在谷物培养基中添加中药组分促进益生菌生长的方法 - Google Patents

一种在谷物培养基中添加中药组分促进益生菌生长的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种促进益生菌生长和提高益生菌活菌数的方法。所述方法将益生菌接种到添加有不同中药组分的改良的MRS乳酸菌培养基或者混合谷物膨化粉培养基中进行发酵。每1升培养基中添加5g桑叶提取物或虫草多糖或多种中药混合物。益生菌为鼠李糖乳杆菌或多种混合益生菌。本发明所述方法能够显著提高发酵液中益生菌的发酵速度和益生菌的活菌数；添加桑叶提取物或虫草多糖发酵12小时后活菌数达109 CFU/mL；添加的中药组分的谷物培养基发酵后活菌数达4.1×108 CFU/mL。同时建立了使用流式检测浑浊发酵体系中益生菌活菌数的实验方法。

Description

一种在谷物培养基中添加中药组分促进益生菌生长的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种在谷物培养基中添加中药组分促进益生菌生长的方法。
背景技术
益生菌是一类定植于人体肠道、生殖***内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡，对人体健康有重要作用的活的微生物的总称，广泛应用于食品、保健品和药品生产中。LGG（ATCC 53103）是一种专利的鼠李糖乳杆菌，八十年代初由两位美国教授从健康人体内分离而得，也是目前全球研究最多的益生菌之一。大量的体外实验、动物实验、人体实验和流行病学调查研究充分证明了LGG的安全性。功能性方面，LGG具有显著的平衡和改善肠道菌群、预防和治疗腹泻、提高机体免疫力、预防过敏、结合并排除毒素、预防龋齿等功能。此外，作为一种益生菌，LGG还具有一些自身的优势：比如耐胃酸、耐胆汁、可定殖于人体肠道、最终产品（酸奶、牛奶等）保质期内活菌数保持恒定等(王世宾，刘金杰，乔岚，程琳，益生菌LGG的研究，广州食品工业科技[J],2003,s1,55-58)。研究发现，益生菌在人体肠道内的数量对益生菌发挥保健和治疗功效起到决定性作用。除了益生菌在体内增殖，在加工过程中和贮藏期间保证其存活和保持生物活性等因素外，足量的活菌数是益生菌补充剂产品发挥其有效性的必要前提。
植物性谷物原料为培养基，作为发酵底物，谷物不但可以为益生菌的生长提供必要的碳源和氮源、降低发酵成本；经过发酵后的谷物可以明显提高其营养价值和功能特性，发酵后产生的乳酸、乙酸乙酯、乙醛等芳香成分可改善谷物制品的风味和香气。赵丽娜以10%的燕麦芽-燕麦粉（燕麦芽粉：燕麦粉=2:1）和1%的脱脂乳粉为培养基，发酵9 h可以使植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的活菌数达到8.75 Log CFU/mL（赵丽娜，燕麦芽益生菌饮料的研制[D]，西北农林科技大学，2015）。周小莉研究了七株供试乳酸菌在燕麦糊基质中的生长情况，结果表明七株菌均可在燕麦中生长。且当加入麦芽后，瑞士乳杆菌在谷物基质中生长10小时后的活菌数为2.29×108 cfu/ml（周小莉，乳酸菌在燕麦基质中生长特性研究[D]，江南大学，2012）。骆超超等将酿酒酵母、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌接种到玉米汁中，发现这三株菌可以玉米为发酵底物进行繁殖发酵（骆超超，卢志勇等.几种益生菌发酵谷物饮料制作工艺研究. 东北农业大学学报. 2011.42(5): 127~129）。有专利文献报道一种谷物培养基发酵增殖益生菌的方法，是以玉米、燕麦、大豆经酶解等处理后培养两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌，38℃发酵22小时，发酵液pH可下降到4，并可获得增殖的双歧杆菌（中国专利申请号：200810015537.X）。有专利文献报道一种以糯玉米培养基发酵益生菌的方法，将糯玉米去种皮打浆后如发酵罐，按1:1接种乳酸菌种L041和L042高效发酵剂28℃缓速发酵70-80 h，发酵终端pH为2.9-3.3（中国专利申请号：200510047702.6）。
谷物作为益生菌发酵基质可以为其提供生长必须营养物质，有效增殖益生菌，但这些谷物培养基在进行发酵培养之前均需进行复杂的预处理，包括去种皮、蒸煮、酶解等复杂处理工艺。谷物膨化粉是经高温、高压膨化制得，熟化过程中可以最大限度降低营养的损耗。经膨化产生的高温高压、高剪切力可以使谷物中的淀粉颗粒膨化并精华，打开淀粉分子连接，增加食糜颗粒的表面积、提高淀粉的消化吸收率；同时膨化使蛋白质肽链裂解为肽和氨基酸，大大提高蛋白质的吸收率。使用膨化谷物可以有效简化发酵工艺、缩短发酵周期，从而降低发酵成本。
