CN106589124A - Cd146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用 - Google Patents

Cd146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106589124A
CN106589124A CN201611078356.2A CN201611078356A CN106589124A CN 106589124 A CN106589124 A CN 106589124A CN 201611078356 A CN201611078356 A CN 201611078356A CN 106589124 A CN106589124 A CN 106589124A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibodies
cell
minutes
albumen
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611078356.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106589124B (zh
Inventor
张晓宁
易维京
时雨
平轶芳
卞修武
蔡瑞丽
廖嘉明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of TMMU
Original Assignee
First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of TMMU filed Critical First Affiliated Hospital of TMMU
Priority to CN201611078356.2A priority Critical patent/CN106589124B/zh
Publication of CN106589124A publication Critical patent/CN106589124A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106589124B publication Critical patent/CN106589124B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Abstract

一种CD146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用，其CD146单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C2016183的杂交瘤细胞株制备。本发明方法所述CD146单克隆抗体4F10具有良好的特异性，能够准确识别肿瘤血管周细胞，并且CD146单克隆抗体4F10可用于胶质瘤源性周细胞的流式细胞分选和检测。

Description

CD146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的 应用
技术领域
本发明涉及恶性胶质瘤微环境及抗血管治疗策略，以及更具体地涉及CD146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用。
背景技术
恶性胶质瘤是中枢神经***常见的原发性肿瘤，恶性程度极高，患者生存期短、复发率高、治疗困难。丰富的肿瘤新生血管是恶性胶质瘤的重要结构特征，也是导致肿瘤增殖侵袭的重要原因。周细胞是毛细血管及微血管的重要组成部分，被血管基底膜包绕，并与内皮细胞有直接接触，在稳定血管机械结构、维持内皮细胞生理学功能方面发挥重要作用。国内外的前期研究发现，胶质瘤血管周细胞大量富集且存在高度异型性。课题组最新研究发现，80％-90％的胶质瘤血管周细胞由胶质瘤干细胞转分化而来。但目前由于缺乏有效针对肿瘤血管周细胞分选和富集的方法，恶性胶质瘤中血管周细胞的表型特征及临床病理学意义尚未阐明。因此，研发特异性识别肿瘤血管周细胞的技术方法，将为进一步认识恶性胶质瘤肿瘤血管周细胞发生机理、明确其功能表型及制定靶向治疗策略提供重要支撑。
CD146是一种单链膜贯通性糖蛋白,属免疫球蛋白超家族成员,与许多细胞黏附分子有同源性。已有报道表明，CD146是正常组织中血管周细胞的标记分子之一，能特异性识别恶性胶质瘤中的血管周细胞；但针对肿瘤源性血管周细胞上CD146抗原表位的特异性识别抗体未见报道。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供CD146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用，制备针对CD146的特异性抗体并评价该抗体在分选富集胶质瘤源性血管周细胞及其表型鉴定中的效果。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种CD146单克隆抗体，其特征在于由保藏号为CCTCC NO:C2016183的杂交瘤细胞株制备。
所述CD146单克隆抗体为4F10。
上述CD146单克隆抗体的制备方法，包含以下步骤：
1)免疫原准备；
2)免疫原免疫Balb/c小鼠；
3)被免疫Balb/c小鼠血清效价测定；
4)脾脏B淋巴细胞和SP2/0细胞悬液的制备；
5)饲养细胞的制备；
6)骨髓瘤细胞和脾脏B淋巴细胞融合；
7)特异性杂交瘤细胞的筛选；
8)CD146单克隆抗体腹水制备；
