CN109207476A - 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种尿液游离DNA提取试剂盒，包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠，裂解液包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris‑HCl和氯化钠，洗涤液A包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris‑HCl,乙醇的体积浓度为30％～40％，洗涤液B包括金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris‑HCl，乙醇的体积浓度为75％～85％。本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行尿液游离DNA提取的方法。本发明提供的试剂盒对于尿液中游离DNA的提取效率高，且选择性提取100bp以上的核酸片段。

Description

一种尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，具体涉及一种尿液中游离DNA提取试剂盒提取试剂盒及提取方法。
背景技术
基于尿液中游离DNA的液体活检正在被广泛研究，与血浆液体活检相比，尿液样本优势明显。首先，采样方便，不需要去专门的机构，在家即可完成，其次，是真正意义上的无创，不需要任何侵入采样；最后，样本量大，正常人晨尿一般在150mL以上。但是，相对而言，尿液样本会比较复杂，核酸酶含量更高，代谢物质更多，pH范围波动较大。正常人的尿液中游离DNA的来源主要是膀胱和尿道脱落的上皮细胞以及尿液中的少量白细胞破裂后被尿液中核酸酶降解而来，而对有疾病的人，其尿液中游离DNA的来源除上述外，还会有病灶部位凋亡和坏死的细胞进入尿液。
在2015年，BryzgunovaOE的综述文献报道，24小时内大约有3×106个膀胱和尿道上皮细胞进入尿液，且尿液中核酸酶的活性高，核酸酶I(DNase I)在尿液中的活性是血浆中的100倍以上，血浆中的游离DNA也能通过肾脏过滤进入尿液，在多种类型的尿液样本中均有游离DNA的相关报道，在怀有男胎的孕妇尿液样本中检测到Y染色体的存在；胰腺癌和结直肠癌患者的尿液中发现KRAS基因突变；肺结核患者的尿液中检出结核杆菌的DNA；妇科和泌尿道疾病或HIV患者的尿液中含有HPV的DNA；恶性肾和***的基因突变和微卫星不稳定可在尿液样本游离DNA中检测到；***以及***的异常DNA甲基化可在泌尿生殖癌患者尿液游离DNA中检出。故，尿液的游离DNA作为一种生物标记物，其研究和应用越来越广泛。
磁珠法尿液核酸提取一般分为四步：裂解-结合-洗涤-洗脱，与传统核酸提取方法相比，磁珠法DNA提取具有以下优势：1)能够实现仪器自动化、高批量操作，目前已有96孔的核酸自动提取仪，用一个样品的提取时间即可实现对96个样品的处理，这一特点明显优于其他提取方法；2)操作简单、用时短，整个提取流程只需四部，大多可以在60分钟内完成；3)安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害大大降低；4)磁珠与核算的特异性结合使得提取的核酸的纯度和浓度都得到提升。
尿液的液体活检技术是以尿液中的游离DNA作为检测目标，在检测过程中游离DNA的含量是一个重要的指标，目前商业化的尿液游离DNA提取试剂盒较少，基于尿液游离DNA的研究，其提取多采用血浆游离DNA提取试剂盒，而血浆的游离DNA片段比较稳定，主峰大小为166bp，尿液的液体环境与血浆的液体环境不同，尿液中游离DNA的片段波动较大，从50bp到1kb，甚至膀胱癌患者的尿液游离DNA最大片段可以高达10kb，目前市面上并没有太多针对尿液中游离DNA的磁珠法提取试剂盒。
发明内容
本发明克服现有技术在尿液中游离DNA提取过程中，纯化效率低，纯度差、提取的核酸片段长度范围较窄的缺陷，提供了一种简单、方便、效率更高的尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种尿液游离DNA提取试剂盒，包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠，所述裂解液包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris-HCl和氯化钠，所述洗涤液A包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl，所述乙醇的体积浓度为30％～40％，所述洗涤液B包括金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl，所述乙醇的体积浓度为75％～85％。
本发明的有益效果是：本发明提供的尿液游离DNA提取试剂盒，各组分之间配合使用，通过磁珠法能有效提取尿液中游离DNA，且提取效率高，且能选择性提取的100bp以上的核酸片段。