当前提高益生菌活菌总数的研究方向主要集中在发酵工艺的优化和复合菌高密度发酵。向发酵培养基中添加有益物质不但能提高益生菌的活菌数，发酵乳还能兼具有益物质的功能。林莹等将菊粉、大豆低聚糖和低聚果糖等益生素添加到酸奶中进行发酵，结果表明，益生素对双歧杆菌的增殖有显著影响，其中又以大豆低聚糖对双歧杆菌的增殖最有效，活菌数量从0.49×108 cfu/ml有效增殖到1.2×108 cfu/ml（林莹，梁世中．益生菌保健酸奶发酵剂配制和益生素对菌体数量影响的研究[J]．广州食品工业科技，2003:41-43）。有专利文献报道一种提高益生菌活菌数的方法，是将北虫草提取物加入到常规的乳酸菌培养基中，能够使乳酸菌活菌数从1.5×108 cfu/ml提高到1.3×109 cfu/ml(中国专利申请号：200910038553.5)。刘成国等将益生菌菌种接种到添加有紫薯浆的发酵牛乳基质中进行发酵，能够显著提高益生菌发酵乳中益生菌的活菌数，得到的益生菌发酵乳的最大活菌数从109-1010 cfu/ml提高到1010-1012 cfu/ml。脱脂乳中添加大豆蛋白水解物和酵母膏复合剂对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长具有显著的促进作用，添加增殖复合剂可使乳酸菌数量比脱脂乳培养基提高1-2个数量级。(白凤翎，曲玲童，***等.大豆蛋白水解物促乳酸菌增殖发酵的研究[J].食品工业科技，2012，33 (16):209-212)。李慧静等研究了添加黄芪之后嗜酸乳杆菌的生长状况的变化，她们把制备的黄芪提取液添加到改良的MRS培养基中，研究不同浓度黄芪提取液对嗜酸乳杆菌生长的影响，结果表明：当添加黄芪提取液浓度为0.032g/mL时，对嗜酸乳杆菌生长有明显的促进作用，48h OD从0.6升高到0.8（李慧静，嗜酸乳杆菌与黄芪相关性研究[D]，安徽工程大学，2013）。赵玉萍等研究不同浓度的甘草多糖和党参多糖对鼠李糖乳杆菌的影响，发现1.5%(m/v)的党参多糖对鼠李糖乳杆菌的增殖影响最大，其活菌数最大可达到3.29×109cfu/mL，提高了3倍左右，并且能够使其提前2～3 h达到最大产酸量，缩短发酵时间，较好地提高其耐酸、耐胆盐及耐高温的能力 (赵玉萍，贾建波，中药多糖对鼠李糖乳杆菌性质的影响[J]，食品科技，200,8,P13-15)。徐海燕等研究低聚木糖对乳杆菌、双歧杆菌及肠道菌群生长的影响。结果1%的低聚木糖对植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌和青春双歧杆菌有明显的增殖作用。（徐海燕，辛国芹，曹银生，武香玉，汪孟娟，谷巍，低聚木糖对益生菌及人肠道菌群的影响，药学研究 2013 第9期 P500-503）
当前益生菌增殖技术取得了一定成果，向发酵培养基中添加有益物质是一种高效、简便的提高益生菌的活菌数的方法。不但能降低发酵生产成本，在某些情况甚至能够缩短发酵周期。但是更多的具备特殊功能的添加剂的研究还不是很多。
许多食物即药物，它们之间并无绝对的分界线。山药，性甘平，具有健脾补肺固肾、益气养阴固精的功效。葛根，性辛甘而凉，既疏散肌腠经络之邪气，又鼓舞脾胃清阳之气上行，而生津止渴、升阳止泻。玉竹，甘润而补、平而少偏，入肺经滋肺阴而能润肺止咳；入胃经养胃阴而能生津止渴。白芸豆，味甘微温，既能健脾化湿，又能化湿和中而消暑，还能解酒毒。黄芪，甘温升补，主以扶正气，兼能除水邪，既善补中气、升举清阳，又善补肺气、益卫固表。黄芩，苦寒清泄而燥，善清肺与大肠之火，除上中焦湿热；兼入血分而凉血止血。
葡萄籽提取物（GSE），属多酚类物质，又称原花青素。20世纪80年代以来，人们对其进行了大量生化、药理活性等研究。结果表明GSE是清除自由基能力最强的抗氧化剂，是迄今为止所发现的最强的有效氧自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂，能够防治80多种因自由基引起的疾病，包括心脏病、癌症及关节炎等病症（赵超英, 姚小曼. 葡萄籽提取物原花青素的营养保健功能(综述)[J]. 中国食品卫生杂志, 2000, 12(6):38-41.）。因其资源丰富、疗效确切、副作用小等特点，在欧洲、日本备受青睐，近年来又风靡美国。桑叶含有多种活性化学成分，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、抗病毒等功效（欧阳臻, 陈钧. 桑叶的化学成分及其药理作用研究进展[J]. 江苏大学学报自然科学版, 2003, 24(6):39-44.）。冬虫夏草作为我国传统的名贵药材已经有很长的历史，虫草多糖作为虫草的主要活性成分之一，具有多种药理活性。人工发酵虫草多糖具有抗肿瘤 、降血糖 、抗氧化和提高免疫能力等多种药理活性。但是经过益生菌发酵的虫草多糖的研究尚较少见。
