CN110452881A - 以cd4为靶点的抗体及car-t细胞的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供以CD4为靶点的抗体及CAR‑T细胞的制备和应用，属于特异性抗体的制备方法，本发明中血清用40％、35％、33％的硫酸铵盐析三次(或20％的硫酸钠)粗提y‑球蛋白，经离子层析、亲和层析纯化Ig或酶解法制备Fab或Fc片段，离子层析采用QAE‑Sephadex纤维素，能够吸附血清中多种蛋白质，亲和层析将抗原交联到Sepharose4B，利用生物学分子间所具有的专一亲和性进行层析，能够去除血清中含有与抗体不相关的成份；佐剂配料采用Ag+NS，能增强机体免疫应答，同时也能改变机体免疫类型的物质；改变抗原的物理性状，延缓抗原的释放，增强巨噬细胞抗原处理，活化巨噬细胞，增强淋巴细胞的应答能力。

Description

以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用
技术领域
本发明属于特异性抗体的制备方法，具体涉及以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用。
背景技术
抗体是具有4条多肽链的对称结构,其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)；链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子；轻链有k和入两种，重链有p、δ、y、和a五种；整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分；在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。
抗体和抗原的特异性结合是免疫的重要部分,也是具有较强发展潜力的课题，许多的药物生产和疾病的治疗都依赖于他的成熟发展和新成果的获得，抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理变化，包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段，以及由亲水胶体转为疏水胶体的变化，根据其原理进行新的开发与利用是当前主要研究手段。
通过将识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM，通常为CD3ζ或FcεRIγ)”在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，称之为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，CAR-T细胞在体内、外都具有对特定肿瘤抗原高度亲和性及对抗原负载细胞高效杀伤特性。CAR-T细胞技术在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤等恶性肿瘤治疗中均显示出良好的抗肿瘤效应。
发明内容
本发明的目的是为解决现有的特异性抗体在制备时还存在着血清中含有与抗体不相关的成份，去除不彻底，在注射抗原时，无法延缓抗原的释放，不能活化巨噬细胞，释放细胞因子，以及淋巴细胞的应答能力差。因此提供以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用解决上述问题。
本发明所采用的技术方案是：
以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用包括以CD4为靶点的特异性抗体和CAR-T细胞的制备和应用；所述以CD4为靶点的特异性抗体包括下列步骤：
步骤1：鲜血采集，采用动脉采血法；
步骤2：抗原制备，将步骤一中采集的鲜血经无菌NS洗涤三次，去压积红细胞并配置成2-5％；
步骤3：佐剂制备佐剂制备，配料采用Ag+NS，将Ag+NS放入试管内缓慢搅拌，然后滴入10％的硫酸铝钾溶液，以NaOH校正PH至6.5，然后在离心机内进行离心，最后通过NS进行洗涤；
步骤4：血清制备，将鲜血置于常温室内，自然凝固，将血清提取出后，在56°的加热器皿内加热30min；用40％、35％、33％的硫酸铵盐析三次(或20％的硫酸钠)粗提y-球蛋白，此时y-球蛋白内会含有5％的其它蛋白，经离子层析、亲和层析纯化Ig或酶解法制备Fab或Fc片段；
步骤5：注射，抗原和佐剂可同时注射，或者佐剂先于抗原注射，抗原和血清采用皮下多点注射，一般注射点数为8-10点；佐剂的注射采用肌肉注射；首次和二次免疫注射时间要间隔20天，二次以后，每次注射间隔7-10天。
所述CAR-T细胞的制备和应用包括下列步骤：步骤一：白细胞分离及培养；步骤二：T细胞活化；步骤三：转染；步骤四：扩增；步骤五：回输。
所述步骤一：白细胞分离及培养，包括以下流程：(1)用PBS缓冲液按1：1稀释外周血，混匀；(2)稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中，具体操作方法：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，不要冲破液面；(3)配平离心1200g，离心20min；(4)离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层，吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之，小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1：3，混匀；(5)离心600g(1600r/min)5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数；(6)离心300g(1200r/min)5min，上清液进行无菌检测；(7)细胞培养：恒温37℃，CO2浓度5％，相对饱和湿度95％，细胞培养基PH值7.2-7.4，根据细胞计数调密度2×106/ml加入培养瓶中，混匀放入C02培养箱培养2小时。
所述步骤二：T细胞活化，取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数根据细胞计数调整细胞浓度1.2×106/ml接种培养瓶中，加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1：3，加入IL-2 100U/ml，混匀放入C02培养箱培养。
所述步骤三：转染，细胞培养1天，调整细胞密度至0.6×106/ml，加入病毒(MOI为1-5)混匀放入C02培养箱培养，培养3天时，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6×106/ml继续培养。
所述步骤四：扩增，细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6×106/ml继续培养；定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养；根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，并检查无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等各项指标。
所述步骤五：回输，取出300g细胞悬液，转入离心管中，(剩余细胞补加培养基继续培养)离心5min，除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min，离心完成后取上清做无菌检测，用20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，并加5％注射用人血白蛋白，采用静脉回输的方式输回患者的体内。
有益效果
1、本发明中血清用40％、35％、33％的硫酸铵盐析三次(或20％的硫酸钠)粗提y-球蛋白，此时y-球蛋白内会含有5％的其它蛋白，经离子层析、亲和层析纯化Ig或酶解法制备Fab或Fc片段；离子层析采用QAE-Sephadex纤维素，能够吸附血清中多种蛋白质，亲和层析将抗原交联到Sepharose4B，利用生物学分子间所具有的专一亲和性进行层析，能够去除血清中含有与抗体不相关的成份；
2、本发明中佐剂配料采用Ag+NS，将Ag+NS放入试管内缓慢搅拌，然后滴入10％的硫酸铝钾溶液，以NaOH校正PH至6.5，然后在离心机内进行离心，最后通过NS进行洗涤；佐剂与抗原同时或者预先注射于机体，能增强机体免疫应答，同时也能改变机体免疫类型的物质；改变抗原的物理性状，延缓抗原的释放，增强巨噬细胞抗原处理，活化巨噬细胞，释放细胞因子，增强淋巴细胞的应答能力。
具体实施方式
下面将结合实例对本发明做进一步的说明：
以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用包括以CD4为靶点的特异性抗体和CAR-T细胞的制备和应用；所述以CD4为靶点的特异性抗体包括下列步骤：
步骤1：鲜血采集，采用动脉采血法；
步骤2：抗原制备，将步骤一中采集的鲜血经无菌NS洗涤三次，去压积红细胞并配置成2-5％；
步骤3：佐剂制备佐剂制备，配料采用Ag+NS，将Ag+NS放入试管内缓慢搅拌，然后滴入10％的硫酸铝钾溶液，以NaOH校正PH至6.5，然后在离心机内进行离心，最后通过NS进行洗涤；
步骤4：血清制备，将鲜血置于常温室内，自然凝固，将血清提取出后，在56°的加热器皿内加热30min；用40％、35％、33％的硫酸铵盐析三次(或20％的硫酸钠)粗提y-球蛋白，此时y-球蛋白内会含有5％的其它蛋白，经离子层析、亲和层析纯化Ig或酶解法制备Fab或Fc片段；
步骤5：注射，抗原和佐剂可同时注射，或者佐剂先于抗原注射，抗原和血清采用皮下多点注射，一般注射点数为8-10点；佐剂的注射采用肌肉注射；首次和二次免疫注射时间要间隔20天，二次以后，每次注射间隔7-10天。
所述CAR-T细胞的制备和应用包括下列步骤：步骤一：白细胞分离及培养；步骤二：T细胞活化；步骤三：转染；步骤四：扩增；步骤五：回输。
所述步骤一：白细胞分离及培养，包括以下流程：(1)用PBS缓冲液按1：1稀释外周血，混匀；(2)稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中，具体操作方法：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，不要冲破液面；(3)配平离心1200g，离心20min；(4)离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层，吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之，小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1：3，混匀；(5)离心600g(1600r/min)5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数；(6)离心300g(1200r/min)5min，上清液进行无菌检测；(7)细胞培养：恒温37℃，CO2浓度5％，相对饱和湿度95％，细胞培养基PH值7.2-7.4，根据细胞计数调密度2×106/ml加入培养瓶中，混匀放入C02培养箱培养2小时。
所述步骤二：T细胞活化，取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数根据细胞计数调整细胞浓度1.2×106/ml接种培养瓶中，加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1：3，加入IL-2 100U/ml，混匀放入C02培养箱培养。
所述步骤三：转染，细胞培养1天，调整细胞密度至0.6×106/ml，加入病毒(MOI为1-5)混匀放入C02培养箱培养，培养3天时，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6×106/ml继续培养。
所述步骤四：扩增，细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6×106/ml继续培养；定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养；根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，并检查无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等各项指标。
所述步骤五：回输，取出300g细胞悬液，转入离心管中，(剩余细胞补加培养基继续培养)离心5min，除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min，离心完成后取上清做无菌检测，用20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，并加5％注射用人血白蛋白，采用静脉回输的方式输回患者的体内。
优选的，所述步骤3：佐剂制备，配料采用Ag+NS，将Ag+NS放入试管内缓慢搅拌，然后滴入10％的硫酸铝钾溶液，以NaOH校正PH至6.5，然后在离心机内进行离心，最后通过NS进行洗涤；佐剂与抗原同时或者预先注射于机体，能增强机体免疫应答，同时也能改变机体免疫类型的物质；改变抗原的物理性状，延缓抗原的释放，增强巨噬细胞抗原处理，活化巨噬细胞，释放细胞因子，增强淋巴细胞的应答能力。
优选的，所述步骤4：血清制备，将鲜血置于常温室内，自然凝固，将血清提取出后，在56°的加热器皿内加热30min；用40％、35％、33％的硫酸铵盐析三次(或20％的硫酸钠)粗提y-球蛋白，此时y-球蛋白内会含有5％的其它蛋白，经离子层析、亲和层析纯化Ig或酶解法制备Fab或Fc片段；离子层析采用QAE-Sephadex纤维素，能够吸附血清中多种蛋白质，亲和层析将抗原交联到Sepharose4B，利用生物学分子间所具有的专一亲和性进行层析，能够去除血清中含有与抗体不相关的成份。
优选的，所述步骤5：注射，抗原和佐剂可同时注射，或者佐剂先于抗原注射，抗原和血清采用皮下多点注射，一般注射点数为8-10点；佐剂的注射采用肌肉注射，有效的避免了皮下注射引起的肉芽肿和脓肿的现象。
优选的，所述步骤5：注射，首次和二次免疫注射时间要间隔20天，二次以后，每次注射间隔7-10天，第一次免疫后，机体处于识别阶段，如果短时间内就注射二次抗原，极易造成免疫耐受，若间隔时间过长，则刺激变弱，造成抗体效价不高。
优选的，本发明中血清用40％、35％、33％的硫酸铵盐析三次(或20％的硫酸钠)粗提y-球蛋白，此时y-球蛋白内会含有5％的其它蛋白，经离子层析、亲和层析纯化Ig或酶解法制备Fab或Fc片段；离子层析采用QAE-Sephadex纤维素，能够吸附血清中多种蛋白质，亲和层析将抗原交联到Sepharose4B，利用生物学分子间所具有的专一亲和性进行层析，能够去除血清中含有与抗体不相关的成份；
优选的，本发明中佐剂配料采用Ag+NS，将Ag+NS放入试管内缓慢搅拌，然后滴入10％的硫酸铝钾溶液，以NaOH校正PH至6.5，然后在离心机内进行离心，最后通过NS进行洗涤；佐剂与抗原同时或者预先注射于机体，能增强机体免疫应答，同时也能改变机体免疫类型的物质；改变抗原的物理性状，延缓抗原的释放，增强巨噬细胞抗原处理，活化巨噬细胞，释放细胞因子，增强淋巴细胞的应答能力。
利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，设计出类似的技术方案，而达到上述技术效果的，均是落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用，其特征在于：所述以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用包括以CD4为靶点的特异性抗体和CAR-T细胞的制备和应用；所述以CD4为靶点的特异性抗体包括下列步骤：
步骤1：鲜血采集，采用动脉采血法；
步骤2：抗原制备，将步骤一中采集的鲜血经无菌NS洗涤三次，去压积红细胞并配置成2-5％；
步骤3：佐剂制备佐剂制备，配料采用Ag+NS，将Ag+NS放入试管内缓慢搅拌，然后滴入10％的硫酸铝钾溶液，以NaOH校正PH至6.5，然后在离心机内进行离心，最后通过NS进行洗涤；
步骤4：血清制备，将鲜血置于常温室内，自然凝固，将血清提取出后，在56°的加热器皿内加热30min；用40％、35％、33％的硫酸铵盐析三次(或20％的硫酸钠)粗提y-球蛋白，此时y-球蛋白内会含有5％的其它蛋白，经离子层析、亲和层析纯化Ig或酶解法制备Fab或Fc片段；
步骤5：注射，抗原和佐剂可同时注射，或者佐剂先于抗原注射，抗原和血清采用皮下多点注射，一般注射点数为8-10点；佐剂的注射采用肌肉注射；首次和二次免疫注射时间要间隔20天，二次以后，每次注射间隔7-10天。
2.如权利要求1所述以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用，其特征在于：所述CAR-T细胞的制备和应用包括下列步骤：步骤一：白细胞分离及培养；步骤二：T细胞活化；步骤三：转染；步骤四：扩增；步骤五：回输。
3.如权利要求2所述的CAR-T细胞的制备和应用，其特征在于：所述步骤一：白细胞分离及培养，包括以下流程：(1)用PBS缓冲液按1：1稀释外周血，混匀；(2)稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中，具体操作方法：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，不要冲破液面；(3)配平离心1200g，离心20min；(4)离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层，吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之，小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1：3，混匀；(5)离心600g(1600r/min)5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数；(6)离心300g(1200r/min)5min，上清液进行无菌检测；(7)细胞培养：恒温37℃，CO2浓度5％，相对饱和湿度95％，细胞培养基PH值7.2-7.4，根据细胞计数调密度2×106/ml加入培养瓶中，混匀放入C02培养箱培养2小时。
4.如权利要求2所述的CAR-T细胞的制备和应用，其特征在于：所述步骤二：T细胞活化，取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数根据细胞计数调整细胞浓度1.2×106/ml接种培养瓶中，加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1：3，加入IL-2100U/ml，混匀放入C02培养箱培养。
5.如权利要求2所述的CAR-T细胞的制备和应用，其特征在于：所述步骤三：转染，细胞培养1天，调整细胞密度至0.6×106/ml，加入病毒(MOI为1-5)混匀放入C02培养箱培养，培养3天时，细胞计数补加培养基，IL-2100U/ml细胞密度调整至0.6×106/ml继续培养。
6.如权利要求2所述的CAR-T细胞的制备和应用，其特征在于：所述步骤四：扩增，细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2100U/ml细胞密度调整至0.6×106/ml继续培养；定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养；根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，并检查无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等各项指标。
7.如权利要求2所述的CAR-T细胞的制备和应用，其特征在于：所述步骤五：回输，取出300g细胞悬液，转入离心管中，(剩余细胞补加培养基继续培养)离心5min，除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min，离心完成后取上清做无菌检测，用20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，并加5％注射用人血白蛋白，采用静脉回输的方式输回患者的体内。
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