进一步，所述胍盐选自盐酸胍和异硫氰酸胍中的一种或两种，所述金属螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾中的一种或多种；所述表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、NP-40、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠中的一种或多种，所述醇类为乙醇和异丙醇中的任一种或两种。其中所述裂解液、所述洗涤液A和所述洗涤液B中的所述金属螯合剂、所述表面活性剂可以选自上述中的任一种或多种，且所述裂解液、所述洗涤液A和所述洗涤液B中选用的金属螯合剂一致，所述裂解液、所述洗涤液A和所述洗涤液B中选用的表面活性剂一致。
进一步，所述胍盐为异硫氰酸胍，所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸，所述表面活性剂为Triton X-100，所述醇类为异丙醇。
进一步，所述裂解液中胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris-HCl和氯化钠的工作浓度分别为3～5M、20～30mM、4％～6％(v/v)、30％～50％(v/v)、40～60mM和90～110mM，所述裂解液的pH值为7.0～8.0；所述洗涤液A中胍盐、金属螯合剂、表面活性剂和Tris-HCl的工作浓度分别为2.5～3.5M、0.5～1.5mM、0.8％～1.2％(v/v)和8～12mM，所述洗涤液A的pH值为7.0～8.0；所述洗涤液B中金属螯合剂、表面活性剂和Tris-HCl的工作浓度分别为0.5～1.5mM、0.08％～0.12％(v/v)和8～12mM，所述洗涤液B的pH值为。
进一步，所述洗脱液中含有0.4～0.6mM的EDTA和8～12mM的Tris-HCl，所述洗脱液的pH为7.5～8.5。
进一步，所述羟基磁珠为表面修饰有硅羟基的超顺磁性纳米微球，所述羟基磁珠以磁珠混悬液的形式存在，所述羟基磁珠的浓度为40～60mg/mL。
本发明还提供了一种尿液游离DNA的提取方法，采用上述的试剂盒进行提取，包括以下步骤：
(a)将尿液样品进行预处理，然后加入裂解液和羟基磁珠，上下颠倒混匀，孵育；
(b)磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时去除液体；
(c)加入洗涤液A，悬浮，磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时去除液体；
(d)加入洗涤液B，悬浮，磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时去除液体；
(e)重复步骤(d)，并去除残留的乙醇；
(f)加入洗脱液，重新悬浮，孵育，期间晃动使核酸充分洗脱；
(g)磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时将核酸溶液转移，得到游离DNA提取液。
进一步，所述步骤(a)中加入蛋白酶K。
进一步，步骤(a)中，所述裂解液的添加体积为预处理后尿液样品体积的1～2倍，以每mL预处理后的尿液样品计，蛋白酶K的添加量为1～3mg，羟基磁珠的添加量为0.15～1mg，孵育时间为30min，孵育时，上下颠倒混匀；步骤(c)中，所述洗涤液A的添加体积为预处理后尿液样品体积的0.3～0.5倍；步骤(d)中所述洗涤液B的添加体积为预处理后尿液样品体积的0.3～0.5倍；所述步骤(c)和步骤(d)中的悬浮为：涡旋使羟基磁珠充分悬浮；所述步骤(c)和步骤(d)中的去除液体为：吸弃液体，并离心去除容器内壁的液滴；步骤(f)中，所述洗脱液的添加体积为预处理后尿液样品体积的2％-5％，所述孵育的温度为55℃～58℃，孵育时间为5～10min。
本发明的有益效果为：得到的尿液游离DNA的纯度高，且能够选择性提取尿液中100bp以上的核酸片段，提取效果好。
附图说明
图1为本发明用Labchip GX对提取的尿液游离DNA、回收的PCR产物和Marker进行的电泳分析图；
图2为本发明提取的尿液游离DNA的电泳图；
图3为本发明实施例6中加入的PCR产物的原始电泳图；
图4为本发明实施例6中回收的PCR产物片段分布电泳图；
图5为本发明实施例6中加入的DNA Marker的原始电泳图；
图6为本发明实施例6中回收的DNA Marker的片段分布电泳图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种尿液游离DNA提取试剂盒，包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠，分别制备裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠和蛋白酶K：