但是，当前关于中药组分对益生菌具有增殖作用的研究尚没有文献报道，添加中药组分的微生态制剂也未见报道。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种提高益生菌活菌数的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供了一种体外培养促进益生菌生长和提高益生菌活菌数的方法，所述方法为：将益生菌菌种接种到添加有中药组分溶液的培养基中，进行益生菌的增殖发酵。
前述方法具体技术方案包括以下步骤：
（1）中药组分溶液的制备：准确称量各种中药组分配置成中药组分的浓溶液，搅拌至溶解，115 ℃灭菌30 min；
（2）增菌培养基的配置：将步骤（1）制备得到的中药组分浓溶液加至灭菌后的改良MRS培养基或谷物培养基中；同时准备一个未添加中药组分的对照组
（3）益生菌种子液的制备：将保存到的益生菌菌株，经复苏、扩大后制成种子液；
（4）益生菌的增菌培养：将步骤（3）得到的益生菌种子液，接种到步骤（2）得到的增菌培养基中进行增菌发酵培养。
（5）活菌数的测定：对初始发酵培养基澄清无沉淀等浑浊现象的发酵液采用常规OD600光密度计数法。发酵的过程从0 h开始，每间隔一段时间测定一次活菌数，最终获得该益生菌的最大活菌数。同时，使用了流式细胞计数仪，对不能进行光密度检测的混浊发酵体系进行活菌数检测。
较优地，所述步骤（1）中，黄芩、山药、葛根、玉竹、白芸豆、葡萄籽、绿茶、黄芪以100mg/mL的浓度配置成中药组分的DMSO浓溶液。DMSO溶液可以提高中药组分的溶解性，且按之后的比例加入到增菌培养体系，DMSO并不会抑制益生菌的生长增殖。桑叶提取物、虫草多糖（50%）以100 mg/mL的浓度配置成中药组分的水浓溶液。
较优地，所述步骤（2）中，步骤（1）中所得中药组分溶液按一定体积加至增菌发酵培养基中，使中药终浓度为0.1 mg/mL至5 mg/mL。所述的改良乳酸菌培养基（改良MRS）配置好后于115℃、0.1 Mpa下灭菌30 min。改良MRS配方如下：
成分 用量（g）
蛋白胨 20.0
牛肉膏 10.0
酵母膏 5.0
柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 4.0
葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0
吐温-80 3.0 mL
乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0
磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.25
硫酸锰（MnSO4·H2O） 0.05
琼脂 18.0
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.0
所述的谷物培养基配方如下：8种80～100目的谷物膨化粉（燕麦、荞麦、高粱米、粟米、薏米、绿豆、黑豆、黄豆）按照8%的总固含量配置成发酵培养基，培养基中各种谷物组分含量相等。配置好的谷物培养基115℃、0.1 Mpa下灭菌25-30 min。
较优地，所述步骤（3）中，将益生菌（植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌）菌种冻存液，分别以1% (v/v)的比例加入到改良MRS培养基中，37℃静止培养12小时进行菌种的复苏；按10%～20% (v/v)的比例将复苏菌液接种到改良MRS培养基中，37℃静止培养12小时进行益生菌种子液的制备。
较优地，将步骤3)得到的益生菌种子液按照3%(v/v)的比例接种到步骤2)得到的增菌培养基中进行增菌培养。当混菌发酵时，多种菌种子液的总添加量为发酵体系的3%(v/v)。增菌培养温度为37oC，增菌培养时间为16 – 24 h。
本发明以益生菌为发酵菌种，通过在增菌培养基中添加经处理的中药组分溶液，在适宜温度下，显著提高了增菌培养过程中益生菌的生长和活菌数，从而为之后制备益生菌微生态制剂提供大量活益生菌菌体。另外，如在微生态制剂中加入适量的中药组分，不仅可以促进人体胃肠道内部分益生菌的生长，还可以起到其他保健作用。本发明还综合利用了低成本的中药组分资源，并发现了中药组分在提高益生菌活菌数中的作用，并且对部分种属的益生菌有明显的增殖效果。通过添加中药组分也可以显著提高谷物发酵体系中的活菌数，同时增加谷物发酵制品的营养组分，增加了对人体健康的多方面调节作用。
