CN111187767A - 一种快速提取血浆、尿液游离dna的试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速提取血浆、尿液游离DNA的试剂盒和方法。核酸释放与结合剂，包括2.5M～3.5M GuSCN、30％～35％V/V的异丙醇、3％～5％V/V的Triton X100、45mM～55mM EDTA、15mM～25mM Tri‑HCl、质量分数0.3％～0.6％DTT，溶剂为水。本发明提供了一种从血浆、尿液分离游离DNA的方法，该方法操作过程简便快捷，250ul样本即可获得足够的DNA且分离的DNA含量和纯度高，重复性高，半小时内即可完成大批量样本的处理。
Description
技术领域：
本发明属于DNA提取领域，具体涉及一种快速提取血浆、尿液游离DNA的方法。
背景技术：
核酸提取是下游核酸检测、研究或产品开发的起点，所分离的核酸的质量和完整性直接影响研究或诊断结果，因此核酸抽提是分子生物学最关键的方法之一。理想的提取方法可以获取高质量的靶核酸，同时没有蛋白、糖脂和其它核酸污染，目前已有很多专业化的核酸抽提方法可以从各种生物样品中抽提DNA或者总核酸。
目前核酸分离技术虽然发展迅速，但是均存在一些缺点，例如：酚氯仿抽提法虽然核酸纯度高，但是其主要成分对人体有害，且容易造成环境污染，同时提取过程需要反复抽提，多次换管，步骤繁琐，会造成样本的丢失与污染；碱裂解法：该法提取的核酸不容易保存；磁珠法因提取成本较高，从而限制了广泛应用。试剂盒法提取的核酸DNA浓度纯度低操作复杂。
另外由于临床血液样本量大，采集后通常无法及时进行DNA的提取，血浆中含有大量的核酸酶会对游离DNA造成严重降解，因此储存时间对游离DNA提取效率的影响很大。还有，现有的试剂盒法采用的释放剂与结合液都是不同的液体，在使用时增加了配制的工作量，也不利于精简操作流程。
因此，临床上急需一种既可以保存游离DNA又能简便快速高效提取游离DNA的试剂盒与方法，所提DNA纯度高、得率高，以保证即使在样本量有限的情况下下游试验的正常进行。
发明内容：
本发明的目的是提供一种既可以保存游离DNA又能简便快速高效提取游离DNA的试剂盒与方法，所提DNA纯度高、得率高，以保证即使在样本量有限的情况下，下游试验的正常进行。
本发明的既可以保存游离DNA又能简便快速高效提取游离DNA的核酸释放与结合剂，包括2.5M～3.5M GuSCN、30％～35％V/V的异丙醇、3％～5％V/V的Triton X100、45mM～55mM EDTA、15mM～25mM Tri-HCl、质量分数0.3％～0.6％DTT，溶剂为水。
优选，所述的核酸释放与结合剂包括3M GuSCN、33％V/V异丙醇、4％V/V TritonX100、50mM EDTA、20mM Tri-HCl、质量分数0.5％DTT，溶剂为水。
本发明的第二个目的是提供一种快速提取血浆、尿液游离DNA的试剂盒，其包括上述核酸释放与结合剂、洗涤液1和洗涤液2；
所述的洗涤液1包括：1.5M GuSCN、16.5％V/V的异丙醇、2％V/V Triton X100、25mM EDTA、10mM Tri-HCl，溶剂为水；
所述的洗涤液2包括：25％V/V乙醇、25％V/V的异丙醇、100mM氯化钠、10mM Tri-HCl，溶剂为水。
本发明的第三个目的是提供一种快速提取血浆、尿液游离DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将血浆、尿液或无细胞液体样品转移至离心管中，然后加入上述核酸释放与结合剂，涡旋混匀，再转移至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，再经洗涤和洗脱获得DNA。
所述的再经洗涤和洗脱获得DNA具体步骤为：加入洗涤液1至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，加入洗涤液2至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，再次加入洗涤液2至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，离心，取出纯化柱进行干燥，然后用无核酸酶水洗脱获得DNA；
所述的洗涤液1包括：1.5M GuSCN、16.5％V/V的异丙醇、2％V/V Triton X100、25mM EDTA、10mM Tri-HCl，溶剂为水；