裂解液制备：在烧杯中加入500mL超纯水，分别称取472.64g异硫氰酸胍，7.306g乙二胺四乙酸(EDTA)，6.057g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，5.844g氯化钠加入烧杯中，搅拌，然后分别量取50mL Triton X-100,333.3mL异丙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用HCl调节pH至7.5，加入超纯水定容至1L。
洗涤液A的制备：在烧杯中加入450mL超纯水，分别称取354.48g异硫氰酸胍，0.292g乙二胺四乙酸(EDTA),1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris)加入烧杯中，搅拌，然后分别量取10mL Triton X-100，400mL乙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用盐酸调节pH至7.0，加入超纯水定容至1L。
洗涤液B的制备：在烧杯中加入50mL超纯水，分别称取0.292g乙二胺四乙酸(EDTA)，1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入烧杯中，搅拌，然后分别量取1mL Triton X-100，800mL乙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用盐酸调节pH至7.0，加入超纯水定容至1L。
洗脱液的制备：在烧杯中加入900mL超纯水，分别称取0.146g乙二胺四乙酸(EDTA)和1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入烧杯中，搅拌，然后用盐酸调节pH至8，加入超纯水定容至1L。
羟基磁珠以混悬液的形式存在，制备方法为：称取5g羟基磁珠，溶于100mL体积分数为20％的乙醇水溶液中，上述羟基磁珠购自北京百迈格。
蛋白酶K以蛋白酶K溶液的形式存在，制备方法为：称取2g蛋白酶K粉加入蛋白酶K缓冲液(市售或者现有技术可以获得)定容至100mL，制成浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液。
实施例2
一种尿液游离DNA提取试剂盒，包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠，分别制备裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠和蛋白酶K：
裂解液制备：在烧杯中加入300mL超纯水，分别称取354.48g异硫氰酸胍，8.767g乙二胺四乙酸(EDTA)，4.846g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，5.26g氯化钠加入烧杯中，搅拌，然后分别量取60mL Triton X-100,500mL异丙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用HCl调节pH至8.0，加入超纯水定容至1L。
洗涤液A的制备：在烧杯中加入600mL超纯水，分别称取295.4g异硫氰酸胍，0.146g乙二胺四乙酸(EDTA),0.969g三羟甲基氨基甲烷(Tris)加入烧杯中，搅拌，然后分别量取8mL Triton X-100，300mL乙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用盐酸调节pH至8.0，加入超纯水定容至1L。
洗涤液B的制备：在烧杯中加入150mL超纯水，分别称取0.146g乙二胺四乙酸(EDTA)，0.969g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入烧杯中，搅拌，然后分别量取0.8mL TritonX-100，750mL乙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用盐酸调节pH至8.0，加入超纯水定容至1L。
洗脱液的制备：在烧杯中加入900mL超纯水，分别称取0.146g乙二胺四乙酸(EDTA)和1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入烧杯中，搅拌，然后用盐酸调节pH至8，加入超纯水定容至1L。
羟基磁珠以混悬液的形式存在，制备方法为：称取5g羟基磁珠，溶于100mL体积分数为20％的乙醇水溶液中。
蛋白酶K以蛋白酶K溶液的形式存在，制备方法为：称取2g蛋白酶K粉加入蛋白酶K缓冲液(市售或者现有技术可以获得)定容至100mL，制成浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液。
实施例3
一种尿液游离DNA提取试剂盒，包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠，分别制备裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠和蛋白酶K：