附图说明
图1是不同浓度桑叶提取物对鼠李糖乳杆菌体外增殖的的作用。
图2是不同浓度虫草多糖（50%）对鼠李糖乳杆菌体外增殖的的作用。
图3是流式细胞仪检测谷物发酵体系中益生菌的活菌及死菌数量。
图4是添加中药组分对谷物发酵培养基中益生菌的增殖作用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1) 中药组分溶液的制备：将桑叶提取物或虫草多糖（50%）分别以100 mg/mL的浓度加入蒸馏水中配置成中药组分的水浓溶液，搅拌至溶解，115℃灭菌30min。
2) 增菌培养基的配置：将步骤(1)制备得到的中药组分溶液按一定浓度加至改良MRS培养基中，使中药组分终浓度为分别为0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL。所述的改良乳酸菌培养基（改良MRS）配置好后于115℃、0.1 Mpa下灭菌30 min，灭菌后自然冷却。配方如下：
成分 用量（g）
蛋白胨 20.0
牛肉膏 10.0
酵母膏 5.0
柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 4.0
葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0
吐温-80 3.0 mL
乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0
磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.25
硫酸锰（MnSO4·H2O） 0.05
琼脂 18.0
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.0
3)益生菌种子液的制备：将保存的鼠李糖乳杆菌菌株，经复苏扩大后制成种子液。将鼠李糖乳杆菌种以1% (v/v)的比例加入到改良MRS培养基中，37℃静止培养12小时进行菌种的复苏；按10% (v/v)的比例将复苏菌液接种到改良MRS培养基中，37℃静止培养12小时进行鼠李糖乳杆菌种子液的制备。
4) 益生菌的增菌培养：将步骤(3)得到的益生菌种子液接种到步骤(2)得到的增菌培养基中进行增菌。种子液按照3%(v/v)的比例加至增菌培养基。增菌培养温度为37℃，增菌培养时间为16 h。
5）活菌数的测定：发酵的过程从0 h开始，采用常规10倍稀释平板厌氧培养计数法每间隔一段时间测定一次活菌数，最终获得该益生菌的最大活菌数。
实施例2
1) 中药组分溶液的制备：将黄芩、山药、葛根、玉竹、白芸豆、葡萄籽、绿茶、黄芪加入DMSO中，搅拌至溶解，115℃灭菌30min。所述中药组分以100 mg/mL的浓度配置成中药组分的DMSO浓溶液。
2) 增菌培养基的配置：将步骤(1)制备得到的中药组分溶液按一定浓度加至谷物培养基中，使中药组分终浓度为0.1 mg/mL。所述的谷物培养基配置方法为：将8种80～100目的谷物膨化粉（燕麦、荞麦、高粱米、粟米、薏米、绿豆、黑豆、黄豆）按照8%的总固含量配置成发酵培养基，其中谷物培养基中各种谷物组分含量相等。配置好的谷物培养基115℃、0.1Mpa下灭菌25-30 min。
3) 益生菌种子液的制备：将保存的益生菌菌株（植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌），经复苏扩大后制成种子液。将鼠李糖乳杆菌种以1% (v/v)的比例加入到改良MRS培养基中，37℃静止培养12小时进行菌种的复苏；按10% (v/v)的比例将复苏菌液接种到改良MRS培养基中，37℃静止培养12小时进行益生菌菌种子液的制备。所述的改良乳酸菌培养基（改良MRS）配置好后于115℃、0.1Mpa下灭菌30 min，灭菌后自然冷却。配方如下：
成分 用量（g）
蛋白胨 20.0
牛肉膏 10.0
酵母膏 5.0
柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 4.0
葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0
吐温-80 3.0 mL
乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0
磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.25
硫酸锰（MnSO4·H2O） 0.05
