CN109207476A - 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 - Google Patents
一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109207476A CN109207476A CN201811259276.6A CN201811259276A CN109207476A CN 109207476 A CN109207476 A CN 109207476A CN 201811259276 A CN201811259276 A CN 201811259276A CN 109207476 A CN109207476 A CN 109207476A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- urine
- cleaning solution
- magnetic bead
- dissociative dna
- added
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种尿液游离DNA提取试剂盒,包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠,裂解液包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris‑HCl和氯化钠,洗涤液A包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris‑HCl,乙醇的体积浓度为30%~40%,洗涤液B包括金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris‑HCl,乙醇的体积浓度为75%~85%。本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行尿液游离DNA提取的方法。本发明提供的试剂盒对于尿液中游离DNA的提取效率高,且选择性提取100bp以上的核酸片段。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取领域,具体涉及一种尿液中游离DNA提取试剂盒提取试剂盒及提取方法。
背景技术
基于尿液中游离DNA的液体活检正在被广泛研究,与血浆液体活检相比,尿液样本优势明显。首先,采样方便,不需要去专门的机构,在家即可完成,其次,是真正意义上的无创,不需要任何侵入采样;最后,样本量大,正常人晨尿一般在150mL以上。但是,相对而言,尿液样本会比较复杂,核酸酶含量更高,代谢物质更多,pH范围波动较大。正常人的尿液中游离DNA的来源主要是膀胱和尿道脱落的上皮细胞以及尿液中的少量白细胞破裂后被尿液中核酸酶降解而来,而对有疾病的人,其尿液中游离DNA的来源除上述外,还会有病灶部位凋亡和坏死的细胞进入尿液。
在2015年,BryzgunovaOE的综述文献报道,24小时内大约有3×106个膀胱和尿道上皮细胞进入尿液,且尿液中核酸酶的活性高,核酸酶I(DNase I)在尿液中的活性是血浆中的100倍以上,血浆中的游离DNA也能通过肾脏过滤进入尿液,在多种类型的尿液样本中均有游离DNA的相关报道,在怀有男胎的孕妇尿液样本中检测到Y染色体的存在;胰腺癌和结直肠癌患者的尿液中发现KRAS基因突变;肺结核患者的尿液中检出结核杆菌的DNA;妇科和泌尿道疾病或HIV患者的尿液中含有HPV的DNA;恶性肾和***的基因突变和微卫星不稳定可在尿液样本游离DNA中检测到;***以及***的异常DNA甲基化可在泌尿生殖癌患者尿液游离DNA中检出。故,尿液的游离DNA作为一种生物标记物,其研究和应用越来越广泛。
磁珠法尿液核酸提取一般分为四步:裂解-结合-洗涤-洗脱,与传统核酸提取方法相比,磁珠法DNA提取具有以下优势:1)能够实现仪器自动化、高批量操作,目前已有96孔的核酸自动提取仪,用一个样品的提取时间即可实现对96个样品的处理,这一特点明显优于其他提取方法;2)操作简单、用时短,整个提取流程只需四部,大多可以在60分钟内完成;3)安全无毒,不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂,对实验操作人员的伤害大大降低;4)磁珠与核算的特异性结合使得提取的核酸的纯度和浓度都得到提升。
尿液的液体活检技术是以尿液中的游离DNA作为检测目标,在检测过程中游离DNA的含量是一个重要的指标,目前商业化的尿液游离DNA提取试剂盒较少,基于尿液游离DNA的研究,其提取多采用血浆游离DNA提取试剂盒,而血浆的游离DNA片段比较稳定,主峰大小为166bp,尿液的液体环境与血浆的液体环境不同,尿液中游离DNA的片段波动较大,从50bp到1kb,甚至膀胱癌患者的尿液游离DNA最大片段可以高达10kb,目前市面上并没有太多针对尿液中游离DNA的磁珠法提取试剂盒。
发明内容
本发明克服现有技术在尿液中游离DNA提取过程中,纯化效率低,纯度差、提取的核酸片段长度范围较窄的缺陷,提供了一种简单、方便、效率更高的尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种尿液游离DNA提取试剂盒,包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠,所述裂解液包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris-HCl和氯化钠,所述洗涤液A包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl,所述乙醇的体积浓度为30%~40%,所述洗涤液B包括金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl,所述乙醇的体积浓度为75%~85%。
本发明的有益效果是:本发明提供的尿液游离DNA提取试剂盒,各组分之间配合使用,通过磁珠法能有效提取尿液中游离DNA,且提取效率高,且能选择性提取的100bp以上的核酸片段。