裂解液制备：在烧杯中加入500mL超纯水，分别称取590.8g异硫氰酸胍，5.845g乙二胺四乙酸(EDTA)，7.268g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，6.428g氯化钠加入烧杯中，搅拌，然后分别量取40mL Triton X-100,300mL异丙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用HCl调节pH至7.0，加入超纯水定容至1L。
洗涤液A的制备：在烧杯中加入550mL超纯水，分别称取423.56g异硫氰酸胍，0.438g乙二胺四乙酸(EDTA),1.454g三羟甲基氨基甲烷(Tris)加入烧杯中，搅拌，然后分别量取12mL Triton X-100，350mL乙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用盐酸调节pH至7.5，加入超纯水定容至1L。
洗涤液B的制备：在烧杯中加入50mL超纯水，分别称取0.438g乙二胺四乙酸(EDTA)，1.454g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入烧杯中，搅拌，然后分别量取1.2mL TritonX-100，850mL乙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用盐酸调节pH至7.5，加入超纯水定容至1L。
洗脱液的制备：在烧杯中加入900mL超纯水，分别称取0.146g乙二胺四乙酸(EDTA)和1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入烧杯中，搅拌，然后用盐酸调节pH至8，加入超纯水定容至1L。
羟基磁珠以混悬液的形式存在，制备方法为：称取5g羟基磁珠，溶于100mL体积分数为20％的乙醇水溶液中。
蛋白酶K以蛋白酶K溶液的形式存在，制备方法为：称取2g蛋白酶K粉加入蛋白酶K缓冲液(市售或者现有技术可以获得)定容至100mL，制成浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液。
实施例4
一种尿液游离DNA提取试剂盒，包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠，分别制备裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠和蛋白酶K：
裂解液制备：在烧杯中加入500mL超纯水，分别称取382.12g盐酸胍，7.306g乙二胺四乙酸(EDTA)，6.057g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，5.844g氯化钠加入烧杯中，搅拌，然后分别量取500mL Tween-20,333.3mL乙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用HCl调节pH至7.5，加入超纯水定容至1L。
洗涤液A的制备：在烧杯中加入450mL超纯水，分别称取354.48g盐酸胍，0.292g乙二胺四乙酸(EDTA),1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris)加入烧杯中，搅拌，然后分别量取10mLTween-20，400mL乙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用盐酸调节pH至7.5，加入超纯水定容至1L。
洗涤液B的制备：在烧杯中加入50mL超纯水，分别称取0.292g乙二胺四乙酸(EDTA)，1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入烧杯中，搅拌，然后分别量取1mL Tween-20，800mL乙醇，加入烧杯中，搅拌均匀，用盐酸调节pH至7.5，加入超纯水定容至1L。
洗脱液的制备同实施例1。
羟基磁珠以混悬液的形式存在，制备方法同实施例1。
蛋白酶K以蛋白酶K溶液的形式存在，制备方法同实施例1。
实施例5
利用上述制备的试剂盒进行尿液游离DNA的提取，提取过程为：
(a)取3mL尿液样品进行预处理，预处理过程为：将尿液样品经4℃,1600g离心10min去除沉淀，转移第一步离心后的上清至新的离心管，然后4℃,12000g离心10min，得到的上清即为预处理后的尿液样品。在15mL或5ml无核酸酶BD管中加入2mL裂解液、100uL蛋白酶K(20mg/ml)、30uL羟基磁珠(使用前颠倒或使用移液器吹吸混匀)、2mL预处理后的尿液样品，颠倒混匀，室温，上下颠倒(垂直混匀仪)混匀30分钟，使磁珠和核酸充分结合。
(b)将BD管取下，短暂离心，磁珠沉于管底，去掉大部分上清，然后用移液器吸出磁珠和上清，转至2mL离心管中，置于磁力架上1min，吸弃上清。