所述的洗涤液2包括：25％V/V乙醇、25％V/V的异丙醇、100mM氯化钠、10mM Tri-HCl，溶剂为水。
优选，具体步骤如下：
步骤一.核酸释放与结合
(1)转移250uL血浆、尿液或无细胞液体样品至无DNase RNase的1.5mL离心管中；
(2)加入500uL核酸释放与结合剂至样品中，涡旋混匀20秒；
(3)转移步骤(2)的750uL混合液至纯化柱中，8,000×g离心60秒；
(4)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中；
步骤二.核酸纯化
(1)加入500uL洗涤液1至纯化柱中，8,000×g离心60秒；
(2)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，加入500uL洗涤液2至纯化柱中，8,000×g离心60秒；
(3)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，加入500uL洗涤液2至纯化柱中，8,000×g离心60秒；
(4)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，13,000×g离心3分钟；
(5)取出纯化柱，装在无DNase RNase的1.5mL离心管中，然后放置于56℃烘箱中干燥10分钟；
步骤三.洗脱核酸
(1)将纯化柱转移至新的无DNase RNase的1.5mL离心管中，加入10-20ulNuclease Free Water至纯化柱的膜中央，放置3分钟，13,000×g离心1分钟，收集滤液；
(2)丢弃DNA纯化柱，把DNA保存。
本发明提供了一种从血浆、尿液分离游离DNA的试剂盒，该试剂盒中包括一种三合一的工作液-核酸释放与结合剂，该核酸释放与结合剂同时具备保存、释放、结合三大功能，常温下即可保存样本，释放核酸，并对释放出的DNA进行结合，省时省力，大大提高了工作效率。市场上的其他试剂盒释放剂通常要与蛋白酶K共同作用，经过加热孵育一定的时间(最少30min)才能够较完全的释放核酸，这就增加了操作的复杂性，且消耗时间，而本发明的工作液无需添加蛋白酶K就可以将核酸完全释放，操作简便，30min内即可完成大批量临床标本的处理。临床上有的标本会存在游离核酸量较少的情况，本发明的工作液能够富集足够的游离核酸，250ul样本即可获得足够的DNA，且分离的DNA含量和纯度高。
本发明提供了一种从血浆、尿液分离游离DNA的方法，该方法操作过程简便快捷，250ul样本即可获得足够的DNA且分离的DNA含量和纯度高，重复性高，半小时内即可完成大批量样本的处理。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
实施例1：
一、试剂盒：
核酸释放与结合剂：含3M GuSCN、33％异丙醇(V/V)、4％Triton X100(V/V)、50mMEDTA、20mM Tri-HCl、质量分数0.5％DTT(二硫苏糖醇)，溶剂为水。配制方法：将各成分按其含量称量，然后将除异丙醇与Triton X100以外的成分混合均匀制得，进行灭菌，灭菌方式为121°104.3KPa灭菌15分钟,待其冷却后再加入异丙醇与Triton X100。
核酸纯化：
洗涤液1：含1.5M的GuSCN、16.5％的异丙醇(V/V)、2％的Triton X100(V/V)、25mM的EDTA、10mM的Tri-HCl，溶剂为水。配制方法：将各成分按其含量称量，然后将除异丙醇与Triton X100以外的成分混合均匀制得，进行灭菌，灭菌方式为121°104.3KPa灭菌15分钟,待其冷却后再加入异丙醇与Triton X100。
洗涤液2：含25％的乙醇(V/V)、25％的异丙醇(V/V)、100mM的氯化钠、10mM的Tri-HCl，溶剂为水。将各成分按其含量称量，然后将除异丙醇与乙醇以外的成分混合均匀制得，进行灭菌，灭菌方式为121°104.3KPa灭菌15分钟,待其冷却后再加入异丙醇与乙醇。
二、提取方法
步骤1.核酸释放与结合
(1)转移250uL血浆、尿液或无细胞液体样品至无DNase RNase的1.5mL离心管中。
(2)加入500uL核酸释放与结合剂至样品中，涡旋混匀20秒。
(3)转移750uL混合液(第2步获得的混合液)纯化柱中，8,000×g离心60秒。
(4)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。
步骤2.核酸纯化
(1)加入500uL洗涤液1至纯化柱中，8,000×g离心60秒。