进一步,所述胍盐选自盐酸胍和异硫氰酸胍中的一种或两种,所述金属螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾中的一种或多种;所述表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、NP-40、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠中的一种或多种,所述醇类为乙醇和异丙醇中的任一种或两种。其中所述裂解液、所述洗涤液A和所述洗涤液B中的所述金属螯合剂、所述表面活性剂可以选自上述中的任一种或多种,且所述裂解液、所述洗涤液A和所述洗涤液B中选用的金属螯合剂一致,所述裂解液、所述洗涤液A和所述洗涤液B中选用的表面活性剂一致。
进一步,所述胍盐为异硫氰酸胍,所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸,所述表面活性剂为Triton X-100,所述醇类为异丙醇。
进一步,所述裂解液中胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris-HCl和氯化钠的工作浓度分别为3~5M、20~30mM、4%~6%(v/v)、30%~50%(v/v)、40~60mM和90~110mM,所述裂解液的pH值为7.0~8.0;所述洗涤液A中胍盐、金属螯合剂、表面活性剂和Tris-HCl的工作浓度分别为2.5~3.5M、0.5~1.5mM、0.8%~1.2%(v/v)和8~12mM,所述洗涤液A的pH值为7.0~8.0;所述洗涤液B中金属螯合剂、表面活性剂和Tris-HCl的工作浓度分别为0.5~1.5mM、0.08%~0.12%(v/v)和8~12mM,所述洗涤液B的pH值为。
进一步,所述洗脱液中含有0.4~0.6mM的EDTA和8~12mM的Tris-HCl,所述洗脱液的pH为7.5~8.5。
进一步,所述羟基磁珠为表面修饰有硅羟基的超顺磁性纳米微球,所述羟基磁珠以磁珠混悬液的形式存在,所述羟基磁珠的浓度为40~60mg/mL。
本发明还提供了一种尿液游离DNA的提取方法,采用上述的试剂盒进行提取,包括以下步骤:
(a)将尿液样品进行预处理,然后加入裂解液和羟基磁珠,上下颠倒混匀,孵育;
(b)磁力吸附,待羟基磁珠完全吸附时去除液体;
(c)加入洗涤液A,悬浮,磁力吸附,待羟基磁珠完全吸附时去除液体;
(d)加入洗涤液B,悬浮,磁力吸附,待羟基磁珠完全吸附时去除液体;
(e)重复步骤(d),并去除残留的乙醇;
(f)加入洗脱液,重新悬浮,孵育,期间晃动使核酸充分洗脱;
(g)磁力吸附,待羟基磁珠完全吸附时将核酸溶液转移,得到游离DNA提取液。
进一步,所述步骤(a)中加入蛋白酶K。
进一步,步骤(a)中,所述裂解液的添加体积为预处理后尿液样品体积的1~2倍,以每mL预处理后的尿液样品计,蛋白酶K的添加量为1~3mg,羟基磁珠的添加量为0.15~1mg,孵育时间为30min,孵育时,上下颠倒混匀;步骤(c)中,所述洗涤液A的添加体积为预处理后尿液样品体积的0.3~0.5倍;步骤(d)中所述洗涤液B的添加体积为预处理后尿液样品体积的0.3~0.5倍;所述步骤(c)和步骤(d)中的悬浮为:涡旋使羟基磁珠充分悬浮;所述步骤(c)和步骤(d)中的去除液体为:吸弃液体,并离心去除容器内壁的液滴;步骤(f)中,所述洗脱液的添加体积为预处理后尿液样品体积的2%-5%,所述孵育的温度为55℃~58℃,孵育时间为5~10min。
本发明的有益效果为:得到的尿液游离DNA的纯度高,且能够选择性提取尿液中100bp以上的核酸片段,提取效果好。
附图说明
图1为本发明用Labchip GX对提取的尿液游离DNA、回收的PCR产物和Marker进行的电泳分析图;
图2为本发明提取的尿液游离DNA的电泳图;
图3为本发明实施例6中加入的PCR产物的原始电泳图;
图4为本发明实施例6中回收的PCR产物片段分布电泳图;
图5为本发明实施例6中加入的DNA Marker的原始电泳图;
图6为本发明实施例6中回收的DNA Marker的片段分布电泳图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种尿液游离DNA提取试剂盒,包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠,分别制备裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠和蛋白酶K:
裂解液制备:在烧杯中加入500mL超纯水,分别称取472.64g异硫氰酸胍,7.306g乙二胺四乙酸(EDTA),6.057g三羟甲基氨基甲烷(Tris),5.844g氯化钠加入烧杯中,搅拌,然后分别量取50mL Triton X-100,333.3mL异丙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用HCl调节pH至7.5,加入超纯水定容至1L。
洗涤液A的制备:在烧杯中加入450mL超纯水,分别称取354.48g异硫氰酸胍,0.292g乙二胺四乙酸(EDTA),1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris)加入烧杯中,搅拌,然后分别量取10mL Triton X-100,400mL乙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用盐酸调节pH至7.0,加入超纯水定容至1L。
洗涤液B的制备:在烧杯中加入50mL超纯水,分别称取0.292g乙二胺四乙酸(EDTA),1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加入烧杯中,搅拌,然后分别量取1mL Triton X-100,800mL乙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用盐酸调节pH至7.0,加入超纯水定容至1L。