(c)加入600uL洗涤液A，涡旋使磁珠重新悬浮，置于磁力架上1分钟，吸弃液体，取下离心管，瞬时离心，去残。
(d)加入600uL洗涤液B，使磁珠重新悬浮，置于磁力架上1分钟，吸弃液体，取下离心管。
(e)重复洗涤液B洗涤过程，取下离心管，瞬时离心，去残，并室温条件下挥发，直至乙醇挥尽。
(f)加入45uL洗脱液，使磁珠重新悬浮，55℃加热洗脱10分钟，期间可轻轻混匀磁珠使磁珠保持悬浮状态。
(g)离心管瞬时离心，收集管盖管壁液体，将离心管置于磁力架1分钟，将液体转移至新的1.5mL无核酸酶离心管中。
实施例6
取30mL尿液按照实施例5的方法进行预处理，分别取3组预处理后的尿液，每组2mL，其中第一组不添加任何物质，为尿液组，第二组中加入1154ng PCR产物(PCR片段长度为301bp)，为尿液+PCR产物组，第三组中加入528ng DNA Marker(片段长度分别为50bp,100bp，150bp，200bp，300bp，400bp，500bp，700bp，800bp，1000bp)，为尿液+Marker组，然后用实施例5中的方法进行尿液中DNA提取，每组做三个平行，对尿液组中提取的尿液中的游离DNA做初步定量，取平均值，然后分别计算PCR产物和Marker的回收率并取平均值，以尿液中游离DNA为本底量，在计算PCR产物和Marker的回收率时，需要减去本底量。具体的回收率结果如下表1所示，本发明的试剂盒对PCR产物的回收效率为95.73％，对DNA marker的回收效率为83.94％。
表1回收效率
用普通市售尿液游离DNA提取试剂盒做对照，其尿液组提取的游离DNA的总量为150ng，PCR产物和DNA marker的回收效率分别为89.28％和80.14％。
对于上述第一组尿液组提取的尿液中游离DNA用实时荧光定量PCR进行分析，以管家基因ACTB即β-actin基因进行衡量，试剂盒使用天根的SuperReal PreMix Plus(SYBRGreen)kits，实时荧光定量PCR仪采用ABI7500，反应体系如下表2所示，其中β-actin基因的上下游引物分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列分别为：
SEQ ID NO:1(ACTB-41-F:AATCTGGCACCACACCTTC)
SEQ ID NO:2(ACTB-41-R:GAGCCACACGCAGCTCATT)
表2
2×SuperReal PreMixPlus 10μL
ACTB-41-F(10μM) 0.6μL
ACTB-41-R(10μM) 0.6μL
游离DNA提取液 2μL
50×ROX Reference Dye 0.4μL
RNase-free ddH2O 6.4μL
实验做三组平行，测得用本发明的试剂盒提取的尿液中游离DNA的CT值的平均值为19.52，用普通市售试剂盒提取的尿液中游离DNA的CT值为22.57，证明用本发明试剂盒提取得到的尿液中的有效游离DNA的含量高于普通市售试剂盒，本发明试剂盒的提取效率高于普通市售尿液游离DNA提取试剂盒。
本发明的试剂盒对不同片段的回收效率分析：
1、使用Labchip GX对提取的尿液游离DNA、回收的PCR产物和Marker进行电泳分析，结果如图1所示。
2、用本发明的试剂盒及提取方法提取的尿液游离DNA用Labchip GX生物大分子分析仪进行检测，电泳图如图2所示，检测片段范围在25bp-1500bp之间。
3、加入的PCR产物的原始峰图如图3所示，用本发明的试剂盒回收的PCR产物片段分布如图4所示。
4、加入的DNA marker的原始峰图如图5所示，用本发明的试剂盒回收的DNAMarker片段分布如图6所示，本发明的试剂盒对DNA marker的回收效率低于PCR产物的回收效率主要是由于对100bp以下的DNA片对的缺失导致整体DNA回收效率低。
以上分析结果证明本发明的试剂盒对尿液中游离DNA的回收具有良好的效果，尤其是对于100bp及以上的片段具有良好的回收效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 王煜
<120> 一种尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatctggcac cacaccttc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagccacacg cagctcatt 19

Claims (10)

1.一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠；
所述裂解液包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris-HCl和氯化钠；
所述洗涤液A包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl，所述乙醇的体积浓度为30％～40％；