9)CD146单克隆抗体亚类的鉴定；
10)腹水中纯化CD146单克隆抗体；
11)ELISA鉴定CD146单克隆抗体的特异性。
进一步地，步骤1)包括：采用真核表达的CD146蛋白作为免疫原(Met1-Gly559)，真核表达的CD146蛋白为人工程细胞表达的CD146蛋白(购自北京神州义翘，货号：10115-H08H，)。
进一步地，步骤2)包括对Balb/c小鼠进行首次免疫、第二次免疫、第三次免疫和加强免疫，其中首次免疫将CD146蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合做免疫原，第二次免疫和第三次免疫分别将CD146蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化混合做免疫原，加强免疫将CD146蛋白做免疫原，各免疫原的量、注射体积和途径不变。
进一步地，步骤5)中采用未免疫的雌性Balb/c小鼠制备饲养细胞。
进一步地，步骤9)中，CD146单克隆抗体具有Ig亚类。
进一步地，步骤11)中，CD146单克隆抗体具有特异性。
进一步地，包含以免疫荧光技术用恶性胶质瘤组织染色从CD146单克隆抗体中筛选出针对肿瘤源性血管周细胞的CD146结合最佳的CD146单克隆抗体的步骤，免疫荧光技术包括以下步骤：
1)从-20℃冰箱取出冰冻组织切片，室温复温5分钟；
2)用PBS水化切片，5分钟×3次；
3)用10％山羊血清封闭切片，室温孵育30分钟；
4)一抗孵育：加入稀释后的一抗，其中CD146单克隆抗体(1:100)，Desmin单克隆抗体(Abcam ab32362，1:100)，CD248多克隆抗体(Abcam ab67273，1:50)，CD31单克隆抗体(CST#3528，1:100)，(Abcam ab28364，1:50)，4℃孵育过夜；
5)次日，用PBS漂洗切片，5分钟×3次；
6)二抗孵育：加入稀释后的荧光二抗，室温孵育1-2小时；
7)用PBS漂洗切片，5分钟×3次；
8)DAPI染液室温孵，20分钟；
9)用PBS漂洗切片，5分钟×5次；
10)用抗荧光淬灭剂封片，置于湿盒内4℃避光保存；
11)激光共聚焦显微镜观察、采集图像。
进一步地，CD146单克隆抗体为4F10。
CD146单克隆抗体在胶质瘤源性周细胞的流式细胞分选和检测中的应用。
CD146单克隆抗体在制备治疗人恶性胶质瘤药物中的应用。
本发明的有益效果为：
1、以胶质瘤源性血管周细胞为基础，设计并制备针对CD146的特异性抗体。成功构建针对肿瘤源性血管周细胞CD146结合的最佳单克隆抗体。
2、免疫荧光结果表明，本发明制备筛选获得的CD146单克隆抗体4F10能够特异性识别胶质瘤血管周细胞，胶质瘤血管周细胞细胞紧密围绕在CD31阳性的血管内皮细胞外层，符合血管的结构层次特征。与靶向CD248、Desmin周细胞标记物的商业化抗体相比，本发明制备的CD146抗体4F10具有良好的特异性，能够准确识别肿瘤血管周细胞。
3、本发明制备筛选获得的CD146单克隆抗体4F10可用于胶质瘤源性周细胞的流式细胞分选和检测。PCR结果进一步证实，流式分选得到的CD146阳性细胞高表达周细胞标记物Desmin、CD248；本发明结果为进一步研究血管周细胞的功能表型提供了有效实验手段。
附图说明
图1为ELISA鉴定CD146单克隆抗体的特异性；
A：4F10与免疫原蛋白His-CD146的间接Elisa实验，结果显示能较好的结合；B：4F10与不同标签的CD146蛋白FC-CD146的间接Elisa实验，结果显示能较好的结合；C：4F10与同标签的CD105蛋白His-CD146105的间接Elisa实验，结果显示无交叉反应。
图2为CD146单克隆抗体及商用抗体免疫荧光染色；其中，2A：4F10与商业化CD31免疫荧光染色，结果显示4F10标记的胶质瘤周细胞位于CD31标记的内皮细胞外侧；2B：商业化CD248与商业化CD31免疫荧光染色，结果显示CD248不能特异标记胶质瘤周细胞；2C：商业化Desmin与商业化CD31免疫荧光染色，结果显示Desmin不能特异标记胶质瘤周细胞。
图3为CD146单克隆抗体分选胶质瘤原代细胞及检测；其中3A：4F10流式分选胶质瘤原代细胞，结果显示细胞有明显分群，可分为阳性和阴性两群；3B：流式分选的胶质瘤原代细胞阳性和阴性群细胞进行Q-PCR检测，结果显示4F10阳性群较阴性群周细胞相关标志物表达更高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所述杂交瘤细胞株的保藏信息：保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期为2016年10月30日，保藏号为CCTCC NO：C2016183，培养物名称及注明的鉴别特征：抗人CD146杂交瘤细胞4-F10(IgGI)。
本发明的CD146单克隆抗体的制备方法，包含步骤：采用真核表达的CD146蛋白作为免疫原，通过细胞融合技术制备杂交瘤抗体细胞株并纯化相应的CD146单克隆抗体，以免疫荧光技术用恶性胶质瘤组织染色从CD146单克隆抗体中筛选出针对肿瘤源性血管周细胞的CD146结合最佳的CD146单克隆抗体。
实施例1：CD146单克隆抗体制备
1)免疫原准备
采用购自北京神州义翘，(货号：10115-H08H)人工程细胞表达的His-CD146蛋白(Met1-Gly559)做免疫原免疫雌性Balb/c小鼠，获取脾脏B淋巴细胞用于杂交瘤融合实验。
2)免疫原免疫Balb/c小鼠
