CN103039699A - 一种混合菌发酵饲料及其制备和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种副干酪乳杆菌等混合菌生产的发酵饲料及其制备和应用方法。由副干酪乳杆菌（CICC20296）、枯草芽孢杆菌(ACCC10619)、酿酒酵母(CICC32236)先液体单独发酵培养，再将发酵液按体积比1:1:1混合，接种到固体培养基中混合均匀后，置于密封容器中厌氧发酵，10-37℃培养75~240小时，产品活菌数可达200-300×10⁸cfu.g^-1，产品无需干燥直接饲用。本发明提出的发酵饲料的制备方法减少了抗生素的使用，所得到的发酵饲料含有大量的菌体蛋白、丰富的氨基酸和维生素等营养物质，有利于促进肠道菌群平衡，提高禽畜机体免疫力，提高生产性能，降低饲养成本。

Description

一种混合菌发酵饲料及其制备和应用方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌等混合菌生产的发酵饲料及其制备和应用方法。 

背景技术

在动物日粮中添加抗生素显著促进了动物生产，并对集约化畜牧业的发展做出了重大贡献。然而随着时间的推移，饲料中添加抗生素的危害日益显现，并受到社会的广泛关注。欧盟自2006年1月起全面禁止在畜禽饲料中添加抗生素。随后，日本和韩国等亚洲国家也相继制定了畜禽无抗生素饲养规范。在生猪等饲养中不得添加抗生素目前已经是国际公认的食品安全标准。 

无抗发酵饲料是利用有益微生物发酵饲料，形成富含大量活性有益微生物、有机酸及微生物代谢产物，且不含有任何抗生素的微生物发酵饲料。以提供真蛋白及乳酸菌为主，长期饲用的畜禽体内无抗生素残留。富含大量的乳酸菌、酵母菌，在微生物的作用下合成动物所需要的氨基酸、维生素、消化酶和乳酸等，使饲料的营养更全面，生物效价更高。不但可以弥补常规饲料中容易缺乏的氨基酸，而且能使其它粗饲料原料营养成份迅速转化，达到增强消化吸收利用效果。 

使用微生物发酵饲料喂养的家畜家禽，其体内不含残留抗生素和有害的化学添加剂，不但使食用肉的标准达到和超过了欧盟食用肉的标准，而且使肉中的风味物质提高了，口感更好。同时，由于畜群患病几率减低，生长稳定，操作简便，从而大大降低了农民的饲养成本，提高了养殖经济效益，特别适合在我国广大农村推广使用。 

“无抗发酵饲料”的研发将促进“无抗猪肉”的生产，为老百姓，提高我国畜禽养殖业饲料转化利用率、猪肉品质，增强饲料工业产品的国际竞争力。 

发明内容

本发明的目的是提供一种副干酪乳杆菌等混合菌生产的发酵饲料及其制备和应用方法，本发明提出的发酵饲料的制备方法减少了抗生素的使用，所得到的发酵饲料含有大量的菌体蛋白、丰富的氨基酸和维生素等营养物质，有利于促进肠道菌群平衡，提高禽畜机体免疫力，提高生产性能，降低饲养成本。 

一种混合菌发酵饲料的制备方法：由副干酪乳杆菌（CICC20296）、枯草芽孢杆菌(ACCC10619)、酿酒酵母(CICC32236)分别液体发酵培养，发酵液按体积比1:1:1混合后进行固体发酵培养而成。 

具体包括以下步骤： 

（1）液体发酵 

将经过斜面活化的副干酪乳杆菌取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，培养条件为：MRS培养基，35~37℃，pH自然，静置培养18~22h；然后按3～7％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为MRS培养基，所述发酵条件为：35~37℃，pH自然，装液量50~70％，静置培养36~60h； 

将经过斜面活化的枯草芽孢杆菌取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，培养条件为：LB培养基，28~32℃，pH6.8～7.2，摇床转速180~220r／min，培养16~20h；然后按2~8％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为LB培养基，所述发酵条件为：28~32℃，pH6.8～7.2，装液量10~30％，摇床转速180~220r／min，培养20~24h； 

将经过斜面活化的酿酒酵母取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，培养条件为：PDA培养基，26~30℃，pH6.2~6.8，摇床转速180~250rpm；培养16~20h；然后按4~8％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为PDA培养基，所述发酵条件为：26~30℃，pH6.2~6.8，装液量10~30％，摇床转速180~250rpm；培养26~34h； 