所述洗涤液B包括金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl，所述乙醇的体积浓度为75％～85％。
2.根据权利要求1所述的一种尿中游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述胍盐选自盐酸胍和异硫氰酸胍中的一种或两种，所述金属螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾中的一种或多种；所述表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、NP-40、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠中的一种或多种，所述醇类为乙醇和异丙醇中的任一种或两种。
3.根据权利要求2所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述胍盐为异硫氰酸胍，所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸，所述表面活性剂为Triton X-100，所述醇类为异丙醇。
4.根据权利要求1所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液中胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris-HCl和氯化钠的工作浓度分别为3～5M、20～30mM、4％～6％(v/v)、30％～50％(v/v)、40～60mM和90～110mM，所述裂解液的pH值为7.0～8.0；所述洗涤液A中胍盐、金属螯合剂、表面活性剂和Tris-HCl的工作浓度分别为2.5～3.5M、0.5～1.5mM、0.8％～1.2％(v/v)和8～12mM，所述洗涤液A的pH值为7.0～8.0；所述洗涤液B中金属螯合剂、表面活性剂和Tris-HCl的工作浓度分别为0.5～1.5mM、0.08％～0.12％(v/v)和8～12mM，所述洗涤液B的pH值为7.0～8.0。
5.根据权利要求1所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液中含有0.4～0.6mM的EDTA和8～12mM的Tris-HCl，所述洗脱液的pH为7.5～8.5。
6.根据权利要求1所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述羟基磁珠为表面修饰有硅羟基的超顺磁性纳米微球，所述羟基磁珠以磁珠混悬液的形式存在，所述羟基磁珠的浓度为40～60mg/mL。
7.根据权利要求1-6任一项所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括蛋白酶K。
8.一种尿液游离DNA的提取方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的试剂盒进行提取，包括以下步骤：
(a)将尿液样品进行预处理，然后加入裂解液和羟基磁珠，上下颠倒混匀，孵育；
(b)磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时去除液体；
(c)加入洗涤液A，悬浮，磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时去除液体；
(d)加入洗涤液B，悬浮，磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时去除液体；
(e)重复步骤(d)，并去除残留的乙醇；
(f)加入洗脱液，重新悬浮，孵育，期间晃动使核酸充分洗脱；
(g)磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时将核酸溶液转移，得到游离DNA提取液。
9.根据权利要求8所述的尿液游离DNA的提取方法，其特征在于，步骤(a)中加入蛋白酶K。
10.根据权利要求9所述尿液游离DNA的提取方法，其特征在于，步骤(a)中，所述裂解液的添加体积为预处理后尿液样品体积的1～2倍，以每mL预处理后的尿液样品计，蛋白酶K的添加量为1～3mg，羟基磁珠的添加量为0.15～1mg，孵育时间为30min，孵育时，上下颠倒混匀；步骤(c)中，所述洗涤液A的添加体积为预处理后尿液样品体积的0.3～0.5倍；步骤(d)中所述洗涤液B的添加体积为预处理后尿液样品体积的0.3～0.5倍；所述步骤(c)和步骤(d)中的悬浮为：涡旋使羟基磁珠充分悬浮；所述步骤(c)和步骤(d)中的去除液体为：吸弃液体，并离心去除容器内壁的液滴；步骤(f)中，所述洗脱液的添加体积为预处理后尿液样品体积的2％-5％，所述孵育的温度为55℃～58℃，孵育时间为5～10min。
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