将CD146蛋白从-80℃冰箱取出，溶解后Lowry法(Folin-酚试剂法)测定蛋白含量，pH 7.4的10mmol/L PBS(磷酸缓冲盐溶液)将其稀释到1.0mg/ml。选取5只6周龄、体重约20g的雌性Balb/c小鼠。抗原乳化采用抗原乳化器乳化。首次免疫时，将CD146蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合，每只雌性Balb/c小鼠按100μg免疫原的量皮内多点加腹腔注射。第14天和第28天分别进行第二次和第三次免疫，佐剂改用弗氏不完全佐剂，抗原量、注射体积和途径不变，第三次免疫后间接ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，每只雌性Balb/c小鼠腹腔注射不加佐剂的100μg免疫原CD146蛋白，3天后细胞融合。
3)被免疫Balb/c小鼠血清效价测定
第三次免疫后10天，从雌性Balb/c小鼠尾静脉取血检测血清抗体效价；用0.1MNaCO3(PH9.6)包被液将CD146蛋白稀释为最佳工作浓度3-5μg/ml，每孔加100μl抗原液，于4℃过夜，洗板机洗板5次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液控干。采血及稀释血清：捏住鼠尾，75％酒精消毒后用剪刀在尾静脉剪一缺口，取血20μl，2000rpm离心30分钟，取上清1μl加入999μl抗体稀释液混匀，并进行倍比稀释，从1:100至1:3200，将稀释的被检血清每孔加入100μl，同时取雌性Balb/c小鼠免疫前血清1:100稀释做阴性对照，抗体稀释液做空白对照。37℃孵育1小时,反复洗涤5次以上；将辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG稀释到1:6000，每孔加100μl，37℃孵育1小时，洗涤5次；加TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液100μl/孔，室温暗处3-5分钟，每孔加终止液50μl观察结果，TMB显色后终止显黄色，用酶联免疫检测仪记录450nm读数，以空白对照孔调零后测各孔OD值大于阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。血清效价达到1:12800，可用于细胞融合。
4)脾脏B淋巴细胞和SP2/0细胞悬液的制备
取一只用CD146蛋白免疫好的雌性Balb/c小鼠，摘除雌性Balb/c小鼠眼球放血处死，眼血离心后收集血清作ELISA的阳性对照，无菌操作取出脾脏，放入盛有10ml不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的***和脂肪组织，换一玻璃皿，将脾脏捞出，置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，同时不时用不完全培养基冲洗，使脾细胞穿过网孔进入溶液中，将脾细胞移至10ml玻璃离心管中，1500rpm水平离心10分钟，去上清。同法，用不完全培养基10ml洗涤细胞1次，离心收集沉淀的细胞，将细胞用10ml不完全培养基重悬混匀，细胞计数约为1×108个细胞。
将SP2/0细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇晃，直至细胞溶液完全溶解，将细胞转移到10ml离心管中，1500rpm水平离心10分钟，弃上清，10ml完全培养液重悬沉淀，把细胞悬液转移到50ml培养瓶中，置37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长良好后用含8-AG的选择培养基筛选细胞一周；融合前2天，将1瓶细胞传至4瓶，则融合当天细胞正处于对数生长期，活力正好，细胞大小均匀，圆而透亮，融合当天，用弯头滴管将SP2/0细胞从管壁上轻轻吹下，收集于离心管中，离心，弃上清，沉淀用不完全培养基洗涤后，10ml不完全培养基重悬，细胞计数，约为5×107个。
5)饲养细胞的制备
取一只未免疫的雌性Balb/c小鼠，摘眼球放血处死，70％乙醇浸泡消毒5分钟，剪开雌性Balb/c小鼠皮肤，用镊子提起腹膜，用剪刀剪一小口，弯头滴管吸取预冷的不完全培养基冲洗腹腔，将洗液吸至50ml离心管中。同法，用不完全培养基冲洗腹腔3次，收集洗液，室温下1000rpm水平离心10分钟，去上清，10ml不完全培养基重悬细胞并计数。
6)骨髓瘤细胞和脾脏B淋巴细胞融合
融合前将美国sigma的PEG 1450(聚乙二醇1450)置于37℃培养箱中预温，吸取1×107个骨髓瘤细胞悬液和1×108个脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1:10)至一个50ml无菌离心管中，补加30ml RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute 1640)培养基，充分混匀，1500rpm离心10分钟，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37℃水浴，用滴管吸取0.8ml预温的50％PEG1450溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在1分钟左右加完，然后静置90秒，逐滴加入37℃预温的1640培养基30ml终止融合，3分钟之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37℃培养箱中静置5分钟，取出离心管，1500rpm离心5分钟，弃去上清，加入10ml HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，按100μl/孔，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃、5％CO2培养箱中培养。