（2）固体发酵 

分别取步骤（1）得到的三种发酵液按体积比1:1:1混合，按质量百分比3-10%的接种量将发酵液与培养基主料充分混合,含水量控制在35~55%范围；培养基主料包括：畜禽全价料或者饲料原料； 

（3）将步骤（2）得到的混合物料置于密封容器中，在10~37℃发酵环境温度下静止发酵，连续固态厌氧发酵75~240小时；产品活菌数达200~300×10⁸cfu.g^-1。 

上述饲料原料包括麦麸、玉米粉、豆饼粉中的一种或几种。 

上述固体发酵在密封的发酵罐、发酵池、塑料容器或真空袋中完成。 

一种发酵饲料，是由上述的方法制备而成的饲料。 

上述的发酵饲料的应用方法是：直接，或者添加到饲料中喂饲畜禽；在饲料或者饲料原料中添加质量浓度为5%-30%。 

本发明产品无需干燥可直接饲用。 

本发明使用的副干酪乳杆菌（CICC20296）和酿酒酵母(CICC32236)购自中国工业微 生物菌种保藏管理中心，枯草芽孢杆菌(ACCC10619)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。 

本发明提出的发酵饲料的制备方法减少了抗生素的使用，所得到的发酵饲料含有大量的菌体蛋白、丰富的氨基酸和维生素等营养物质，有利于促进肠道菌群平衡，提高禽畜机体免疫力，提高生产性能，降低饲养成本。 

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。 

实施例1 

（1）液体发酵 

将经过斜面活化的副干酪乳杆菌（CICC20296）取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，MRS培养基，35℃，pH自然，静置培养18h；然后按3％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为MRS培养基，所述发酵条件为：35℃，pH自然，装液量50％，静置培养36h； 

将经过斜面活化的枯草芽孢杆菌(ACCC10619)取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，LB培养基，28℃，pH6.8，摇床转速180r／min，培养16h；然后按2％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为LB培养基，所述发酵条件为：28℃，pH6.8，装液量10％，摇床转速180r／min，培养20h； 

将经过斜面活化的酿酒酵母(CICC32236)取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，PDA培养基，26℃，pH6.2，摇床转速180rpm；培养16h；然后按4％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为PDA培养基，所述发酵条件为：26℃，pH6.2，装液量10％，摇床转速180rpm；培养26h； 

（2）固体发酵 

培养基主料：畜禽全价料（或麦麸、玉米粉、豆饼粉等饲料原料）； 

接种：分别取发酵液按体积比1:1:1混合，以3%接种量将发酵液与固体培养基充分混合,含水量控制在35%； 

（3）将混合物料置于密封容器中（固体发酵可在密封的发酵罐、发酵池、塑料容器、真空袋中完成，采用两步法发酵），在10℃发酵环境温度下进行连续固态厌氧发酵240小时；（4）产品活菌数可达200×10⁸cfu.g^-1，产品无需干燥直接饲用。 

实施例2 

（1）液体发酵 

将经过斜面活化的副干酪乳杆菌（CICC20296）取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，MRS培养基，36℃，pH自然，静置培养20h；然后按5％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为MRS培养基，所述发酵条件为：36℃，pH自然，装液量60％，静置培养48h； 

将经过斜面活化的枯草芽孢杆菌(ACCC10619)取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，LB培养基，30℃，pH7.0，摇床转速200r／min，培养18h；然后按5％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为LB培养基，所述发酵条件为：30℃，pH7.0，装液量20％，摇床转速200r／min，培养22h。 

将经过斜面活化的酿酒酵母(CICC32236)取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，PDA培养基，28℃，pH6.5，摇床转速220rpm；培养18h；然后按6％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为PDA培养基，所述发酵条件为：28℃，pH6.5，装液量20％，摇床转速220rpm；培养30h。 

（2）固体发酵 

培养基主料：畜禽全价料（或麦麸、玉米粉、豆饼粉等饲料原料）； 

接种：分别取发酵液按体积比1:1:1混合，以6%接种量将发酵液与固体培养基充分混合,含水量控制在45%； 

（3）将混合物料置于密封容器中（固体发酵可在密封的发酵罐、发酵池、塑料容器、真空袋中完成，采用两步法发酵，在25℃发酵环境温度下进行连续固态厌氧发酵120小时；（4）产品活菌数可达300×10⁸cfu.g^-1，产品无需干燥直接饲用。 

