CN111087469B - 一种全人源单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全人源单克隆抗体的制备方法，所述全人源单克隆抗体来源于全人源单克隆杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株由人骨髓瘤细胞株组合和人外周血B淋巴细胞融合得到；其中，所述人骨髓瘤细胞株组合由人骨髓瘤细胞株RPMI 8226和K6H6/B5融合而成。本发明通过人骨髓瘤细胞株组合和人外周血B淋巴细胞融合得到的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株，由其产生的全人源单克隆抗体可在功能性全人源单克隆抗体的筛选、以及抗肿瘤全人源单克隆抗体药物的开发中广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于技术领域，具体涉及一种全人源单克隆抗体的制备方法。
背景技术
单克隆抗体可用于抗原结构分析，分离、纯化特定分子抗原,也用于临床疾病的诊断和治疗等。但是，目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题，导致单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢。比如，鼠源单克隆抗体不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应***；一旦被人体免疫***所识别,将产生人抗鼠抗体，被人体循环***中被很快清除掉。因此,在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,或进行全人源单克隆抗体的研制成为单克隆抗体研究的重点。
鼠源抗体的人源化改造技术、噬菌体抗体库技术和转基因鼠技术成为人源化改造和人源抗体制备的三大主要技术。现在进入临床的抗体药物大多以鼠源抗体人源化改造单抗为主。今后的抗体药物逐渐以人源性抗体为主。我国单克隆抗体药物市场尚处于起步期，市场销售额只有几千万元人民币，距离欧美发达国家的上百亿美元还有很大差距。当前，人源抗体制备技术经过多年发展，催生了一大批抗体药物在临床中成功应用，从而使得全人源抗体成为单抗药物的发展主流，但仍有一些问题亟待解决。例如，一方面，从制备技术上来说，已有两种人源抗体制备技术广泛应用于人源抗体的制备，但是人源抗体的生产成本目前依旧偏高。另一方面，从临床应用上来说，人源抗体的免疫原性仍然较低。上述问题将成为人源抗体制备的主要挑战，但随着研究的深入，这一系列问题也必将得到有效地解决，人源抗体也将更加广泛地被应用于临床中。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面，本发明提供一种全人源单克隆抗体的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种全人源单克隆抗体的制备方法，其中：所述全人源单克隆抗体来源于全人源单克隆杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株由人骨髓瘤细胞株组合和人外周血B淋巴细胞融合得到；其中，所述人骨髓瘤细胞株组合由人骨髓瘤细胞株RPMI 8226和K6H6/B5融合而成。
作为本发明所述的全人源单克隆抗体的制备方法的一种优选方案：所述人骨髓瘤细胞株RPMI 8226和K6H6/B5的细胞数量比为2：1。
作为本发明所述的全人源单克隆抗体的制备方法的一种优选方案：所述人骨髓瘤细胞株组合和人外周血B淋巴细胞按照细胞数量比为3：1融合。
作为本发明所述的全人源单克隆抗体的制备方法的一种优选方案：所述融合，为利用pH 8.0～8.2的40％PEG 4000作为融合剂，在30℃水浴作用下处理45秒。
作为本发明所述的全人源单克隆抗体的制备方法的一种优选方案：所述融合，为将人骨髓瘤细胞株RPMI 8226和K6H6/B5用DMEM混合制成细胞悬液，与人外周血B淋巴细胞按细胞数量3:1混合，1000r/min离心10min，弃上清，使人骨髓瘤细胞和人B淋巴细胞充分混匀；在30℃水浴下，将1ml pH 8.0～8.2 40％PEG 4000加入融合管内，边加边轻轻搅动，静置60秒，然后立即在90秒内加入30mL DMEM，终止反应；37℃水浴10min，1000r/min离心10min，弃上清，将细胞沉淀以含15％胎牛血清的HAT选择培养液悬起，铺入已加有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2培养箱培养。
作为本发明所述的全人源单克隆抗体的制备方法的一种优选方案：将饱和硫酸铵溶液作为包被液对所述全人源单克隆抗体进行包被，利用EILSA法进行阳性全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选。
作为本发明所述的全人源单克隆抗体的制备方法的一种优选方案：包括，将阳性全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养，并沉淀浓缩全人源单克隆抗体，之后进行抗体纯化。
作为本发明所述的全人源单克隆抗体的制备方法的一种优选方案：所述沉淀浓缩全人源单克隆抗体，为利用PEG6000沉淀蛋白后超速离心，获得高纯度高抗体滴度的全人源单克隆抗体。