融合后第4-5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加HAT培养基100μl，第10-12天可用间接ELISA法测杂交瘤效价，第14-15天换HT培养基培养。
7)特异性杂交瘤细胞的筛选
融合后12-15天，待细胞长到满培养孔的1/4-1/2孔底时，采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆；以CD146蛋白包被酶标板(0.5μg/孔)，4℃过夜，洗涤缓冲液洗涤5次，每次5分钟，拍干液体，加入50μl细胞培养上清和50μl的0.2％的PBST(含0.05％吐温的pH 7.4的磷酸盐缓冲液)，阳性对照选小鼠的免疫血清，阴性对照选SP2/0培养上清，空白对照用洗涤液，37℃孵育1小时；洗涤酶标板：每孔加入100μl含0.1％的PBST稀释的HRP标记的羊抗小鼠Ig抗体(1：6000)，37℃孵育30分钟；洗涤，拍干液体，加新鲜配制的TMB溶液100μl/孔，室温暗处反应3-5分钟，加终止液每孔50μl终止反应，酶标仪检450nm吸光度值。
结果为以人工程细胞表达的CD146蛋白为抗原，先后免疫Balb/c小鼠5只，共融合2次，先后共筛选获得高亲和力的CD146抗体5株，经3次克隆化和ELISA筛选后，得到分泌CD146单克隆抗体的杂交瘤细胞株，这些杂交瘤细胞经数次冻存，体外传代培养3个月以上均能稳定分泌CD146单克隆抗体，最终冻存于液氮罐。
8)CD146单克隆抗体腹水制备
筛选出阳性克隆后，即应立即采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，制备饲养细胞，用10ml不完全培养基重悬，收集阳性克隆细胞并计数，用不完全培养基将阳性克隆细胞稀释到100个/20ml，取一块预先已加有饲养细胞的96孔细胞培养板，加入200μl细胞悬液，将剩下的阳性克隆细胞转移到24孔板中扩大培养，收集细胞液氮冻存，同时将培养板在37℃、5％CO2培养箱培养，第3天后显微镜下观察细胞生长情况，将细胞逐步扩大培养。将8周龄的小鼠或者经产小鼠腹腔注射灭菌的石蜡油，约10天后将108个杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，于10-14天采用抽取或者杀死细胞的方式获得小鼠腹水用于纯化抗体。
9)CD146单克隆抗体亚类的鉴定
采用美国Sigma公司Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents(ELISA/Ouchterlony Double Diffusion,StockNo.ISO-2LOT 114k4817)，操作按说明书进行。
(1)包被酶标板：用包被液将CD146蛋白稀释为最佳工作浓度5ug/ml，每孔加100μl抗原液，每株加12孔，于4℃过夜，洗涤5遍，空干。
(2)封闭：每孔加封闭液350μl，37℃孵育1-1.5小时，洗涤5遍，空干。
(3)每孔加入100μl新鲜的杂交瘤细胞培养上清或稀释单抗，室温(20℃-25℃)静置1小时，摇洗3分钟，共5次。
(4)用抗体稀释液以1：2000稀释IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA。
(5)每孔加入100μl已稀释的抗体，每种抗体均加2孔，室温静置30分钟，摇洗3分钟，共5次。
(6)每孔加入稀释的兔抗羊IgG抗体100μl(1：1000)，室温静置15分钟，摇洗3分钟，共5次。
(7)每孔加入100μl底物显色液，室温避光反应10-15分钟。
(8)每孔加入50μl终止液，观察结果，确定Ig亚类。
10)腹水中纯化抗体
新鲜采集的腹水，3000rpm/分15分钟，除去细胞成分(或冻存过程中形成的固体物质)等；取上层清亮的腹水，等量加入PH 7.2巴比妥缓冲盐水(VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+)稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；3000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水，抗体纯化采用GE healthcare公司的HiTrap rProteinAHP柱。
(1)配置抗体纯化所需buffer：
Binding Buffer(A液):100mmol/L磷酸钠(sodium phosphate)，100mmol/L柠檬酸钠(sodium citrate)，pH 7.0。
Elution Buffer(B液):100mmol/L磷酸钠(sodium phosphate)，100mmol/L柠檬酸钠(sodium citrate)，pH 3.0。
Assemble Buffer(C液):1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，pH9.0。
(2)将单抗腹水与A液以1：10的比例混合，0.45μm滤膜过滤等待上样。
(3)选用HiTrap rProteinAHP柱接入AKTAExplorer，A、B液充分平衡各自管道。
(4)将(2)准备的样品从A管上样，上样后用A液平衡柱子，再用B液洗脱纯化柱，收集洗脱峰至事先加入少量C液的收集管中。
(5)调节洗脱蛋白的pH至7.0-8.0，将抗体分装冷冻保存。