实施例3 

（1）液体发酵 

将经过斜面活化的副干酪乳杆菌（CICC20296）取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，MRS培养基，37℃，pH自然，静置培养22h；然后按7％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为MRS培养基，所述发酵条件为：37℃，pH自然，装液量70％，静置培养60h； 

将经过斜面活化的枯草芽孢杆菌(ACCC10619)取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，LB培养基，32℃，pH7.2，摇床转速220r／min，培养20h；然后按8％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为LB培养基，所述发酵条件为：32℃，pH7.2，装液量30％，摇床转速220r／min，培养24h。 

将经过斜面活化的酿酒酵母(CICC32236)取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，PDA培养基，30℃，pH6.8，摇床转速250rpm；培养20h；然后按8％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为PDA培养基，所述发酵条件为：30℃，pH6.8，装液量30％，摇床转速250rpm；培养34h。 

（2）固体发酵 

培养基主料：畜禽全价料（或麦麸、玉米粉、豆饼粉等饲料原料）； 

接种：分别取发酵液按体积比1:1:1混合，以10%接种量将发酵液与固体培养基充分混合,含水量控制在55%； 

（3）将混合好物料置于密封容器中（固体发酵可在密封的发酵罐、发酵池、塑料容器、真空袋中完成，采用两步法发酵），在37℃发酵环境温度下进行连续固态厌氧发酵75小时； 

（4）产品活菌数可达250×10⁸cfu.g^-1，产品无需干燥直接饲用。 

实施例4不同益生菌对病原菌的抑菌试验 

从表1可以看出，副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌这4种试验菌对4种病原菌均具有一定的抑菌效果。其中副干酪乳杆菌对4种病原菌抑菌效果最好，枯草芽孢杆菌次之。且副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌混合菌液对4种病原菌也均具有较强的抑菌作用，因此选用抑菌效果好的副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌为试验菌株。 

表1单位：mm 

实施例5发酵饲料菌种特性研究 

（1）耐酸试验 

由表2可知，随着pH的降低活菌含量逐渐下降，副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母在pH2.0环境均可存活，有一定的耐受能力，其中，枯草芽孢杆菌对pH3．0的环境耐受稍差，但仍有相当一部分存活率。在pH为3.0时，酵母的生长状况较好：在pH5.0时，各试验菌均有较好的增殖现象；在pH6.0时，各试验菌增殖效果明显；说明三种试验菌均具有一定的抗酸能力。 

表2单位：（CFU/ml） 

（2）耐胆盐试验 

由表3可知，副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母在胆盐浓度为0.3％时均有明显的增殖现象；而在胆盐浓度为0.6％和0.9％时，枯草芽孢杆菌具有较好的增殖现象；在胆盐浓度为0.3~1.2时，酿酒酵母均有明显的增殖现象。说明副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母对胆盐具有一定的耐受力。 

表3单位：试验菌（CFU/ml） 

（3）人工模拟胃液的耐受性试验 

人工模拟猪体胃液试验的结果如表4，随着时间的延长呈渐进性降低，作用2h活菌存活率均在70％以上，而试验菌能耐受模拟胃液环境时间超过2h。说明，试验菌通过猪体 胃液环境存活的可能性较大。 

表4单位：CFU/ml 

（4）人工模拟肠液的耐受性试验 

由表5可知，在人工模拟猪体肠液环境下，试验菌均具有一定的存活率，平均可达80％以上，耐受时间可超过4h。说明试验菌通过猪体肠液环境存活的可能性较大。 

表5单位：CFU/ml 

本发明通过抑菌试验、耐酸试验、耐胆盐试验及人工模拟猪体胃、肠道环境等一系列试验，对试验用副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母进行了生物学特性的研究，最终结果表明：这三种试验菌均表现出较强的耐受性，对于酸、胆盐等环境条件具有一定的耐受能力，可以抵抗猪胃肠消化道环境对菌体的耐受要求，副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌具有较好的抑菌效果。试验表明，试验菌适合于猪体肠道内的生存环境，能够保证有一定存活数量的活菌到达猪体胃肠道，从而保证有足够的活菌能顺利通过胃、十二指肠，到达小肠发挥益生作用。所以，副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母可适合作为发酵饲料的选用菌株，用于发酵饲料的研制。 