洗脱液的制备:在烧杯中加入900mL超纯水,分别称取0.146g乙二胺四乙酸(EDTA)和1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加入烧杯中,搅拌,然后用盐酸调节pH至8,加入超纯水定容至1L。
羟基磁珠以混悬液的形式存在,制备方法为:称取5g羟基磁珠,溶于100mL体积分数为20%的乙醇水溶液中,上述羟基磁珠购自北京百迈格。
蛋白酶K以蛋白酶K溶液的形式存在,制备方法为:称取2g蛋白酶K粉加入蛋白酶K缓冲液(市售或者现有技术可以获得)定容至100mL,制成浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液。
实施例2
一种尿液游离DNA提取试剂盒,包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠,分别制备裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠和蛋白酶K:
裂解液制备:在烧杯中加入300mL超纯水,分别称取354.48g异硫氰酸胍,8.767g乙二胺四乙酸(EDTA),4.846g三羟甲基氨基甲烷(Tris),5.26g氯化钠加入烧杯中,搅拌,然后分别量取60mL Triton X-100,500mL异丙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用HCl调节pH至8.0,加入超纯水定容至1L。
洗涤液A的制备:在烧杯中加入600mL超纯水,分别称取295.4g异硫氰酸胍,0.146g乙二胺四乙酸(EDTA),0.969g三羟甲基氨基甲烷(Tris)加入烧杯中,搅拌,然后分别量取8mL Triton X-100,300mL乙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用盐酸调节pH至8.0,加入超纯水定容至1L。
洗涤液B的制备:在烧杯中加入150mL超纯水,分别称取0.146g乙二胺四乙酸(EDTA),0.969g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加入烧杯中,搅拌,然后分别量取0.8mL TritonX-100,750mL乙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用盐酸调节pH至8.0,加入超纯水定容至1L。
洗脱液的制备:在烧杯中加入900mL超纯水,分别称取0.146g乙二胺四乙酸(EDTA)和1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加入烧杯中,搅拌,然后用盐酸调节pH至8,加入超纯水定容至1L。
羟基磁珠以混悬液的形式存在,制备方法为:称取5g羟基磁珠,溶于100mL体积分数为20%的乙醇水溶液中。
蛋白酶K以蛋白酶K溶液的形式存在,制备方法为:称取2g蛋白酶K粉加入蛋白酶K缓冲液(市售或者现有技术可以获得)定容至100mL,制成浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液。
实施例3
一种尿液游离DNA提取试剂盒,包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠,分别制备裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠和蛋白酶K:
裂解液制备:在烧杯中加入500mL超纯水,分别称取590.8g异硫氰酸胍,5.845g乙二胺四乙酸(EDTA),7.268g三羟甲基氨基甲烷(Tris),6.428g氯化钠加入烧杯中,搅拌,然后分别量取40mL Triton X-100,300mL异丙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用HCl调节pH至7.0,加入超纯水定容至1L。
洗涤液A的制备:在烧杯中加入550mL超纯水,分别称取423.56g异硫氰酸胍,0.438g乙二胺四乙酸(EDTA),1.454g三羟甲基氨基甲烷(Tris)加入烧杯中,搅拌,然后分别量取12mL Triton X-100,350mL乙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用盐酸调节pH至7.5,加入超纯水定容至1L。
洗涤液B的制备:在烧杯中加入50mL超纯水,分别称取0.438g乙二胺四乙酸(EDTA),1.454g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加入烧杯中,搅拌,然后分别量取1.2mL TritonX-100,850mL乙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用盐酸调节pH至7.5,加入超纯水定容至1L。
洗脱液的制备:在烧杯中加入900mL超纯水,分别称取0.146g乙二胺四乙酸(EDTA)和1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加入烧杯中,搅拌,然后用盐酸调节pH至8,加入超纯水定容至1L。
羟基磁珠以混悬液的形式存在,制备方法为:称取5g羟基磁珠,溶于100mL体积分数为20%的乙醇水溶液中。
蛋白酶K以蛋白酶K溶液的形式存在,制备方法为:称取2g蛋白酶K粉加入蛋白酶K缓冲液(市售或者现有技术可以获得)定容至100mL,制成浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液。
实施例4
一种尿液游离DNA提取试剂盒,包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠,分别制备裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠和蛋白酶K:
裂解液制备:在烧杯中加入500mL超纯水,分别称取382.12g盐酸胍,7.306g乙二胺四乙酸(EDTA),6.057g三羟甲基氨基甲烷(Tris),5.844g氯化钠加入烧杯中,搅拌,然后分别量取500mL Tween-20,333.3mL乙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用HCl调节pH至7.5,加入超纯水定容至1L。
洗涤液A的制备:在烧杯中加入450mL超纯水,分别称取354.48g盐酸胍,0.292g乙二胺四乙酸(EDTA),1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris)加入烧杯中,搅拌,然后分别量取10mLTween-20,400mL乙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用盐酸调节pH至7.5,加入超纯水定容至1L。
洗涤液B的制备:在烧杯中加入50mL超纯水,分别称取0.292g乙二胺四乙酸(EDTA),1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加入烧杯中,搅拌,然后分别量取1mL Tween-20,800mL乙醇,加入烧杯中,搅拌均匀,用盐酸调节pH至7.5,加入超纯水定容至1L。
洗脱液的制备同实施例1。
羟基磁珠以混悬液的形式存在,制备方法同实施例1。
蛋白酶K以蛋白酶K溶液的形式存在,制备方法同实施例1。
实施例5
利用上述制备的试剂盒进行尿液游离DNA的提取,提取过程为:
(a)取3mL尿液样品进行预处理,预处理过程为:将尿液样品经4℃,1600g离心10min去除沉淀,转移第一步离心后的上清至新的离心管,然后4℃,12000g离心10min,得到的上清即为预处理后的尿液样品。在15mL或5ml无核酸酶BD管中加入2mL裂解液、100uL蛋白酶K(20mg/ml)、30uL羟基磁珠(使用前颠倒或使用移液器吹吸混匀)、2mL预处理后的尿液样品,颠倒混匀,室温,上下颠倒(垂直混匀仪)混匀30分钟,使磁珠和核酸充分结合。
(b)将BD管取下,短暂离心,磁珠沉于管底,去掉大部分上清,然后用移液器吸出磁珠和上清,转至2mL离心管中,置于磁力架上1min,吸弃上清。
(c)加入600uL洗涤液A,涡旋使磁珠重新悬浮,置于磁力架上1分钟,吸弃液体,取下离心管,瞬时离心,去残。
(d)加入600uL洗涤液B,使磁珠重新悬浮,置于磁力架上1分钟,吸弃液体,取下离心管。
(e)重复洗涤液B洗涤过程,取下离心管,瞬时离心,去残,并室温条件下挥发,直至乙醇挥尽。
(f)加入45uL洗脱液,使磁珠重新悬浮,55℃加热洗脱10分钟,期间可轻轻混匀磁珠使磁珠保持悬浮状态。
(g)离心管瞬时离心,收集管盖管壁液体,将离心管置于磁力架1分钟,将液体转移至新的1.5mL无核酸酶离心管中。
实施例6
取30mL尿液按照实施例5的方法进行预处理,分别取3组预处理后的尿液,每组2mL,其中第一组不添加任何物质,为尿液组,第二组中加入1154ng PCR产物(PCR片段长度为301bp),为尿液+PCR产物组,第三组中加入528ng DNA Marker(片段长度分别为50bp,100bp,150bp,200bp,300bp,400bp,500bp,700bp,800bp,1000bp),为尿液+Marker组,然后用实施例5中的方法进行尿液中DNA提取,每组做三个平行,对尿液组中提取的尿液中的游离DNA做初步定量,取平均值,然后分别计算PCR产物和Marker的回收率并取平均值,以尿液中游离DNA为本底量,在计算PCR产物和Marker的回收率时,需要减去本底量。具体的回收率结果如下表1所示,本发明的试剂盒对PCR产物的回收效率为95.73%,对DNA marker的回收效率为83.94%。
表1回收效率
用普通市售尿液游离DNA提取试剂盒做对照,其尿液组提取的游离DNA的总量为150ng,PCR产物和DNA marker的回收效率分别为89.28%和80.14%。
对于上述第一组尿液组提取的尿液中游离DNA用实时荧光定量PCR进行分析,以管家基因ACTB即β-actin基因进行衡量,试剂盒使用天根的SuperReal PreMix Plus(SYBRGreen)kits,实时荧光定量PCR仪采用ABI7500,反应体系如下表2所示,其中β-actin基因的上下游引物分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列分别为:
SEQ ID NO:1(ACTB-41-F:AATCTGGCACCACACCTTC)
SEQ ID NO:2(ACTB-41-R:GAGCCACACGCAGCTCATT)
表2
2×SuperReal PreMixPlus | 10μL |
ACTB-41-F(10μM) | 0.6μL |
ACTB-41-R(10μM) | 0.6μL |
游离DNA提取液 | 2μL |
50×ROX Reference Dye | 0.4μL |
RNase-free ddH2O | 6.4μL |
实验做三组平行,测得用本发明的试剂盒提取的尿液中游离DNA的CT值的平均值为19.52,用普通市售试剂盒提取的尿液中游离DNA的CT值为22.57,证明用本发明试剂盒提取得到的尿液中的有效游离DNA的含量高于普通市售试剂盒,本发明试剂盒的提取效率高于普通市售尿液游离DNA提取试剂盒。
本发明的试剂盒对不同片段的回收效率分析:
1、使用Labchip GX对提取的尿液游离DNA、回收的PCR产物和Marker进行电泳分析,结果如图1所示。
2、用本发明的试剂盒及提取方法提取的尿液游离DNA用Labchip GX生物大分子分析仪进行检测,电泳图如图2所示,检测片段范围在25bp-1500bp之间。
3、加入的PCR产物的原始峰图如图3所示,用本发明的试剂盒回收的PCR产物片段分布如图4所示。
4、加入的DNA marker的原始峰图如图5所示,用本发明的试剂盒回收的DNAMarker片段分布如图6所示,本发明的试剂盒对DNA marker的回收效率低于PCR产物的回收效率主要是由于对100bp以下的DNA片对的缺失导致整体DNA回收效率低。