11)ELISA鉴定CD146单克隆抗体的特异性
购买北京神州义翘的真核表达CD146-Fc蛋白(带Fc标签蛋白，货号：10115‐H02H)以及CD105-his蛋白(带his标签蛋白，货号：50407-M08H)，将蛋白分别用包被稀释液稀释至5μg/ml，ELISA条板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出板子弃抗原，洗板。将CD146单克隆抗体4F10作1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000稀释，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白及阴阳对照孔。37℃孵育1小时，洗板，加入二抗，1：3000HRP标记山羊抗小鼠IgG，按100μl/孔加入对应条孔中，37℃孵育40分钟。弃液，洗板，拍干，加入TMB底物液100μl/孔，避光显色10分钟，加入终止液50μl/孔。
结果如图1所示，其中A表示包被CD146免疫蛋白、B表示包被CD146-Fc重组蛋白、C表示包被CD105-His重组蛋白。CD146单克隆抗体4F10能够较好的识别CD146-Fc，而不识别同样带his标签的CD105-his蛋白，具有较好的特异性。
实施例2：免疫荧光检测
采用免疫荧光技术，检测并比较本发明的CD146单克隆抗体与商业化周细胞抗体在人恶性胶质瘤组织中的表达特征和与血管内皮细胞标记CD31的共分布情况。
1)从-20℃冰箱取出冰冻组织切片，室温复温5分钟；
2)用PBS(中杉金桥，ZLI-9062)水化切片，5分钟×3次；
3)用10％山羊血清(博士德，AR0009)封闭切片，室温孵育30分钟；
4)一抗孵育：加入稀释后的一抗，其中CD146单克隆抗体4F10(1:100)，Desmin单克隆抗体(Abcam ab32362，1:100)，CD248多克隆抗体(Abcam ab67273，1:50)，CD31单克隆抗体(CST#3528，1:100)，(Abcam ab28364，1:50)，4℃孵育过夜；
5)次日，用PBS漂洗切片，5分钟×3次；
6)二抗孵育：加入稀释后的荧光二抗(Thermofisher,Cat#:A-11034,Cat#:A-21422)，室温孵育1-2小时；
7)用PBS漂洗切片，5分钟×3次；
8)DAPI(碧云天，C1005)染液室温孵，20分钟；
9)用PBS漂洗切片，5分钟×5次；
10)用抗荧光淬灭剂封片(碧云天，P0126)，置于湿盒内4℃避光保存；
11)激光共聚焦显微镜(Leica，TCS-SP5)观察、采集图像。
结果如图2所示，其中2A表示CD146单克隆抗体、CD31单克隆抗体(Abcamab28364)；2B表示CD248多克隆抗体(Abcam ab67273)、CD31单克隆抗体(CST#3528)；2C表示Desmin单克隆抗体(Abcam ab32362)、CD31单克隆抗体(CST#3528)；CD31染色内皮细胞定位于CD146单克隆抗体4F10内侧，而商业化Desmin、CD248抗体染色特异性不高。结果表明，本发明的CD146单克隆抗体4F10能够特异性识别胶质瘤血管周细胞，胶质瘤血管周细胞紧密围绕在CD31阳性的血管内皮细胞外层，符合血管的结构层次特征。与靶向CD248、Desmin周细胞标记物的商业化抗体相比，本发明的CD146抗体4F10具有良好的特异性，能够准确识别肿瘤血管周细胞。
实施例3：流式分选及检测
采用流式细胞分选技术，测定本发明的CD146单克隆抗体的分选效果。从人胶质瘤组织中分离CD146阳性细胞和阴性细胞，采用qRT-PCR技术，比较两组细胞中周细胞标志物CD248、Desmin的表达差异。
A.细胞RNA(核糖核酸)提取及浓度测定
1)将分选后的CD146阳性和阴性细胞用PBS(中杉金桥，ZLI-9062)清洗3次，用1mlRNAiso(Takara，108-95-2)裂解，置于1.5ml EP管中；
2)每个样品加入0.2ml三氯甲烷(川东化工)，剧烈振荡20秒，常温静置5分钟；
3)12000g，4℃离心15分钟；
4)将已分层的样本取上层移入新的1.5ml EP管中，加入250μl异丙醇(川东化工)，上下倒转数次以混匀，冰浴静置20-30分钟；
5)12000g，4℃离心15分钟；
6)弃上清，加1ml 75％乙醇(川东化工无水乙醇：DEPC水＝3:1)，上下倒转数次以洗涤沉淀物；
7)12000g，4℃离心5分钟；
8)去除乙醇，打开1.5ml EP管管盖，室温干燥10分钟；
9)加入20-50μl DEPC水(上海生工，A1201H0001)溶解RNA，置于冰上放置。
10)测定RNA浓度。RNA浓度＝OD260×稀释倍数×0.04μg/μl
B.RT-PCR反应
采用Takara公司qRT-PCR试剂盒进行，操作步骤及条件参照说明书进行，PCR检测在CFX96荧光定量PCR仪上进行。
引物序列：
CD146 F-AAGCAGGAGATCACGCTACC
R-GATTCGGGGCTAATGCCTCA
Desmin F-AAATCCGGCACCTCAAGGATGAGA
R-TTTCTCGGAAGTTGAGGGCAGAGT
CD248 F-GACCACCACTCATTTGCCTGGAA
R-AGTTGGGATAATGGGAAGCTGGGT
GAPDH F-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
R-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