实施例6固体发酵混合菌种不同配比比例的确定 

固体发酵混合菌种不同配比比例对发酵工艺及产品均有较大的影响。为了确定选用菌 种的最佳配比，本试验将副干酪乳杆菌：酿酒酵母：枯草芽孢杆菌分别以1：1：1、2：1：1、1：2：1、1：2：2和2：2：1的体积比，分别接种于固体发酵培养基，接种量5％(按比例混合后的总接种量)，含水量控制在40%；将混合物料置于密封容器中在28℃发酵环境温度下进行连续固态厌氧发酵120小时；测定发酵产物的活菌数量。结果如表6所示。 

表6 

由表6可以看出，副干酪乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌在体积比为1：1：1时，发酵产物活菌含量增幅最高，可达2.32×10¹⁰cfu／g。因此，选择副干酪乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌为1：1：1的体积比进行固体混合发酵。 

实施例6、复合菌发酵饲料对仔猪生产性能的影响 

本实例在湖南永州恒惠猪场进行，试验设计选择健康断奶仔猪150头（28日龄到30日龄断奶后仔猪），按体重相近原则随机分成5处理，每个处理3个重复，每个重复10头仔猪，分为抗生素对照组、无抗日粮+10%发酵饲料组、无抗日粮+20%发酵饲料组和无抗日粮+30%发酵饲料组，无抗日粮+20%市售发酵饲料组（市售发酵饲料主要成分是植物乳杆菌、地衣芽胞杆菌、酿酒酵母，其中活菌数≥50×10⁸cfu/ml），试验期45天，试验结果如下表。 

表7复合菌发酵饲料对仔猪生产性能的影响 

以上的试验结果表明，使用本发明技术生产的产品——无抗发酵饲料能够有较大幅度减少仔猪断奶后腹泻的发生率，提高仔猪生长速度，改善饲料转化利用效率，是一种可以替代抗生素、控制腹泻和促进生长的理想绿色环保微生态发酵饲料。 

本发明研究出了用于替代抗生素的无抗发酵饲料的生产及其使用方法，试验结果表明：本方法制备的无抗发酵饲料对仔猪有增重和预防腹泻的作用。 

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进或变换都属于本发明所附权利要求的保护范围。 

Claims (7)

1.一种混合菌发酵饲料的制备方法，其特征是：由副干酪乳杆菌（CICC20296）、枯草芽孢杆菌(ACCC10619)、酿酒酵母(CICC32236)分别液体发酵培养，发酵液按体积比1:1:1混合后进行固体发酵培养而成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，具体包括以下步骤：

（1）液体发酵

将经过斜面活化的副干酪乳杆菌取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，培养条件为：MRS培养基，35~37℃，pH自然，静置培养18~22h；然后按3～7％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为MRS培养基，所述发酵条件为：35~37℃，pH自然，装液量50~70％，静置培养36~60h；

将经过斜面活化的枯草芽孢杆菌取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，培养条件为：LB培养基，28~32℃，pH6.8～7.2，摇床转速180~220r／min，培养16~20h；然后按2~8％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为LB培养基，所述发酵条件为：28~32℃，pH6.8～7.2，装液量10~30％，摇床转速180~220r／min，培养20~24h；

将经过斜面活化的酿酒酵母取一环斜面菌株接种到种子摇瓶培养，培养条件为：PDA培养基，26~30℃，pH6.2~6.8，摇床转速180~250rpm；培养16~20h；然后按4~8％接种量接种进行液体发酵培养，所述培养基为PDA培养基，所述发酵条件为：26~30℃，pH6.2~6.8，装液量10~30％，摇床转速180~250rpm；培养26~34h；

（2）固体发酵

分别取步骤（1）得到的三种发酵液按体积比1:1:1混合，按质量百分比3-10%的接种量将发酵液与培养基主料充分混合,含水量控制在35~55%范围；培养基主料包括：畜禽全价料或者饲料原料；

（3）将步骤（2）得到的混合物料置于密封容器中，在10~37℃发酵环境温度下静止发酵，连续固态厌氧发酵75~240小时；产品活菌数达200~300×10⁸cfu.g^-1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，饲料原料包括麦麸、玉米粉、豆饼粉中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，固体发酵在密封的发酵罐、发酵池、塑料容器或真空袋中完成。

5.一种发酵饲料，其特征是：由权利要求1-4任一项所述的方法制备而成的饲料。

6.权利要求5所述的发酵饲料的应用方法，其特征是：直接，或者添加到饲料中喂饲畜禽。

7.根据权利要求6所述的发酵饲料的应用方法，其特征是：在饲料或者饲料原料中添加质量浓度为5%-30%。