CN116462758B - 抗人ptprz1单克隆抗体及其在细胞流式中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗人PTPRZ1单克隆抗体及其在细胞流式中的应用。该PTPRZ1单抗由杂交瘤细胞株4A10分泌产生；杂交瘤细胞株4A10在2022年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2022363。本发明以真核表达的PTPRZ1蛋白为免疫原，通过细胞融合技术制备杂交瘤抗体细胞株并纯化相应的PTPRZ1单抗，再以流式细胞技术从纯化后的PTPRZ1单抗中筛选出针对U87胶质瘤成球细胞的PTPRZ1结合最佳的PTPRZ1单抗。该单克隆抗体能特异性结合细胞表面的PTPRZ1，抗原检测灵敏度高，能用于细胞流式检测和分选。

Description

抗人PTPRZ1单克隆抗体及其在细胞流式中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗人PTPRZ1单克隆抗体及其在细胞流式中的应用。
背景技术
蛋白酪氨酸磷酸酶受体Z1型(Protein Tyrosine Phosphatase Receptor TypeZ1,PTPRZ1)是具有磷酸水解酶功能的跨膜蛋白，由碳酸酐酶结构域、纤维连接蛋白结构域、跨膜区、磷酸水解酶功能区组成。参与细胞外信号感知和细胞间通讯，对维持神经前体细胞的生存和神经发育至关重要。在病理条件下，在包括脑胶质瘤在内的实体肿瘤中异常表达，参与肿瘤发生、细胞增殖、细胞侵袭等恶性生物学行为。
脑胶质瘤是成人最常见的原发性神经上皮源性肿瘤，恶性脑胶质瘤具有高致残率、高复发率等特征，严重影响患者生存质量。当前恶性脑胶质瘤诊疗方案以手术为主，辅助放疗和替莫唑胺化疗，但治疗效果十分有限，迫切需要研究胶质瘤生物学行为的调控机理并基于此研发新型诊断和治疗策略。而上述研究和临床转化的模型基础是将肿瘤细胞标记出来，用于体外和动物模型的实验研究。PTPRZ1在胶质瘤成球细胞中显著高表达，高表达PTPRZ1的胶质瘤成球细胞具有肿瘤干细胞的特征，是始动肿瘤发生和促进肿瘤进展的关键。对肿瘤细胞PTPRZ1表达水平和表达比例检测，对胶质瘤诊断和生物学表型研究具有重要意义，建立有效的PTPRZ1流式细胞检测方案是目前亟需解决的关键问题。
流式细胞术是基于通过单克隆抗体与细胞表面的特异性抗原结合而在单个细胞水平上对细胞是否特定抗原和表达水平进行定量分析的技术，具有灵敏度高、特异性好、精度高的优点，已用于科学研究和临床疾病检测。目前尚无商业化的用于PTPRZ1检测的流式抗体。
公开号为“WO2019068007A1”，“CN111465693A”，“WO2020097395A1”等发明专利公开了可以选用PTPRZ1的特定肽段作为治疗靶标以开发肿瘤治疗手段，但是这些公开资料中均未提供能够特异识别细胞表面天然PTPRZ1的抗体来源或者抗体的氨基酸编码序列。而当前市售的PTPRZ1抗体无法实现细胞流式检测及分选。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种PTPRZ1单克隆抗体，该单克隆抗体对PTPRZ1阳性的胶质瘤成球细胞具有较高的结合识别能力，可特异性结合胶质瘤成球细胞表面的天然PTPRZ1蛋白，为胶质瘤的检测和治疗提供了支持。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
PTPRZ1单克隆抗体，所述PTPRZ1单克隆抗体的重链CDR区包括氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述PTPRZ1单克隆抗体的轻链CDR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR4、SEQ ID NO:5所示的CDR5和SEQ ID NO:6示的CDR6。
进一步，所述的PTPRZ1单克隆抗体来源于杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株由骨髓瘤细胞和脾脏B淋巴细胞融合得到。
进一步，所述PTPRZ1单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2022363的杂交瘤细胞株4A10分泌而得。
进一步，所述PTPRZ1单克隆抗体的重链为IgG2a，轻链为Kappa。
进一步，所述PTPRZ1单克隆抗体特异性识别胶质瘤成球细胞表面的天然PTPRZ1蛋白。
进一步，所述PTPRZ1单克隆抗体为4A10。
本发明的目的之二在于提供一种分泌PTPRZ1单克隆抗体的杂交瘤细胞株4A10。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
分泌PTPRZ1单克隆抗体的杂交瘤细胞株4A10。
进一步，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株4A10；所述杂交瘤细胞株4A10在2022年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022363。
本发明的目的之三在于提供一种PTPRZ1单克隆抗体的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
PTPRZ1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1：以真核表达的PTPRZ1蛋白为免疫原免疫小鼠；
S2：对S1所得被免疫小鼠进行血清效价测定；
S3：制备脾脏B淋巴细胞和SP2/0细胞悬液；
S4：制备饲养细胞；
S5：将骨髓瘤细胞和S4制得的脾脏B淋巴细胞融合；
S6：筛选特异性杂交瘤细胞；
S7：制备PTPRZ1单克隆抗体腹水；
S8：鉴定PTPRZ1单克隆抗体亚类；
S9：腹水中纯化PTPRZ1单克隆抗体；
S10：ELISA鉴定PTPRZ1单克隆抗体的特异性，得到所述PTPRZ1单克隆抗体。
进一步，所述小鼠为6-8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠。
进一步，所述真核表达的PTPRZ1蛋白优选为人工程细胞表达的PTPRZ1蛋白。
进一步，S1具体为：对Balb/c小鼠进行首次免疫、第二次免疫、第三次免疫和加强免疫；所述首次免疫将PTPRZ1蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合做免疫原；所述第二次免疫和所述第三次免疫分别将PTPRZ1蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化混合做免疫原；所述加强免疫将PTPRZ1蛋白做免疫原。
进一步，S1中，各免疫原的量、注射体积和途径不变。
进一步，S4中，采用未免疫的雌性Balb/c小鼠制备饲养细胞。
进一步，S8中，所述PTPRZ1单克隆抗体具有Ig亚类；S10中，所述PTPRZ1单克隆抗体具有特异性。
进一步，包含以细胞流式检测技术从PTPRZ1单克隆抗体中筛选出针对胶质瘤成球细胞的PTPRZ1结合最佳的PTPRZ1单克隆抗体的步骤，所述细胞流式检测技术包括以下步骤：
使用间接标记法进行染色：
1)制备U87胶质瘤成球细胞单细胞悬液；
2)细胞计数，细胞活率为90～95％；
3)在试管中加入PTPRZ1单克隆抗体(1μg/ml)，冰上孵育30分钟，PBS洗两次；
4)加入Alexa Fluor647荧光二抗(1:1000稀释)，冰上孵育20分钟，PBS洗两次；
5)上机检测。
本发明的目的之四在于提供一种基于流式细胞术检测U87胶质瘤成球细胞的方法，该PTPRZ1单克隆抗体4A10对胶质瘤成球细胞表面的天然PTPRZ1蛋白具有高特异性、高灵敏度的检测效果。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
基于流式细胞术检测U87胶质瘤成球细胞的方法，以目的一所述PTPRZ1单克隆抗体为检测试剂进行流式细胞检测；所述PTPRZ1单克隆抗体特异性结合胶质瘤成球细胞表面的天然PTPRZ1蛋白。
本发明的目的之五在于提供一种基于ELISA方法定性或定量检测U87胶质瘤成球细胞的方法，该PTPRZ1单克隆抗体4A10对U87胶质瘤成球细胞具有较好的结合识别能力。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
基于ELISA方法定性或定量检测U87胶质瘤成球细胞的方法，利用目的一所述PTPRZ1单克隆抗体进行ELISA检测；所述PTPRZ1单克隆抗体特异性结合U87胶质瘤成球细胞表面的天然PTPRZ1蛋白。
进一步，PTPRZ1单克隆抗体在制备胶质瘤的检测试剂和/或诊断试剂中的应用，包括用于流式分选检测、ELISA检测。
本发明的目的之六在于提供一种PTPRZ1单克隆抗体和/或杂交瘤细胞株4A10在流式细胞术检测PTPRZ1表达水平和细胞分选中的应用。
本发明的有益效果在于：
1.在ELISA检测中，本发明公开的PTPRZ1单克隆抗体4A10对U87胶质瘤成球细胞具有更优的结合识别能力；
2.在细胞流式检测中，本发明公开的PTPRZ1单克隆抗体4A10对U87胶质瘤成球细胞表面的天然PTPRZ1蛋白具有更优的检测效果。
附图说明
图1为重组表达纯化所得PTPRZ1(片段1和片段2)的电泳检测结果图；
图2为5株PTPRZ1单克隆抗体与U87胶质瘤成球细胞结合的细胞流式检测结果图；
图3为4A10抗体和商品化PTPRZ1抗体与U87胶质瘤成球细胞结合的细胞流式检测结果图；
图4为经4A10抗体流式分选后的阳性U87胶质瘤成球细胞的细胞流式回测结果图
图5为4A10抗体与PTPRZ1野生型或PTPRZ1敲低型U87胶质瘤成球细胞流式检测结果图；
图6为4A10抗体与商品化PTPRZ1抗体与U87胶质瘤成球细胞结合细胞ELISA检测结果图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，杂交瘤细胞株的保藏信息如下：
培养物名称：杂交瘤细胞株Hybridoma cell line 4A10；保藏号为CCTCC NO:C2022363；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学；保藏日期为2022年12月29日；申请保藏单位为陆军军医大学第一附属医院；申请保***为时雨。
本发明实施例中，PTPRZ1单克隆抗体的制备方法为：采用真核表达的PTPRZ1蛋白作为免疫原，通过细胞融合技术制备杂交瘤抗体细胞株并纯化相应的PTPRZ1单克隆抗体，以流式细胞技术从PTPRZ1单克隆抗体中筛选出针对胶质瘤成球细胞的PTPRZ1结合最佳的PTPRZ1单克隆抗体。
实施例1.重组PTPRZ1蛋白的表达纯化
选取人PTPRZ1基因(UniprotKB：P23471)的特定区域克隆至真核表达载体获得真核表达质粒，选取的片段1为氨基酸26-300的区段，选取的片段2为26-501的区段；将表达质粒转染HEK293细胞后进行悬浮培养5天，离心收集细胞上清；通过镍柱纯化和阴离子交换纯化得到目的蛋白。
使用12％ SDS-PAGE对纯化的PTPRZ1蛋白进行电泳检测，每个泳道的蛋白上样量为15μg，电泳完成后使用考马斯亮蓝染色液对蛋白胶进行染色，结果如图1所示。片段1的预测分子量为31.5kDa，片段2的预测分子量为54.1kDa；实际纯化所得PTPRZ1蛋白均大于预测分子量。
实施例2.小鼠免疫及抗体检测
将弗氏完全佐剂与浓度为2mg/ml的抗原蛋白(PTPRZ1-片段1)按等体积混合并乳化；乳化完成的抗原免疫6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠；采用脚底注射每只小鼠注射100μg抗原蛋白；初次免疫完成两周后，将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，再次采用脚底注射，每只小鼠注射100μg抗原蛋白；两周以后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价；并选取血清效价>8万的小鼠开展融合前的加强免疫，具体操作为：在相应小鼠的***注射100μg不含佐剂的免疫原。加强免疫第3天开展细胞融合。
被免疫Balb/c小鼠血清效价测定方法如下：
第三次免疫后10天，从雌性Balb/c小鼠尾静脉取血检测血清抗体效价；用0.1MNaCO3(PH9.6)包被液将PTPRZ1蛋白(片段1)稀释为浓度1μg/ml，每孔加100μl抗原液，于4℃过夜，洗板机洗板5次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液控干。采血及稀释血清：捏住鼠尾，75％酒精消毒后用剪刀在尾静脉剪一缺口，取血20μl，2000rpm离心30分钟，取上清1μl加入999μl抗体稀释液混匀，并进行3倍梯度倍比稀释，从1:1000至1:729000，将稀释的被检血清每孔加入100μl，同时取雌性Balb/c小鼠免疫前血清1:100稀释做阴性对照，抗体稀释液做空白对照。37℃孵育1小时,反复洗涤5次以上；将辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG稀释到1:6000，每孔加100μl，37℃孵育1小时，洗涤5次；加TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液100μl/孔，室温暗处3-5分钟，每孔加终止液50μl观察结果，TMB显色后终止显黄色，用酶联免疫检测仪记录450nm读数，以空白对照孔调零后测各孔OD值大于阴性对照OD值0.3的孔，定义为阳性。选取血清效价达到1:80000的小鼠用于细胞融合。
实施例3.B细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选和亚克隆
1.脾脏B淋巴细胞和SP2/0细胞悬液的制备
取用PTPRZ1蛋白免疫好的雌性Balb/c小鼠，摘除雌性Balb/c小鼠眼球放血处死，眼血离心后收集血清作ELISA的阳性对照，无菌操作取出小鼠腹股沟***，放入盛有10ml不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的***和脂肪组织，换一玻璃皿，将脾脏捞出，置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，同时不时用不完全培养基冲洗，使脾细胞穿过网孔进入溶液中，将脾细胞移至10ml玻璃离心管中，1500rpm水平离心10分钟，去上清。同法，用不完全培养基10ml洗涤细胞1次，离心收集沉淀的细胞，将细胞用10ml不完全培养基重悬混匀，细胞计数约为1×108个细胞。
将SP2/0细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇晃，直至细胞溶液完全溶解，将细胞转移到10ml离心管中，1500rpm水平离心10分钟，弃上清，10ml完全培养液重悬沉淀，把细胞悬液转移到50ml培养瓶中，置37℃、5％ CO2培养箱中培养。待细胞生长良好后用含8-AG的选择培养基筛选细胞一周；融合前2天，将1瓶细胞传至4瓶，则融合当天细胞正处于对数生长期，活力正好，细胞大小均匀，圆而透亮，融合当天，用弯头滴管将SP2/0细胞从管壁上轻轻吹下，收集于离心管中，离心，弃上清，沉淀用不完全培养基洗涤后，10ml不完全培养基重悬，细胞计数，约为5×107个。
2.饲养细胞的制备
取未免疫的雌性大鼠，摘眼球放血处死，70％乙醇浸泡消毒5分钟，剪开大鼠皮肤，用镊子提起腹膜，用剪刀剪一小口，弯头滴管吸取预冷的不完全培养基冲洗腹腔，将洗液吸至50ml离心管中。同法，用不完全培养基冲洗腹腔3次，收集洗液，室温下1000rpm水平离心10分钟，去上清，10ml不完全培养基重悬细胞并计数。
3.骨髓瘤细胞和脾脏B淋巴细胞融合
融合前将PEG 1450(聚乙二醇1450)置于37℃培养箱中预温，吸取1×107个骨髓瘤细胞悬液和1×108个脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1:10)至一个50ml无菌离心管中，补加30ml RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute 1640)培养基，充分混匀，1500rpm离心10分钟，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37℃水浴，用滴管吸取0.8ml预温的50％ PEG1450溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在1分钟左右加完，然后静置90秒，逐滴加入37℃预温的1640培养基30ml终止融合，3分钟之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37℃培养箱中静置5分钟，取出离心管，1500rpm离心5分钟，弃去上清，加入10ml HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，按100μl/孔，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃、5％ CO2培养箱中培养。
融合后第4-5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加HAT培养基100μl，第10-12天可用间接ELISA法测杂交瘤效价，第14-15天换HT培养基培养。
4.特异性杂交瘤细胞的筛选
初步筛选：融合后12-15天，待细胞长到满培养孔的1/4-1/2孔底时，采用游离ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆；以山羊抗小鼠多抗包被酶标板(0.5μg/孔)，4℃过夜，洗涤缓冲液洗涤5次，每次5分钟，拍干液体，加入50μl细胞培养上清和50μl的0.2％的PBST(含0.05％吐温的pH 7.4的磷酸盐缓冲液)，阳性对照选小鼠的免疫血清，阴性对照选SP2/0培养上清，空白对照用洗涤液，37℃孵育1小时；使用生物素(品牌：Thermo Fisher，货号：20217)标记PTPRZ1蛋白(片段2)得到PTPRZ1-生物素，洗涤酶标板后加入100μlPTPRZ1-生物素稀释液(约0.5μg/mL)37℃孵育1小时。洗涤酶标板以后，再加入1：5000稀释的链霉素亲和素-HRP(品牌：Thermo Fisher，货号：434323)，37℃孵育30分钟；洗涤，拍干液体，加新鲜配制的TMB溶液100μl/孔，室温暗处反应3-5分钟，加终止液每孔50μl终止反应，酶标仪检450nm吸光度值。
5.复核筛选1：
选取初步筛选中，显色值OD450>0.5的细胞孔，吸走残余培养基，加入200μl新鲜培养基后培养过夜。第二天各吸取50μl细胞培养上清用于复核筛选。仍采用与初步筛选类似的游离ELISA法进行复核筛选：以山羊抗小鼠多抗包被酶标板(0.5μg/孔)，4℃过夜，洗涤缓冲液洗涤5次，每次5分钟，拍干液体，加入50μl细胞培养上清和50μl的0.2％的PBST(含0.05％吐温的pH 7.4的磷酸盐缓冲液)，阳性对照选小鼠的免疫血清，阴性对照选SP2/0培养上清，空白对照用洗涤液，37℃孵育1小时；使用生物素(品牌：Thermo Fisher，货号：20217)标记PTPRZ1蛋白(片段1，注意，此处区别于初步筛选)得到PTPRZ1-生物素，洗涤酶标板后加入100μl PTPRZ1-生物素稀释液(约0.5μg/mL)37℃孵育1小时。洗涤酶标板以后，再加入1：5000稀释的链霉素亲和素-HRP(品牌：Thermo Fisher，货号：434323)，37℃孵育30分钟；洗涤，拍干液体，加新鲜配制的TMB溶液100μl/孔，室温暗处反应3-5分钟，加终止液每孔50μl终止反应，酶标仪检450nm吸光度值。
6.复核筛选2：
采用细胞ELISA方法进行复核筛选2的筛选。选取复核筛选1中显色值OD450>0.5的细胞孔用于复核筛选2，其余细胞孔淘汰。于96孔细胞培养板中培养U87胶质瘤成球细胞，约4×104个细胞/孔，贴壁培养过夜。第二天吸走培养基，用PBS清洗两遍，使用4％ PFA固定处理10分钟。吸走固定液，用PBS清洗2遍。取50μl待查的细胞上清加入细胞ELISA孔，于室温条件300rpm孵育1小时。吸走上清，用洗涤缓冲液洗涤2次，拍干液体后，加入1：5000稀释的HRP标记山羊抗鼠多抗(品牌：中山金桥，货号：ZB-2305)，于室温条件300rpm孵育1小时；洗涤，拍干液体，加新鲜配制的TMB溶液100μl/孔，室温暗处反应3-5分钟，加终止液每孔50μl终止反应，酶标仪检450nm吸光度值。选出显色值>0.3的细胞进行后续克隆化培养。
结果为以人工程细胞表达的PTPRZ1蛋白为抗原，先后免疫Balb/c小鼠6只，共融合2次，先后共筛选获得5株高亲和力的PTPRZ1抗体，经3次克隆化和ELISA筛选后，得到分泌PTPRZ1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，这些杂交瘤细胞经数次冻存，体外传代培养3个月以上均能稳定分泌PTPRZ1单克隆抗体，最终冻存于液氮罐。
实施例4.抗体的纯化制备
将经过筛选及克隆化所得目的杂交瘤细胞扩大培养，并接种至摇瓶进行无血清摇瓶培养发酵。按照1×106个/mL的浓度接种摇瓶，于37℃，65rpm的无菌条件连续培养4天。发酵完成后，收取培养液，于15℃，4000g离心条件离心30分钟，收取离心上清，并用0.45μm滤膜对离心上清进行过滤，收集滤液。采用蛋白G纯化柱进行亲和纯化，得到目的抗体。
实施例5.抗体的亚型鉴定及基因序列克隆
采用SouthernBiothech公司的SBA Clonotyping System-HRP试剂盒，按照说明书的操作来鉴定单克隆抗体重链和轻链的亚型。
具体操作为：用包被液(0.05M pH9.5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液)将捕获抗体稀释至1μg/mL，按照100μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液(洗板液)洗板3次。用稀释液(1％BSA,0.1％PBST)按照1:1稀释待检杂交瘤细胞的培养上清，按照100μL/孔加入酶标板，于37℃孵育30分钟。用稀释液将对应的酶标抗体(Ig-HRP,IgG1-HRP,IgG2a-HRP,IgG2b-HRP,IgG3-HRP,IgM-RP,kappa-HRP,lamda-HRP)1:3000稀释。用洗板液3次洗板后每孔加入100μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，约5分钟(视反应强弱而定)之后加入2M硫酸终止反应，读取OD450吸光值。经过鉴定，本发明抗体的重链均为IgG2a，轻链为Kappa。根据抗体亚型结果，采用成熟的技术路线克隆抗体基因序列。收集生长状态良好的杂交瘤细胞，利用Thermo公司的Trizol提取杂交瘤细胞总RNA，按照Takara公司的PrimeScript II ReverseTranscriptase说明书的操作方法将mRNA逆转录为cDNA，于-20℃冻存备用。
反转录具体操作流程如下：
首先配制10μL总体积的模板RNA/引物DNA的预混液，其中包括1μL 10μM浓度的逆转录引物引物(Oligo d(T)18mer)，4μL浓度为2.5mM的dNTP混合液，5μL RNA(总量小于5μg)。混匀之后于65℃处理5分钟，立即放于冰上。向预混液中加入4μL 5×PrimeScript II缓冲液，20单位的RNA酶抑制剂，1μLPrimeScript II RTase(200单位)，混匀之后于42℃反应60分钟，再于70℃处理15分钟，之后放于冰上冷却备用。以cDNA为模板，采用文献报道的抗体基因扩增引物分别独立进行扩增尝试，筛选出能够高效扩增抗体基因的引物。按南京诺唯赞公司的Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase说明书的操作方案进行PCR。
PCR反应体系为：25μL 2×Phanta、1μL dNTP、4μL 10uM引物对、4μL杂交瘤细胞cDNA、1μL DNA polymerase、15μL dd H2O，总反应体积为50μL；扩增条件为：预变性94℃，3min；变性94℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，2min。按照OMEGA公司OMEGA GelExtraction Kit说明书对PCR产物进行胶回收，扩增产物链接T载体以后经过质粒测序获得抗体基因序列。
实施例6.抗体与U87胶质瘤成球细胞结合的细胞流式检测
采用流式细胞检测技术，测定本发明的PTPRZ1单克隆抗体的结合效果。
使用间接标记法进行染色：
1)制备U87胶质瘤成球细胞单细胞悬液；
2)细胞计数，取出1×106个细胞于离心管中；
3)用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数90～95％；
4)在试管中加入PTPRZ1单克隆抗体(1μg/ml)，冰上孵育30分钟；
5)PBS洗涤两次，600rpm，离心3分钟，弃上清；
6)加入Alexa Fluor647荧光二抗(品牌：Invitrogen，货号：A-31571，1:1000稀释)，冰上孵育20分钟；
7)PBS洗两次，600rpm，离心3分钟，弃上清；
8)加300μl PBS重悬，上机检测。
检测结果如图2所示，图中数据表明，阴性对照在阴性范围，本发明5株Alexa-Flour647-PTPRZ1抗体与人U87胶质瘤成球细胞孵育后阳性率为：2F4抗体结合率39.3％，3G5抗体结合率31.2％，6D5抗体结合率58.9％，2F10抗体结合率34.3％，4A10抗体结合率67.9％，4A10抗体结合效率最高，用于后续实验。
实施例7.4A10抗体和商品化抗体与U87胶质瘤成球细胞结合的细胞流式检测
采用流式细胞检测技术，测定本发明的PTPRZ1单克隆抗体与商品化抗体(品牌：R&DSystems，货号：MAB26881)的效果对比。
使用间接标记法进行染色：
1)制备U87胶质瘤成球细胞单细胞悬液；
2)细胞计数，取出1×106个细胞于离心管中；
3)用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数90～95％；
4)在试管中加入PTPRZ1单克隆抗体(1μg/ml)，冰上孵育30分钟；
5)PBS洗涤两次，600rpm，离心3分钟，弃上清；
6)加入Alexa Fluor647荧光二抗(品牌：Invitrogen，货号：A-31571，1:1000稀释)，冰上孵育20分钟；
7)PBS洗两次，600rpm，离心3分钟，弃上清；
8)加300μl PBS重悬，上机检测。
市售PTPRZ1抗体来源于知名抗体品牌R&D Systems，货号MAB26881，本实验室常用于流式检测应用。检测结果如图3所示，图中的数据表明，阴性对照在阴性范围，本发明4A10抗体对U87胶质瘤成球细胞表面的天然PTPRZ1蛋白表现出优于市售抗体的结合性能。同时，4A10抗体流式回测效率达到98.2％，符合流式分选要求，如图4所示。
实施例8.4A10抗体与U87胶质瘤成球细胞特异结合的细胞流式检测
采用流式细胞检测技术，测定本发明的PTPRZ1单克隆抗体特异性。
使用间接标记法进行染色：
1)制备U87胶质瘤成球细胞单细胞悬液；
2)细胞计数，取出1×106个细胞于离心管中；
3)用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数90～95％；
4)在试管中加入PTPRZ1单克隆抗体(1μg/ml)，冰上孵育30分钟；
5)PBS洗涤两次，600rpm，离心3分钟，弃上清；
6)加入Alexa Fluor647荧光二抗(品牌：Invitrogen，货号：A-31571，1:1000稀释)，冰上孵育20分钟；
7)PBS洗两次，600rpm，离心3分钟，弃上清；
8)加300μl PBS重悬，上机检测。
利用PTPRZ1敲低的U87胶质瘤成球细胞进行4A10抗体结合特异性检测，检测结果如图5所示，图中数据表明，阴性对照在阴性范围，ShCtrl-U87胶质瘤成球细胞阳性率为64.1％，ShPTPRZ1-U87胶质瘤成球细胞组阳性率为19.9％，ShCtrl组和ShPTPRZ1组阳性细胞差异值为44.2％，表明本发明4A10抗体具有良好的抗体结合特异性较高。
实施例9.4A10抗体和商品化抗体与U87胶质瘤成球细胞特异结合的细胞ELISA检测
采用细胞ELISA检测技术，测定本发明的PTPRZ1单克隆抗体与商业化抗体(品牌：Abcam，货号：ab290640)的抗体亲和力。
使用间接ELISA法进行检测：
1)包被抗原:稀释PTPRZ1蛋白至1μg/ml，取0.1ml加于96孔板每个小孔中,4℃过夜，随后2％BSA置于37℃孵育1小时；
2)洗涤:移去包被液,96孔板用洗涤缓冲液洗3次,每次5分钟；
3)加被检抗体:4A10抗体和商业化PTPRZ1抗体稀释至10ng/ml，每孔加入0.1mL,37℃,作用1小时；
4)移去液体,96孔板用洗涤缓冲液洗3次,每次5分钟，拍干水分；
5)加入二抗:每孔加入稀释5000倍的羊抗兔IgG-HRP二抗0.1mL,37℃作用1小时；
6)移去液体,96孔板用洗涤缓冲液洗3次,每次5分钟，拍干水分；
7)每孔加入0.1mLTMB底物溶液，室温作用30分钟；
8)终止反应:每孔加2mol/L H2SO4 0.05mL；
9)检测:使用酶标比色计于450nm和570nm进行双波长OD值检测。
商业化PTPRZ1抗体来源于知名抗体品牌Abcam，货号ab290640；本实验室常用于检测免疫组化和免疫印迹检测应用。检测结果如图6所示，图中的数据表明，阴性对照在阴性范围，商业化抗体组OD值为0.0942,4A10抗体组OD值为0.4691，4A10抗体组OD值是商业化抗体组的4.98倍，本发明的4A10抗体对PTPRZ1蛋白分子的亲和力更强、灵敏度更高，可在较低抗体浓度条件下仍可以达到较高OD值，如此可节约实验和检测成本。

Claims (5)

1.杂交瘤细胞株4A10，其特征在于，所述杂交瘤细胞株4A10在2022年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022363。
2.PTPRZ1单克隆抗体，其特征在于，所述PTPRZ1单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株4A10分泌而得。
3.权利要求2所述的PTPRZ1单克隆抗体在制备用于流式细胞术检测U87胶质瘤成球细胞的检测试剂中的应用，其特征在于，所述PTPRZ1单克隆抗体特异性结合U87胶质瘤成球细胞表面的天然PTPRZ1蛋白。
4.权利要求2所述的PTPRZ1单克隆抗体在制备用于ELISA方法定性或定量检测U87胶质瘤成球细胞的检测试剂中的应用，其特征在于，所述PTPRZ1单克隆抗体特异性结合U87胶质瘤成球细胞表面的天然PTPRZ1蛋白。
5.权利要求2所述的PTPRZ1单克隆抗体在制备胶质瘤的检测试剂和/或诊断试剂中的应用，其特征在于，其用流式分选或ELISA进行检测。
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