结果如图3所示，其中3A表示流式分选CD146阳性原代细胞，3B表示CD146阳性细胞周细胞相关标志物表达较高。结果表明：本发明的CD146单克隆抗体4F10可用于胶质瘤源性周细胞的流式细胞分选和检测。PCR结果进一步证实，流式分选得到的CD146阳性细胞高表达周细胞标记物Desmin、CD248。上述结果为进一步研究血管周细胞的功能表型提供了有效实验手段。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
<120> CD146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用
<130>
<160> 8
<170> Patent In version 3.2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> CD146上游引物
<400> 1
aagcaggaga tcacgctacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> CD146下游引物
<400> 2
gattcggggc taatgcctca 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Desmin上游引物
<400> 3
aaatccggca cctcaaggat gaga 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Desmin下游引物
<400> 4
tttctcggaa gttgagggca gagt 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> CD248上游引物
<400> 5
gaccaccact catttgcctg gaa 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> CD248下游引物
<400> 6
agttgggata atgggaagct gggt 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> GAPDH上游引物
<400> 7
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> GAPDH下游引物
<400> 8
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (10)

1.一种CD146单克隆抗体，其特征在于：由保藏号为CCTCC NO:C2016183的杂交瘤细胞株制备。
2.根据权利要求1所述的CD146单克隆抗体，其特征在于：所述CD146单克隆抗体为4F10。
3.权利要求1所述CD146单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)免疫原准备；
2)所述免疫原免疫Balb/c小鼠；
3)被免疫所述Balb/c小鼠血清效价测定；
4)脾脏B淋巴细胞和SP2/0细胞悬液的制备；
5)饲养细胞的制备；
6)骨髓瘤细胞和所述脾脏B淋巴细胞融合；
7)特异性杂交瘤细胞的筛选；
8)CD146单克隆抗体腹水制备；
9)所述CD146单克隆抗体亚类的鉴定；
10)腹水中纯化所述CD146单克隆抗体；
11)ELISA鉴定所述CD146单克隆抗体的特异性。
4.根据权利要求3所述的CD146单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)包括：采用真核表达的CD146蛋白作为免疫原，所述真核表达的CD146蛋白为人工程细胞表达的CD146蛋白。
5.根据权利要求3所述的CD146单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)包括对所述Balb/c小鼠进行首次免疫、第二次免疫、第三次免疫和加强免疫，其中所述首次免疫将CD146蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合做免疫原，所述第二次免疫和所述第三次免疫分别将CD146蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化混合做免疫原，所述加强免疫将CD146蛋白做免疫原，各免疫原的量、注射体积和途径不变。
6.根据权利要求3所述的CD146单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中采用未免疫的雌性Balb/c小鼠制备所述饲养细胞。
7.根据权利要求3所述的CD146单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤9)中，所述CD146单克隆抗体亚类为Ig亚类；所述步骤11)中，所述CD146单克隆抗体具有特异性。
8.根据权利要求3所述的CD146单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含以免疫荧光技术用恶性胶质瘤组织染色从所述CD146单克隆抗体中筛选出针对肿瘤源性血管周细胞的CD146结合最佳的CD146单克隆抗体的步骤，所述免疫荧光技术包括以下步骤：
1)从-20℃冰箱取出冰冻组织切片，室温复温5分钟；
2)用PBS水化切片，5分钟×3次；
3)用10％山羊血清封闭切片，室温孵育30分钟；