本发明的有益效果：本发明通过人骨髓瘤细胞株组合和人外周血B淋巴细胞融合得到的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株，由其产生的全人源单克隆抗体可在功能性全人源单克隆抗体的筛选、以及抗肿瘤全人源单克隆抗体药物的开发中广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为全人源单克隆抗体的SDS-PAGE电泳。
图2为全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株被抗人源抗体示踪。
图3为全人源单克隆抗体被抗人源抗体westernblot法鉴定。
图4为肿瘤细胞对全人源单克隆抗体的敏感性。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明提供一种全人源单克隆抗体的制备方法，包含全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选与全人源单克隆抗体的纯化。
通过该方法筛选获得的杂交瘤细胞株是全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株。通过该方法纯化得到的抗体是全人源单克隆抗体。
全人源单克隆抗体制备过程中，用于全人源单克隆杂交瘤制备的人骨髓瘤细胞株组合为RPMI 8226(CCL-155)和K6H6/B5(/>CRL-1823)，其混合比例为2:1。全人源单克隆抗体制备过程中，用于全人源单克隆杂交瘤制备的人源脾细胞为从人全血中分离的人外周血中的B淋巴细胞。
所述人骨髓瘤细胞株组合和人外周血中的B淋巴细胞，是利用pH 8.0-8.2的40％PEG 4000作为融合剂，在30℃水浴作用下处理时间为45秒，进行融合，筛选获得全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株。
用所述的融合方法获得的杂交瘤细胞株，其培养上清通过饱和硫酸铵溶液作为包被液进行包被，利用EILSA法进行全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选。
所述的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株，利用PEG 6000沉淀蛋白后，进行蔗糖密度法超速离心，获得高纯度高抗体滴度的全人源单克隆抗体。
本发明通过人骨髓瘤细胞株组合和人外周血B淋巴细胞融合得到的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株，由其产生的全人源单克隆抗体可在功能性全人源单克隆抗体的筛选、以及抗肿瘤全人源单克隆抗体药物的开发中广泛应用。
实施例1：
步骤一 人骨髓瘤细胞的选择与培养
选择ATCC官网上的两种人骨髓瘤细胞株RPMI 8226(CCL-155)和K6H6/B5(/>CRL-1823)，用为本发明中做为全人源单克隆抗体杂交瘤细胞母本使用的人骨髓瘤细胞。细胞培养方法：含10％胎牛血清的DMEM培养，37℃，5％CO2浓度。
步骤二 人外周血B淋巴细胞的分离
通过MACS(磁珠分选)技术，选择阳性分离法，分离健康人外周血中的B淋巴细胞。已包被有CD11b人源抗体的Dynabeads(dynal公司)直接从人外周血样品中选择性吸附靶细胞。在2～8℃，Dynabeads在15～30分钟内可与细胞完成结合，形成Dynabeads〃靶细胞复合物，即B淋巴细胞。然后置于Dynal MPC磁分离器中，与磁珠结合的细胞就会被吸附在靠近磁分离器的试管壁上，用移液器移去上清液，就可以获得人外周血B淋巴细胞细胞。此法的优点：该法简便、快捷，通过与Dynabeads结合来获得靶细胞，可方便地将与细胞结合的Dynabeads去除，对B淋巴细胞的功能影响很小；可以获得高纯度(99％)、高产量(95％)的B淋巴细胞，平均1mL人外周血可以获得1*105个B淋巴细胞。
步骤三 细胞融合
1饲养细胞可于融合前一天准备，取6-8周龄ICR小鼠1只，颈椎脱位致死，放于75％酒精中消毒5-10min，固定于盘上，在超净台中无菌剪开腹部皮肤。用无菌注射器吸取HAT选择培养液20ml注入小鼠腹腔，用酒精棉球轻揉腹部，抽回培养基，并补充适量的HAT培养液中，按50μl/孔，铺入到10块96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
2融合前进行新鲜的人外周血B淋巴细胞的分离。选择肝素钠作为抗凝剂的采血管，收集正常人血液200mL，用MACS(磁珠分选)技术进行B淋巴细胞的分离，可以获得约1*107个B淋巴细胞，备用。
3融合前，进行人骨髓瘤细胞株RPMI 8226(CCL-155)和K6H6/B5(CRL-1823)的分别扩大培养。所需人骨髓瘤细胞总数为3*107个。根据实验研究，以融合率作为判断指标，RPMI 8226(/>CCL-155)和K6H6/B5(/>CRL-1823)的数量比为2:1为最佳。即人骨髓瘤细胞RPMI 8226(/>CCL-155)需2*107个，人骨髓瘤细胞K6H6/B5(/>CRL-1823)需1*107个。融合率＝融合成功形成的杂交瘤的孔数/总孔数。
4细胞融合方法：
融合时，将人骨髓瘤细胞株RPMI 8226(CCL-155)和K6H6/B5(/>CRL-1823)用DMEM混合制成细胞悬液，与人外周血B淋巴细胞按细胞数量3:1混合，加入50ml的融合管内，1000r/min离心10min，弃上清，在手心轻轻摩擦使人骨髓瘤细胞和人B淋巴细胞充分混匀；然后在30℃水浴下，将预热好的1ml pH 8.0-8.2 40％PEG 4000在45S内，由慢至快加入融合管内，边加边轻轻搅动。静置60S，然后立即在90S内加入30mL DMEM，终止反应。37℃水浴10min，后1000r/min离心10min，弃上清，轻轻将细胞沉淀以适量含15％胎牛血清的HAT选择培养液悬起，按100μl/孔的量，铺入已加有饲养细胞的96孔细胞板中，37℃，5％CO2培养箱培养。7d后补充含15％胎牛血清的HAT选择培养液50μl/孔,14天后再补充含15％胎牛血清的HAT选择培养液50μl/孔。融合14天后，即可对融合率进行计算，并进行全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选。