以上分析结果证明本发明的试剂盒对尿液中游离DNA的回收具有良好的效果,尤其是对于100bp及以上的片段具有良好的回收效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 王煜
<120> 一种尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatctggcac cacaccttc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagccacacg cagctcatt 19
Claims (10)
1.一种尿液游离DNA提取试剂盒,其特征在于,包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠;
所述裂解液包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris-HCl和氯化钠;
所述洗涤液A包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl,所述乙醇的体积浓度为30%~40%;
所述洗涤液B包括金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl,所述乙醇的体积浓度为75%~85%。
2.根据权利要求1所述的一种尿中游离DNA提取试剂盒,其特征在于,所述胍盐选自盐酸胍和异硫氰酸胍中的一种或两种,所述金属螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾中的一种或多种;所述表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、NP-40、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠中的一种或多种,所述醇类为乙醇和异丙醇中的任一种或两种。
3.根据权利要求2所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒,其特征在于,所述胍盐为异硫氰酸胍,所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸,所述表面活性剂为Triton X-100,所述醇类为异丙醇。
4.根据权利要求1所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒,其特征在于,所述裂解液中胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris-HCl和氯化钠的工作浓度分别为3~5M、20~30mM、4%~6%(v/v)、30%~50%(v/v)、40~60mM和90~110mM,所述裂解液的pH值为7.0~8.0;所述洗涤液A中胍盐、金属螯合剂、表面活性剂和Tris-HCl的工作浓度分别为2.5~3.5M、0.5~1.5mM、0.8%~1.2%(v/v)和8~12mM,所述洗涤液A的pH值为7.0~8.0;所述洗涤液B中金属螯合剂、表面活性剂和Tris-HCl的工作浓度分别为0.5~1.5mM、0.08%~0.12%(v/v)和8~12mM,所述洗涤液B的pH值为7.0~8.0。
5.根据权利要求1所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒,其特征在于,所述洗脱液中含有0.4~0.6mM的EDTA和8~12mM的Tris-HCl,所述洗脱液的pH为7.5~8.5。
6.根据权利要求1所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒,其特征在于,所述羟基磁珠为表面修饰有硅羟基的超顺磁性纳米微球,所述羟基磁珠以磁珠混悬液的形式存在,所述羟基磁珠的浓度为40~60mg/mL。
7.根据权利要求1-6任一项所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括蛋白酶K。
8.一种尿液游离DNA的提取方法,其特征在于,采用权利要求1-7任一项所述的试剂盒进行提取,包括以下步骤:
(a)将尿液样品进行预处理,然后加入裂解液和羟基磁珠,上下颠倒混匀,孵育;
(b)磁力吸附,待羟基磁珠完全吸附时去除液体;
(c)加入洗涤液A,悬浮,磁力吸附,待羟基磁珠完全吸附时去除液体;
(d)加入洗涤液B,悬浮,磁力吸附,待羟基磁珠完全吸附时去除液体;
(e)重复步骤(d),并去除残留的乙醇;
(f)加入洗脱液,重新悬浮,孵育,期间晃动使核酸充分洗脱;
(g)磁力吸附,待羟基磁珠完全吸附时将核酸溶液转移,得到游离DNA提取液。
9.根据权利要求8所述的尿液游离DNA的提取方法,其特征在于,步骤(a)中加入蛋白酶K。
10.根据权利要求9所述尿液游离DNA的提取方法,其特征在于,步骤(a)中,所述裂解液的添加体积为预处理后尿液样品体积的1~2倍,以每mL预处理后的尿液样品计,蛋白酶K的添加量为1~3mg,羟基磁珠的添加量为0.15~1mg,孵育时间为30min,孵育时,上下颠倒混匀;步骤(c)中,所述洗涤液A的添加体积为预处理后尿液样品体积的0.3~0.5倍;步骤(d)中所述洗涤液B的添加体积为预处理后尿液样品体积的0.3~0.5倍;所述步骤(c)和步骤(d)中的悬浮为:涡旋使羟基磁珠充分悬浮;所述步骤(c)和步骤(d)中的去除液体为:吸弃液体,并离心去除容器内壁的液滴;步骤(f)中,所述洗脱液的添加体积为预处理后尿液样品体积的2%-5%,所述孵育的温度为55℃~58℃,孵育时间为5~10min。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811259276.6A CN109207476A (zh) | 2018-10-26 | 2018-10-26 | 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811259276.6A CN109207476A (zh) | 2018-10-26 | 2018-10-26 | 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109207476A true CN109207476A (zh) | 2019-01-15 |