4)一抗孵育：加入稀释后的一抗，其中CD146单克隆抗体(1:100)，Desmin单克隆抗体(Abcam ab32362，1:100)，CD248多克隆抗体(Abcam ab67273，1:50)，CD31单克隆抗体(CST#3528，1:100)，(Abcam ab28364，1:50)，4℃孵育过夜；
5)次日，用PBS漂洗切片，5分钟×3次；
6)二抗孵育：加入稀释后的荧光二抗，室温孵育1-2小时；
7)用PBS漂洗切片，5分钟×3次；
8)DAPI染液室温孵，20分钟；
9)用PBS漂洗切片，5分钟×5次；
10)用抗荧光淬灭剂封片，置于湿盒内4℃避光保存；
11)激光共聚焦显微镜观察、采集图像。
9.权利要求1或2所述的CD146单克隆抗体在制备治疗人恶性胶质瘤药物中的应用。
10.权利要求1或2所述的CD146单克隆抗体在胶质瘤源性周细胞的流式细胞分选和检测中的应用。
CN201611078356.2A 2016-11-29 2016-11-29 Cd146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用 Active CN106589124B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611078356.2A CN106589124B (zh) 2016-11-29 2016-11-29 Cd146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611078356.2A CN106589124B (zh) 2016-11-29 2016-11-29 Cd146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106589124A true CN106589124A (zh) 2017-04-26
CN106589124B CN106589124B (zh) 2019-03-15

Family

ID=58594198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611078356.2A Active CN106589124B (zh) 2016-11-29 2016-11-29 Cd146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106589124B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588033A (zh) * 2018-04-24 2018-09-28 富恩生物技术（成都）有限公司 杂交瘤细胞株、cd31单克隆抗体、制备方法及应用
CN108715836A (zh) * 2018-05-31 2018-10-30 中山大学孙逸仙纪念医院 一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法
WO2019137309A1 (zh) * 2018-01-09 2019-07-18 南京任诺药业有限公司 一种具备高效中和活性的人源化抗人cd146单克隆抗体
CN111122848A (zh) * 2019-12-30 2020-05-08 浙江工业大学 一种用于筛选hgfr靶向抗体的elisa试剂盒及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070264239A1 (en) * 2006-05-10 2007-11-15 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Isolation of pericytes
CN101245101A (zh) * 2008-01-31 2008-08-20 中国科学院生物物理研究所 抗人cd146的单克隆抗体，包含其的组合物，检测可溶性cd146的方法
CN102936283A (zh) * 2008-01-31 2013-02-20 中国科学院生物物理研究所 抗人cd146的单克隆抗体，包含其的组合物，检测可溶性cd146的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070264239A1 (en) * 2006-05-10 2007-11-15 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Isolation of pericytes
CN101245101A (zh) * 2008-01-31 2008-08-20 中国科学院生物物理研究所 抗人cd146的单克隆抗体，包含其的组合物，检测可溶性cd146的方法
CN102936283A (zh) * 2008-01-31 2013-02-20 中国科学院生物物理研究所 抗人cd146的单克隆抗体，包含其的组合物，检测可溶性cd146的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIN CHENG等: "Glioblastoma Stem Cells Generate Vascular Pericytes to Support Vessel Function and Tumor Growth", 《CELL》 *
YUNAN YANG等: "Targeting CD146 with a 64Cu-labeled antibody enables in vivo immunoPET imaging of high-grade gliomas", 《PNAS》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019137309A1 (zh) * 2018-01-09 2019-07-18 南京任诺药业有限公司 一种具备高效中和活性的人源化抗人cd146单克隆抗体