步骤四 全人源单克隆抗体杂交瘤阳性细胞株的筛选
1饱和硫酸铵的配置
先将硫酸氨80克溶解到100水中，加热到80左右，溶解部分过滤，其余的再溶，仍有一部分结晶，过滤的溶液当降到室温的时候就会有结晶，平衡一两天，取上清，使用时用氨水调节pH至7.0-7.2。
2盐析法包被筛选法
由于抗体也是一种蛋白质，其在水溶液中的溶解度是由其本身携带的亲水基团数和电荷数决定的，当加入饱和硫酸铵溶液后，硫酸根离子和铵根离子与抗体竞争溶液中的水分子，因为硫酸根离子和铵根离子与抗体分子相比，具有更强的亲水性，因此抗体分子表面的水化膜被破坏，同时其暴露出来的带电基团被溶液中的盐离子所中和进而导致其溶解度大大降低，依据此原理从而将全人源单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清中的抗体沉淀并包被于酶标板孔中。
从96孔板中融合成功形成杂交瘤细胞的孔中吸取150μl培养液上清，与120μl饱和硫酸铵溶液1:1混合至酶标板孔中，2-8度孵育10小时，离心机内离心，8000r/min离心15-20min，弃去上清，加250μl/孔PBS，37℃平衡2h，弃上清。用5％BSA 37℃封闭2h；含0.05％吐温-20的PBST清洗孔3次，每次静置5分钟；用1:5000稀释的HRP标记的羊抗人抗体(SIGMA)作为检测抗体，孵育1.5h；含0.05％吐温-20的PBST清洗孔3次，每次静置5分钟；用TMB显色10min。以空白孔作为阴性对照孔，选择测定孔OD值/空白孔OD值大于3以上的，判断为阳性全人源单克隆抗体杂交瘤细胞。将96孔板中连续检测两次均为阳性的细胞扩大培养，采用有限稀释法进行亚克隆。经过2-3次克隆化，待96孔板所有细胞孔均为阳性时，即可进行扩大培养，定株冻存。
步骤五 全人源单克隆抗体的纯化
1全人源单克隆抗体杂交瘤的扩大培养
将定株的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株，用转瓶培养方式进行培养，利用低位细胞培养转瓶机，规格为850平方厘米生长面积的转瓶，培养参数：2*107个杂交瘤细胞，10转/min，含5％胎牛血清的DMEM，37℃，5％CO2培养箱培养，连续培养5天。收集全人源单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清，可得到约1.5L溶液。
2沉淀浓缩全人源单克隆抗体
利用PEG 6000沉淀法沉淀全人源单克隆抗体。技术参数：8％-12％的PEG6000，可以有效沉淀IgG。向1.5L细胞培养上清中加入120g-180g PEG6000片剂，磁力搅拌器上，4℃连续搅拌10-12h，10 000×g离心30min，除去上清，留下沉淀的抗体，用用1～2倍沉淀体积的STE缓冲液再悬浮沉淀。STE缓冲液：0.1mol/LNaCL，10mmol/LTris.CL，1mmol/L EDTA；pH8.0；高压灭菌。
3蔗糖密度梯度离心法纯化全人源单克隆抗体
先在超速离心管中加入5-8mL的所获取PEG6000沉淀浓缩的抗体STE溶解液，然后在离心管中依次加入30％,45％,60％的蔗糖，加蔗糖时用长针头从底部往上加。110000×g离心2.5h，在45％与60％之间有一条明亮的带，用长针头将带都吸取出来，收集到的瓶内。去蔗糖：用STE缓冲液适量稀释纯化的抗体，然后110000×g离心3h，用少量STE(根据沉淀的量决定加入多少)缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。
步骤六 全人源单克隆抗体的特性鉴定
1纯度测定
利用SDS-PAGE技术测定全人源单克隆抗体纯度。根据分子克隆实验指南，选择10％的分离胶，5％的积层胶配方，25μg抗体/孔的上样量，进行蛋白的电泳后，考马斯亮蓝染色。在分离胶上可以清楚地在25KDa、50KDa处见2条条带。其中，25KDa为全人源单克隆抗体轻链的分子量大小；50KDa全人源单克隆抗体重链的分子量大小。经测定，该抗体的纯度达到99％。如图1所示，左侧泳道为标准蛋白质分子量标准，右侧泳道的2条带。上带位置大约在50KDa处，即为全人源单克隆抗体的重链；下带位置大约在25KDa处，即为全人源单克隆抗体的轻链。该条带位置的分子量大小符合抗体的分子量标准。
2IFA鉴定
利用间接免疫荧光技术(IFA)测定全人源单克隆抗体杂交瘤细胞。全人源单克隆抗体杂交瘤细胞培养过程中，吸取1mL悬浮培养液至1.5mL离心管，1000转离心3min后，加入1:200倍稀释的Cy3标记的羊抗人二抗(SIGMA)200μl，重悬杂交瘤细胞，37℃孵育45min，1000转离心3min后，用PBS清洗，重复2次。最后一次用100μL PBS重悬杂交瘤，取20μL细胞悬液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察(400×)。可见杂交瘤细胞被染成红色，杂交瘤细胞与抗人源抗体反应，即全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株被抗人源抗体示踪，说明该杂交瘤细胞为全人源的。见图2.