Family
ID=64997239
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811259276.6A Pending CN109207476A (zh) | 2018-10-26 | 2018-10-26 | 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109207476A (zh) |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109880824A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-06-14 | 珠海丽珠试剂股份有限公司 | 一种通用型核酸提取试剂盒及其使用方法 |
CN110331140A (zh) * | 2019-07-12 | 2019-10-15 | 江南大学 | 一种膀胱内尿液细菌基因组dna的提取方法 |
CN111057705A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-24 | 首都医科大学附属北京胸科医院 | 一种提取游离核酸的试剂盒及使用方法 |
CN111187767A (zh) * | 2020-02-17 | 2020-05-22 | 广州达正生物科技有限公司 | 一种快速提取血浆、尿液游离dna的试剂盒和方法 |
CN111254141A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-06-09 | 博奥生物集团有限公司 | 核酸提取组合物及其应用,含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒 |
CN111690640A (zh) * | 2020-06-22 | 2020-09-22 | 广州东盛生物科技有限公司 | 一种高度兼容磁珠法病毒核酸提取试剂盒的病毒保存液 |
CN112391381A (zh) * | 2020-12-02 | 2021-02-23 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 一种基于纳米磁珠的尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 |
CN112646803A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-13 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 一种病毒基因组核酸提取试剂盒、方法及应用 |
CN113789323A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-14 | 苏州中科先进技术研究院有限公司 | 一种尿液基因组提取试剂盒及使用方法 |
CN113897351A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-01-07 | 易普森生物科技(深圳)有限公司 | 一种用于核酸提取的试剂盒 |
CN114164207A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-03-11 | 济凡生物科技(北京)有限公司 | 一种病毒核酸提取无醇裂解液、试剂盒及提取方法 |
CN114350803A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-04-15 | 中南大学湘雅三医院 | 一种大体积尿液的预处理方法及应用 |
CN114350652A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-04-15 | 力因精准医疗产品(上海)有限公司 | 血液游离dna提取试剂盒及核酸提取方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101613696A (zh) * | 2009-08-05 | 2009-12-30 | 公安部物证鉴定中心 | 提取纯化dna的试剂 |
CN101613697A (zh) * | 2009-08-05 | 2009-12-30 | 公安部物证鉴定中心 | 一种提取纯化dna的方法 |
CN101684138A (zh) * | 2008-09-26 | 2010-03-31 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 一种应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒 |
CN102229925A (zh) * | 2011-05-13 | 2011-11-02 | 薛昱 | 一种增强的磁珠法核酸提取方法 |
CN106754880A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-05-31 | 广州和实生物技术有限公司 | 尿液核酸快速提取试剂盒 |
CN106868000A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-06-20 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 体液悬浮细胞dna提取试剂盒及提取方法 |