(2)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，加入500uL洗涤液2至纯化柱中，8,000×g离心60秒。
(3)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中。重复步骤2，洗涤液2共洗脱2次。
(4)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中。13,000×g离心3分钟。
(5)取出柱子，装在无DNase RNase的1.5mL离心管中，然后放置于56℃烘箱中干燥10分钟。
步骤3.洗脱核酸
(1)将纯化柱转移至新的无DNase RNase的1.5mL离心管中。加入15ul NucleaseFree Water至纯化柱的膜中央。放置3分钟。13,000×g离心1分钟。
(2)丢弃DNA纯化柱，把DNA保存于-20℃或-80℃。
竞品试剂盒：HiPure Circulating DNA Micro Kit，成分如下：
提取步骤如下：
从500μl血浆或尿液样品中直接提取循环DNA。
a.转移50μl Proteinase K至2ml离心管中。
b.转移500μl液体样品至装有Proteinase K离心管中，颠倒混匀3次。
c.加入400μl Buffer ACL/Carrier RNA(1μg)至样品中，涡旋混匀20秒，60°水浴60分钟，其间偶尔颠倒数次混匀。
注:使用前，Carrier RNA与Buffer ACL可预先混匀，每个样品中Carrier RNA的用量为1μg(5μl)。
d.加入900μl Buffer ACB(已用异丙醇稀释)至样品中。涡旋混匀30秒。冰上放置5分钟。
注：Buffer ACB使用前，须按瓶子标签或说明书指示，加入等倍体积的异丙醇进行稀释，并室温保存。
e.把HiPure CFDNA Micro Column装在2ml收集管中。转移600μl混合液(第4步获得的混合液)至柱子中。8,000x g离心60秒。
f.倒弃滤液把柱子装回收集管中。继续转移剩余的混合液至柱子中。8,000x g离心60秒。重复此步直至把所有混合液转移至柱子中并离心。
注：柱子一次最多能装0.6ml溶液。处理0.5ml样品时，共需转移3次。
g.倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入500μl Buffer DCW1至柱子中。8,000x g离心60秒。
注：Buffer DCW1使用前，按瓶子标签所示，加入适量的无水乙醇进行稀释，于室温保存。
h.倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入500μl Buffer DCW2至柱子中。8,000x g离心60秒。
注：Buffer DCW2使用前，按瓶子标签所示，加入适量的无水乙醇进行稀释，于室温保存。
i.倒弃滤液和收集管，把柱子装回新的收集管中。加入500μl无水乙醇至柱子中。8,000x g离心60秒。
j.倒弃滤液，把柱子装回收集管中。13,000x g离心3分钟。
k.取出柱子，装在1.5ml离心管中，然后放置于56°烘箱中干燥10分钟。
l.将柱子转移至新的1.5ml离心管中。加入10-20μl Nuclease Free Water或Buffer TE至柱子的膜中央。放置3分钟。13,000×g离心1分钟。
注:这一步推荐使用Buffer TE来洗脱DNA。使用Buffer TE洗脱，有利于DNA的保存。由于Buffer TE在230nm有吸光度，使用Buffer TE洗脱时，得到出OD260/OD230会有较大的偏大，但不会影响下游应用。
m.丢弃DNA结合柱，把DNA保存于-20℃或-80℃。
3.所提DNA浓度及OD值检测
采用Nandrop one对本发明试剂盒及竞品试剂盒提取的DNA进行浓度及OD检测表
从结果来看，相同体积量的标本，无论是血浆标本还是尿液标本用本发明的试剂盒，按照本发明的方法获得的核酸浓度都远远高于竞品试剂盒，且纯度也优于竞品试剂盒。
整个提取实验所用时间对比(本发明试剂盒VS竞品试剂盒)
从结果来看，完成整个提取实验，本发明方法所用时间是竞品试剂盒所用时间的1/3，大大节省了操作时间成本。
实施例2：
本实施例与实施例1相同，只是核酸释放与结合剂包括以下组分：2.5M的GuSCN、30％的异丙醇(V/V)、3％的Triton X100(V/V)、45mM的EDTA、15mM的Tri-HCl、0.3％的DTT(质量百分比)。
实施例3：