3Westernblot鉴定
利用免疫印迹技术(westernblot)鉴定全人源单克隆抗体。25μg抗体/孔的上样量，进行SDS-PAGE电泳后，80V转印至PVDF膜上，PVDF膜用5％BSA溶液37℃封闭2h，用含0.05％吐温20的PBST清洗PVDF膜三次，每次摇晃清洗5min；加入1:2000倍稀释的HRP标记的羊抗人二抗(SIGMA)10mL，室温孵育1.5h，用含0.05％吐温20的PBST清洗PVDF膜三次，每次摇晃清洗5min；将PVDF膜转移至新鲜配制的显影液中避光放置1-3min，在显影仪中显影。在PVDF膜上可以清楚地在150KDa、25KDa、50KDa处见3条条带。150KDa为全人源单克隆抗体的分子量大小；25KDa为全人源单克隆抗体轻链的分子量大小；50KDa全人源单克隆抗体重链的分子量大小。见图3.
4生物活性鉴定
用肿瘤细胞AGS验证全人源单克隆抗体的生物学活性。吸取1*105个AGS细胞至6孔板中，选择全人源单克隆抗体终浓度为10μg/mL的作用浓度，用全人源单克隆抗体与AGS细胞共培养，10h后，显微镜下观察AGS细胞的生长情况。可见，未加全人源单克隆抗体的AGS细胞生长正常(见图4A)，而加全人源单克隆抗体作用的AGS细胞被大量抑制，本发明全人源单克隆抗体AGS细胞的生长抑制率达到85％以上(见图4B)。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.一种全人源单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述全人源单克隆抗体来源于全人源单克隆杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株由人骨髓瘤细胞株组合和人外周血B淋巴细胞融合得到；
其中，所述人骨髓瘤细胞株组合由人骨髓瘤细胞株RPMI 8226和K6H6/B5按照细胞数量比为2:1，利用pH 8.0~8.2的40%PEG 4000作为融合剂，在30℃水浴作用下处理45秒融合而成；
所述杂交瘤细胞株的制备方法为将人骨髓瘤细胞株RPMI 8226和K6H6/B5用DMEM混合制成细胞悬液，与人外周血B淋巴细胞按细胞数量3:1混合，1000r/min离心10min，弃上清，使人骨髓瘤细胞和人B淋巴细胞充分混匀；在30℃水浴下，将1ml 的pH为8.0~8.2的40%PEG4000加入融合管内，边加边轻轻搅动，静置60秒，然后立即在90秒内加入30ml DMEM，终止反应；37℃水浴10min，1000r/min离心10min，弃上清，将细胞沉淀以15%胎牛血清的HAT选择培养液悬起，铺入已加有饲养细胞的细胞板中，37℃，5%CO2培养箱培养，得到杂交瘤细胞株。
2.如权利要求1所述的全人源单克隆抗体的制备方法，其特征在于：将饱和硫酸铵溶液作为包被液对所述全人源单克隆抗体进行包被，利用EILSA法进行全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选。
3.如权利要求1所述的全人源单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括，将阳性全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养，并沉淀浓缩全人源单克隆抗体，之后进行抗体纯化。
4.如权利要求3所述的全人源单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述沉淀浓缩全人源单克隆抗体，为利用PEG6000沉淀蛋白后超速离心，获得高纯度高抗体滴度的全人源单克隆抗体。
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