CN108220282A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-06-29 | 德诺杰亿(北京)生物科技有限公司 | 一种游离dna的提取试剂以及提取方法 |
-
2018
- 2018-10-26 CN CN201811259276.6A patent/CN109207476A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101684138A (zh) * | 2008-09-26 | 2010-03-31 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 一种应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒 |
CN101613696A (zh) * | 2009-08-05 | 2009-12-30 | 公安部物证鉴定中心 | 提取纯化dna的试剂 |
CN101613697A (zh) * | 2009-08-05 | 2009-12-30 | 公安部物证鉴定中心 | 一种提取纯化dna的方法 |
CN102229925A (zh) * | 2011-05-13 | 2011-11-02 | 薛昱 | 一种增强的磁珠法核酸提取方法 |
CN106754880A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-05-31 | 广州和实生物技术有限公司 | 尿液核酸快速提取试剂盒 |
CN106868000A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-06-20 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 体液悬浮细胞dna提取试剂盒及提取方法 |
CN108220282A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-06-29 | 德诺杰亿(北京)生物科技有限公司 | 一种游离dna的提取试剂以及提取方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
孙宁等: "应用磁珠法检测并提取尿液游离甲基化DNA ", 《中国医科大学学报》 * |
孙树毅等: "冰冻尿液的DNA提取及其检验 ", 《中国法医学杂志》 * |
曹墨菊: "《植物生物技术概论》", 31 October 2014, 中国农业大学出版社 * |
Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109880824A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-06-14 | 珠海丽珠试剂股份有限公司 | 一种通用型核酸提取试剂盒及其使用方法 |
CN110331140A (zh) * | 2019-07-12 | 2019-10-15 | 江南大学 | 一种膀胱内尿液细菌基因组dna的提取方法 |
CN111057705A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-24 | 首都医科大学附属北京胸科医院 | 一种提取游离核酸的试剂盒及使用方法 |
CN111187767A (zh) * | 2020-02-17 | 2020-05-22 | 广州达正生物科技有限公司 | 一种快速提取血浆、尿液游离dna的试剂盒和方法 |
CN111254141A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-06-09 | 博奥生物集团有限公司 | 核酸提取组合物及其应用,含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒 |
CN111254141B (zh) * | 2020-04-28 | 2020-08-04 | 博奥生物集团有限公司 | 核酸提取组合物及其应用,含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒 |
WO2021258735A1 (zh) * | 2020-06-22 | 2021-12-30 | 广州东盛生物科技有限公司 | 一种病毒保存液 |
CN111690640A (zh) * | 2020-06-22 | 2020-09-22 | 广州东盛生物科技有限公司 | 一种高度兼容磁珠法病毒核酸提取试剂盒的病毒保存液 |
CN112391381A (zh) * | 2020-12-02 | 2021-02-23 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 一种基于纳米磁珠的尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 |
CN112646803A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-13 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 一种病毒基因组核酸提取试剂盒、方法及应用 |
CN112646803B (zh) * | 2020-12-28 | 2022-08-16 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 一种病毒基因组核酸提取试剂盒、方法及应用 |
CN113789323A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-14 | 苏州中科先进技术研究院有限公司 | 一种尿液基因组提取试剂盒及使用方法 |
CN113897351A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-01-07 | 易普森生物科技(深圳)有限公司 | 一种用于核酸提取的试剂盒 |
CN114350652A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-04-15 | 力因精准医疗产品(上海)有限公司 | 血液游离dna提取试剂盒及核酸提取方法 |
CN114350803A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-04-15 | 中南大学湘雅三医院 | 一种大体积尿液的预处理方法及应用 |
CN114164207A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-03-11 | 济凡生物科技(北京)有限公司 | 一种病毒核酸提取无醇裂解液、试剂盒及提取方法 |
CN114164207B (zh) * | 2022-02-11 | 2022-05-17 | 济凡生物科技(北京)有限公司 | 一种病毒核酸提取无醇裂解液、试剂盒及提取方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109207476A (zh) | 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 | |
CN110191962A (zh) | 外来体相关核酸的测序和分析 | |
CN107312771A (zh) | 一种高效抽提血清和血浆游离dna的方法 | |
CN110699427A (zh) | 羧基磁珠偶联修饰的核酸探针及其制备方法和应用 | |
CN112553193A (zh) | 一种磁珠法提取全血dna的试剂盒及其使用方法 | |
CN108642044A (zh) | 用于提取病毒核酸的试剂盒和方法 | |
CN111487404A (zh) | 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒 | |
CN105176977B (zh) | 一种鉴定人类个体、人源细胞株性别的引物、试剂盒和方法 | |
CN112322615B (zh) | 核酸保存液、核酸提取保存液、采血管和提取核酸的方法 | |
CN111944802A (zh) | 真菌核酸提取裂解液及提取核酸的试剂盒及方法 | |
CN107201307B (zh) | 一种采血管及其应用 | |
CN111484976A (zh) | 肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测*** | |
Zouzias et al. | Extrachromosomal DNA of Mycoplasma hominis | |
CN114058722A (zh) | 隐孢子虫活卵囊的双探针qRT-PCR检测试剂盒及其方法 | |
CN109439655B (zh) | 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法 | |
CN102925580A (zh) | Notch1基因突变的快速检测方法 | |
RU2554746C1 (ru) | Способ получения суммарной фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из крови | |
Riol et al. | Optimized lymphocyte protein extraction performed simultaneously with DNA and RNA isolation: application to the study of factors affecting DNA, RNA, and protein recovery from lymphocytes of the oldest individuals | |
CN114480573B (zh) | 一种dna直接扩增试剂及其应用 | |
CN113061653A (zh) | 用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物及检测试剂盒 | |
CN112342317A (zh) | Ihhnv病毒lamp-crispr等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法 | |
CN104403997B (zh) | 一种具有顺铂耐药性的人胃癌细胞系及其建立方法和应用 | |
NL2034340B1 (en) | MICRO RIBONUCLEIC ACID (miRNA) DETECTION KIT BASED ON PROBE-ANCHORED DUPLEX AND USE THEREOF | |
CN116904442A (zh) | 一种高灵敏血浆游离核酸提取试剂盒、提取方法和应用 | |
CN114574498B (zh) | 一种靶向肿瘤相关成纤维细胞的核酸适配体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: 410205 room 2004, building 3, Huaneng Puli, No.111, Guanyun Road, meixihu street, Yuelu District, Changsha City, Hunan Province Applicant after: Wang Yu Address before: 410000 Room 304, East District, Project Incubation Building, Science Park, Hunan University, 186 Guyuan Road, Changsha High-tech Zone, Hunan Province Applicant before: Wang Yu |
|
CB02 | Change of applicant information |