本实施例与实施例1相同，只是核酸释放与结合剂包括以下组分：3.5M的GuSCN、35％的异丙醇(V/V)、5％的Triton X100(V/V)、55mM的EDTA、25mM的Tri-HCl、0.6％的DTT(质量百分比)。
Claims (6)
1.一种核酸释放与结合剂，其特征在于，包括2.5M～3.5M GuSCN、30％～35％V/V的异丙醇、3％～5％V/V的Triton X100、45mM～55mM EDTA、15mM～25mM Tri-HCl、质量分数0.3％～0.6％DTT，溶剂为水。
2.根据权利要求1所述的核酸释放与结合剂，其特征在于，所述的核酸释放与结合剂包括3M GuSCN、33％V/V异丙醇、4％V/V Triton X100、50mM EDTA、20mM Tri-HCl、质量分数0.5％DTT，溶剂为水。
3.一种快速提取血浆、尿液游离DNA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的核酸释放与结合剂、洗涤液1和洗涤液2；
所述的洗涤液1包括：1.5M GuSCN、16.5％V/V的异丙醇、2％V/V Triton X100、25mMEDTA、10mM Tri-HCl，溶剂为水；
所述的洗涤液2包括：25％V/V乙醇、25％V/V的异丙醇、100mM氯化钠、10mM Tri-HCl，溶剂为水。
4.一种快速提取血浆、尿液游离DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将血浆、尿液或无细胞液体样品转移至离心管中，然后加入权利要求1或2所述的核酸释放与结合剂，涡旋混匀，再转移至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，再经洗涤和洗脱获得DNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的再经洗涤和洗脱获得DNA具体步骤为：加入洗涤液1至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，加入洗涤液2至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，再次加入洗涤液2至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，离心，取出纯化柱进行干燥，然后用无核酸酶水洗脱获得DNA；
所述的洗涤液1包括：1.5M GuSCN、16.5％V/V的异丙醇、2％V/V Triton X100、25mMEDTA、10mM Tri-HCl，溶剂为水；
所述的洗涤液2包括：25％V/V乙醇、25％V/V的异丙醇、100mM氯化钠、10mM Tri-HCl，溶剂为水。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤一.核酸释放与结合
(1)转移250uL血浆、尿液或无细胞液体样品至无DNase RNase的1.5mL离心管中；
(2)加入500uL核酸释放与结合剂至样品中，涡旋混匀20秒；
(3)转移步骤(2)的750uL混合液至纯化柱中，8,000×g离心60秒；
(4)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中；
步骤二.核酸纯化
(1)加入500uL洗涤液1至纯化柱中，8,000×g离心60秒；
(2)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，加入500uL洗涤液2至纯化柱中，8,000×g离心60秒；
(3)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，加入500uL洗涤液2至纯化柱中，8,000×g离心60秒；
(4)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，13,000×g离心3分钟；
(5)取出纯化柱，装在无DNase RNase的1.5mL离心管中，然后放置于56℃烘箱中干燥10分钟；
步骤三.洗脱核酸
(1)将纯化柱转移至新的无DNase RNase的1.5mL离心管中，加入10-20ul NucleaseFree Water至纯化柱的膜中央，放置3分钟，13,000×g离心1分钟，收集滤液；
(2)丢弃DNA纯化柱，把DNA保存。
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