琼脂 18.0
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.0
4) 益生菌的增菌培养：将步骤(3)得到的益生菌种子液接种到步骤(2)得到的增菌培养基中进行增菌。种子液按照3%(v/v)的比例加至增菌培养基。增菌培养温度为37℃，增菌培养时间为20 h。
5）活菌数的测定：采用流式细胞仪计数法测定发酵液中益生菌菌数，获得谷物发酵液中益生菌的活菌数与死菌数。流式细胞仪计数法的具体操作如下所述：
a. 样品准备，将取出的发酵液进行适当的稀释，使待检测菌液样品中活菌数的数量范围在5.5×105～6.5×105 CFU/mL。稀释后的发酵液样品经300目纱网过滤，取稀释后的待检样品200 μL加入到1.5 mL的EP管中，于37℃恒温培养箱温浴3分钟。
b. 样品染色，待检样品200 μL中加入2μL 100×Sybr Green I和2μL 100×PI，37℃避光染色10分钟。Sybr Green I和PI (Propidium Iodide) 是两种常见的DNA荧光染料。Sybr Green I能穿透活细胞和死细胞的细胞膜，而PI不能很好地穿透活细胞的细胞膜。利用Sybr Green I和PI染色细菌，可将细菌分为三群：Sybr Green I (+) PI(-) 的活细菌，Sybr Green I (+) PI(+)的死细菌，以及处于两群之间的损伤细菌。
c. C6 Accuri绝对计数，C6 Accuri流式细胞仪分析样品，阈值设为FSC-H大于10000，流速选择慢速，采样量设置为60μL，进行绝对计数检测。
d. 以FL1-H为横坐标，FL2-A为纵坐标，画细胞密度图。通过分析水样密度图、菌液以及加热后的菌液，根据这些样品的细胞分群，圈设门计数。
根据本发明得到的益生菌谷物发酵液的最大活菌数可达到4.1×108 CFU/mL，与未添加中药组分成分的发酵液获得的最大活菌数1.4×108 CFU/mL相比，有显著的提高。
虽然，上文中己经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种促进益生菌生长和提高益生菌活菌数的方法，其特征在于，所述方法为：将益生菌菌种接种到添加有中药组分的培养基中，进行发酵培养，使用谷物培养益生菌的方法，并使用中药组分提高益生菌活菌数的方法，其特征在于，所述方法为：此种使用谷物膨化粉进行益生菌培养，并添加药食同源中药组分，进行发酵培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:
1)中药组分溶液的制备：使用蒸馏水溶解各种中药组分，制成中药组分浓溶液；
2)益生菌种的活化与种子液的制备；依次对保存的菌种进行复苏活化和扩大，得到种子液；
3)添加中药组分的培养基的制备：利用谷物膨化粉进行组合作为发酵培养基；并向改良的MRS培养基或谷物膨化粉培养基中加入步骤1)制备得到的中药组分溶液，依次进行灭菌、冷却；
4)益生菌的发酵培养：将步骤2)得到的益生菌接种到步骤3)得到的添加中药组分的培养基中进行发酵培养；
5) 浑浊发酵体系的益生菌活菌数检测：使用Sybr Green I和PI进行染色，以FL1-H为横坐标，FL2-A为纵坐标，画细胞密度图，并进行细菌数目统计。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述益生菌为鼠李糖乳杆菌或植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌的等比混合菌液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述培养基的中药组分添加量为质量分数0.1%-0.5%（m/v），115oC灭菌30min，冷藏备用。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中改良的MRS培养基配置完成后调节pH，在高压灭菌锅中115oC灭菌30min，取出冷却到37oC左右。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述益生菌复苏接种的接种量为1%，扩大的接种量为10%-20%，发酵的接种量为3%。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中发酵的发酵温度为37oC，发酵时间为6h-14h。
8.权利要求1-7任一项所述的方法提高益生菌生长和活菌数的方法。
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