CN108588033A (zh) * 2018-04-24 2018-09-28 富恩生物技术（成都）有限公司 杂交瘤细胞株、cd31单克隆抗体、制备方法及应用
CN108588033B (zh) * 2018-04-24 2021-09-24 富恩生物技术（成都）有限公司 杂交瘤细胞株、cd31单克隆抗体、制备方法及应用
CN108715836A (zh) * 2018-05-31 2018-10-30 中山大学孙逸仙纪念医院 一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法
CN108715836B (zh) * 2018-05-31 2020-07-17 中山大学孙逸仙纪念医院 一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法
CN111122848A (zh) * 2019-12-30 2020-05-08 浙江工业大学 一种用于筛选hgfr靶向抗体的elisa试剂盒及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106589124B (zh) 2019-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104694480B (zh) 一种杂交瘤细胞株、及其分泌单克隆抗体和应用
CN106589124A (zh) Cd146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用
CN105695420B (zh) 小鼠骨髓杂交瘤细胞株、及其产生的单克隆抗体和应用
CN104862283B (zh) 一对高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体及其应用
CN106366188B (zh) 抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其细胞株和应用
CN101597334A (zh) 蓝舌病病毒单克隆抗体及制备方法和应用
CN109112113B (zh) 抗人IgG的单克隆抗体、杂交瘤细胞株、试剂盒及其应用
CN101793897A (zh) 一种提高杂交瘤筛选效率的方法
CN112094352B (zh) 一种抗IgM单克隆抗体
CN106434568A (zh) 一种抗猪流行性腹泻病毒s蛋白杂交瘤细胞株及其应用
CN108752471A (zh) 抗pcv2单克隆抗体的制备方法及其应用
CN109112114A (zh) 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
CN116462758B (zh) 抗人ptprz1单克隆抗体及其在细胞流式中的应用
CN107058242A (zh) 鼠抗人cd61单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、流式检测试剂
CN107367611A (zh) 表皮生长因子受体ⅲ型突变体的elisa检测试剂盒
CN109507421B (zh) 抗水牛IgG单克隆抗体细胞株及其制备方法和应用
CN113214390B (zh) 抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体、应用及包含其的免疫磁珠
CN108254556A (zh) 一种百日咳毒素检测试剂盒及其应用
CN105132376B (zh) 一个能特异性识别HBsAg多个抗原表位的单克隆抗体及其应用
CN101892200B (zh) 抗h3n8亚型马流感病毒单克隆抗体及其用途
JP5467228B2 (ja) 便中のカンピロバクターの迅速検出方法
CN109061166B (zh) 一种用于检测牛结核病的ELISpot检测试剂盒
CN110256555A (zh) 一种丝状支原体簇单克隆抗体及其制备方法和应用
CN111748036B (zh) 一种人鼠嵌合单克隆抗体
RU2583306C1 (ru) Штамм гибридных культивированных клеток животных mus musculus хт 2е5 - продуцент моноклональных антител изотипа g 1 к в-субъединице холерного токсина

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Chongqing city Shapingba street 400038 gaotanyan No. 30

Applicant after: The First Affiliated Hospital of PLA Military Medical University

Address before: Chongqing city Shapingba street 400038 gaotanyan No. 30

Applicant before: No.1 Attached Hospital, No.3 Military Medical College PLA.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant