CN110616194A - 一株乌头碱单克隆抗体细胞株sj及其应用 - Google Patents

一株乌头碱单克隆抗体细胞株sj及其应用 Download PDF

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Abstract

一株乌头碱单克隆抗体细胞株SJ及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明制备所得的乌头碱单克隆抗体细胞株SJ，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17400。其由乌头碱通过琥珀酸酐衍生得到具有羧基的产物，用碳二亚胺法将sACO与载体蛋白偶联，得到乌头碱的完全抗原，并将该抗原免疫小鼠，通过将小鼠的脾脏与瘤细胞进行融合，得到了一株高特异性的、高灵敏的单克隆抗体细胞株SJ。本发明提供的乌头碱单克隆抗体杂交瘤细胞株SJ分泌的单克隆抗体，对乌头碱具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为5ng/mL），为检测婴幼儿食品、乳品和其他含有乌头碱的食品中乌头碱含量提供了免疫学方法。

Description

一株乌头碱单克隆抗体细胞株SJ及其应用
技术领域
本发明涉及一株乌头碱单克隆抗体细胞株SJ及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。
背景技术
乌头碱是一种中药材的成分，主要存在于川乌、草乌、附子等中草药中，一方面，这些药材常用于治疗外感风寒湿邪所致的各种疼痛，如头痛、关节痛、胸腹疼痛等。在中国，川乌、草乌、附子等也常用于药酒的泡制；另一方面，乌头碱也具有毒性，它可以引起迷走神经兴奋，损伤周围神经***，严重可以引起死亡。因此，有必要对中药材中乌头碱进行检测。
目前，已有对乌头碱检测的相关报道，主要是仪器方法的检测，超高效液相色谱-串联质谱法、紫外-可见分光光度法、电喷雾离子迁移谱法等，然而这些方法需要大型仪器，而这些仪器极其昂贵，且耗时，本发明通过对乌头碱衍生，将衍生物与蛋白偶联免疫小鼠，得到了一株灵敏度高、特异性高的单克隆抗体，并基于该单克隆抗体建立了一种快速，灵敏的检测乌头碱的方法。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株乌头碱单克隆抗体细胞株SJ及其应用，由该细胞株制备的抗体对乌头碱具有较好的特异性和检测灵敏度，可以用来建立乌头碱的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株乌头碱单克隆抗体细胞株SJ，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17400。
乌头碱单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCC No. 17400的乌头碱单克隆抗体细胞株SJ分泌产生。
所述乌头碱单克隆抗体的应用，建立乌头碱免疫分析检测的方法，应用于食品中乌头碱的检测。
一种乌头碱人工抗原的合成方法，其由乌头碱通过琥珀酸酐衍生得到具有羧基的产物，即半抗原sACO，用碳二亚胺法将sACO与载体蛋白偶联，得到乌头碱的完全抗原，并将该抗原免疫小鼠，通过将小鼠的脾脏与瘤细胞进行融合，得到了一株高特异性的、高灵敏的单克隆抗体细胞株SJ。
（1）半抗原sACO的合成，合成路线如下：
称取乌头碱25mg，加入吡啶2mL溶解，充分溶解后加入丁二酸酐89mg和DMAP 180mg，并于60℃水浴锅内搅拌反应12h，然后加入冰水终止反应，于通风橱内氮气吹干，用三氯甲烷对化合物进行萃取，反复萃取三次之后氮气吹干，得到乌头碱衍生物sACO，将此化合物通过质谱鉴定。
（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原sACO，与KLH偶联得到偶联物完全抗原sACO-EDC-KLH；或与OVA偶联得到偶联物完全抗原sACO-EDC-OVA；
制备方法如下：称取sACO 2.15mg，加入500μL DMF溶解，充分溶解后加入EDC 1.92mg和NHS 1.15mg，并于30℃搅拌6h，作为A液。取5mg的KLH，加入3mL CB溶解，作为B液。将A液滴加入B液中，偶联12h，混合液用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原sACO-EDC-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
（3）小鼠免疫：将乌头碱完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫采用乌头碱的完全抗原与完全弗氏佐剂混合，剂量为100μg/只；多次加强免疫采用乌头碱的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合，剂量为50μg/只；最后一次用乌头碱完全抗原与生理盐水混合冲刺免疫。采用腹腔注射，剂量为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。
（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前 7-10 天，将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到（1-4）*107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mLRPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。37℃温浴5min后离心（800rpm，10 min），弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20%胎牛血清，2% 50×HAT的RPMI-1640选择性培养基（HAT培养基），按照200μL/孔加到 96 孔细胞板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液（HT培养基）进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用乌头碱为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对乌头碱标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得乌头碱单克隆抗体细胞株SJ。
本发明的有益效果：本发明提供的乌头碱单克隆抗体杂交瘤细胞株SJ分泌的单克隆抗体，对乌头碱具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为5ng/mL），为检测婴幼儿食品、乳品和其他含有乌头碱的食品中乌头碱含量提供了免疫学方法。本发明提供的乌头碱单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测乌头碱的试剂盒，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株乌头碱单克隆抗体细胞株SJ，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，筒称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCCNo.17400。
附图说明
图1是乌头碱单克隆抗体对乌头碱的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
其由乌头碱通过琥珀酸酐衍生得到具有羧基的产物，即半抗原sACO，用碳二亚胺法将sACO与载体蛋白偶联，得到乌头碱的完全抗原，并将该抗原免疫小鼠，通过将小鼠的脾脏与瘤细胞进行融合，得到了一株高特异性的、高灵敏的单克隆抗体细胞株SJ。
（1）半抗原sACO的合成：称取乌头碱25mg，加入吡啶2mL溶解，充分溶解后加入丁二酸酐89mg和DMAP 180mg，并于60℃水浴锅内搅拌反应12h，然后加入冰水终止反应，于通风橱内氮气吹干，用三氯甲烷对化合物进行萃取，反复萃取三次之后氮气吹干，得到乌头碱衍生物sACO，将化合物通过质谱鉴定。
（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原sACO，与KLH偶联得到偶联物完全抗原sACO-EDC-KLH；或与OVA偶联得到偶联物完全抗原sACO-EDC-OVA；
制备方法如下：称取sACO 2.15mg，加入500μL DMF溶解，充分溶解后加入EDC 1.92mg和NHS 1.15mg，并于30℃搅拌6h，作为A液。取5mg的KLH，加入3mL CB溶解，作为B液。将A液滴加入B液中，偶联12h，混合液用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原sACO-EDC-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
（3）小鼠免疫：将乌头碱完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫采用乌头碱的完全抗原与完全弗氏佐剂混合，剂量为100μg/只；多次加强免疫采用乌头碱的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合，剂量为50μg/只；最后一次用乌头碱完全抗原与生理盐水混合冲刺免疫。采用腹腔注射，剂量为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。
（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前 7-10 天，将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到（1-4）*107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mLRPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。37℃温浴5min后离心（800rpm，10 min），弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20%胎牛血清，2% 50×HAT的RPMI-1640选择性培养基（HAT培养基），按照200μL/孔加到 96 孔细胞板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液（HT培养基）进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用乌头碱为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对乌头碱标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得乌头碱单克隆抗体细胞株SJ。
（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106乌头碱杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
具体步骤如下：
6.1包被：将包被原sACO-EDC-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
6.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
6.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
6.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。
用ic-ELISA测定乌头碱的IC50为：5ng/mL，说明对乌头碱有很好的灵敏度，可用于乌头碱免疫分析检测。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4•12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4•12 H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mgTMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液体积比按5：1混合即为TMB显色液，现用现混。

Claims (4)

1.一株乌头碱单克隆抗体细胞株SJ，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17400。
2.乌头碱单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No. 17400的乌头碱单克隆抗体细胞株SJ分泌产生。
3.权利要求2所述乌头碱单克隆抗体的应用，其特征在于：建立乌头碱免疫分析检测的方法，应用于食品中乌头碱的检测。
4.用于制备权利要求1所述乌头碱单克隆抗体细胞株SJ的免疫原sACO-EDC-KLH的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）半抗原sACO的制备：称取乌头碱25mg，加入吡啶2mL溶解，充分溶解后加入丁二酸酐89mg和DMAP 180mg，并于60℃水浴锅内搅拌反应12h，然后加入冰水终止反应，于通风橱内氮气吹干，用三氯甲烷对化合物进行萃取，反复萃取三次之后氮气吹干，得到乌头碱衍生物sACO，将此化合物通过质谱鉴定；
（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原sACO，与KLH偶联得到偶联物完全抗原sACO-EDC-KLH；或与OVA偶联得到偶联物完全抗原sACO-EDC-OVA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
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