CN110964818A

CN110964818A - 一种人类braf基因v600e突变的检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN110964818A
Application number: CN201911187477.4A
Authority: CN
Inventors: 罗锋; 韩勋领; 孙松松
Original assignee: Chongqing Puluotong Gene Medicine Research Institute Co Ltd
Current assignee: Chongqing Puluotong Gene Medicine Research Institute Co Ltd
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-04-07

Abstract

本发明提供了一种人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，包括用于检测BRAF基因V600E突变的引物和探针、抑制剂、内控引物及探针、外控引物及探针，其特征在于：检测引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，检测探针为SEQ ID NO.3；抑制剂为SEQ ID NO.4；内控引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，内控荧光探针为SEQ ID NO.7；外控引物为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，外控荧光探针为SEQ ID NO.10。本发明利用患者外周血，高效、无创的检测ctDNA中BRAF基因的突变，检测灵敏度高、周期短、成本低、判读简单，具有巨大的临床推广应用价值。

Description

一种人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及针对肿瘤患者外周血循环肿瘤DNA(ctDNA)中BRAF基因V600E突变的试剂盒和检测方法。

背景技术

BRAF是一种鸟苷酸结合蛋白RAS活化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在调节有丝***原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中发挥重要作用，是最重要的原癌基因之一。MAPK信号通路可正常调节细胞生长、***和分化,也可因RAF家族成员致癌性突变体的形成而引发癌症。BRAF绝大部分突变发生在转移性黑色素瘤、结肠癌、肺癌和甲状腺癌中。其中BRAF(V600E)突变体的产生显著增强了BRAF的活性,从而导致癌细胞***失控,大约8％的人类肿瘤发生BRAF突变。该突变导致下游MEK-ERK信号通路持续激活，对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要。2011年，首个BRAF(V600E)靶向抑制剂维罗非尼被FDA批准上市，用于治疗BRAF(V600E)突变的晚期黑色素瘤患者，有效延长了患者无进展生存期及总生存期，取得了突破性的治疗效果。根据世界卫生组织(WHO)数据，结直肠癌(CRC)位列男性常见恶性肿瘤的第三位和女性常见恶性肿瘤的第二位，大约5-15％的结直肠癌会发生BRAF位点特异性突变，其中超过90％为BRAF(V600E)突变。BRAF(V600E)突变可以排除林奇综合征(LS)，指示为散发型结直肠癌(SCRC),用于结直肠癌的鉴别诊断。此外，BRAF(V600E)还可帮助临床医生进行结直肠癌的预后管理和指导治疗。目前有资料提示，BRAF(V600E)突变患者抗EGFR单抗治疗应答率明显低于BRAF野生型患者。BRAF(V600E)突变发生在40％-70％的***转甲状腺癌(PTC)中，而在滤泡状甲状腺癌(FTC)、甲状腺髓样癌(MTC)、嗜酸性细胞腺癌、腺瘤和良性甲状腺增生中极少发现，因此BRAF(V600E)可作为PTC临床鉴别诊断指标。美国甲状腺协会(ATA)管理指南建议，有甲状腺结节的患者在细胞学活检不确定时，建议使用分子标志物(如BRAF、RAS、RET/PTC等)进行辅助诊断。BRAF(V600E)突变与PTC的侵袭性及不良预后有关，可为PTC治疗提供参考。术前检查PTC的BRAF(V600E)基因突变可辅助预测术后复发风险、指导手术切除范围及术后后继治疗。

《NCCN结直肠癌临床实践指南》(2019版)中要求在使用西妥昔单抗(Erbitux/Cetuximab)或帕尼单抗(Vectibix/Panitumumab)抗EGFR的一线治疗靶向药物时，应检测BRAF基因突变情况，如发生V600E突变，使用靶向药物的疗效较差或可能无效。《NCCN甲状腺癌临床实践指南2018版》中，明确提出对细针穿刺活检结果出现不能判断的应对BRAF基因突变状态进行检测，有助于病理分型诊断和临床预后预测及制定个体化治疗方案。BRAF(V600E)检测对于指导靶向药物的使用有重要意义。

目前，针对BRAF基因突变检测的方法很多，如直接测序法、焦磷酸测序法、高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)、高效液相色谱法和荧光定量PCR法等。BRAF(V600E)基因分型检测的“金标准”是PCR-直接测序法，该法费用较低，但操作耗时长，并且它有两个明显的缺点：一是灵敏度低，一般需要突变基因丰度达到10-20％以上才能准确检测；二是由于后续需要对PCR产物进行处理，容易出现污染导致结果不准确。基于二代测序可以用于基因突变位点的检测，并且检测丰度可以达到1％，但是由于周期长，成本高，目前没有被广泛采用。突变扩增PCR***(amplification refractorymutation system,ARMS)是一种用来检测已知突变的方法，其基本原理是：如果引物3’末端碱基不与模板完全匹配，引物延伸就会受阻；根据已知点突变设计引物，引物3’端碱基与突变型模板碱基互补，PCR只扩增突变型模板，从而达到检测点突变的目的。该方法操作简单，检测周期短，实验成本低，因此被广泛采用。然而现在市面上针对BRAF(V600E)突变检测的Arms-PCR产品灵敏度约为5％，最高检测灵敏度可以达到1％，且不能完全抑制野生型样本的扩增，结果判读需计算ΔCt值，较复杂，不能满足临床要求。

以上检测技术方法采用的样本主要是新鲜肿瘤组织、石蜡包埋切片等，需要通过手术取样或者穿刺取样，给病人带来很大的痛苦。随着液体活检技术的发展,ctDNA(循环肿瘤DNA)逐渐被用于基因检测及临床辅助治疗、预后监控等。ctDNA是进入血液循环***中的来自肿瘤基因组的DNA片段，携带了突变、***、缺失、重排、拷贝数异常和/或甲基化等基因信息。ctDNA的获取无须有创肿瘤手术，而是从常规抽血中分析来自肿瘤的DNA，这一能力代表了潜在转化性临床应用的一个关键进展。特别是ctDNA分析属于无创，为活检困难或不安全的肿瘤提供了一种分子谱分析方法，并提供了一种能够随时间推移连续监测肿瘤DNA的实用方法，而没有标准肿瘤活检的风险和潜在并发症。此外，与单个肿瘤病变的针吸活检相比，ctDNA分析可以更好地检测患者肿瘤中多个不同克隆群所具有的分子异质性，为无明显临床疾病的患者提供了肿瘤检测或监测的可能性。目前，市场上针对ctDNA进行检测主要依赖于高通量测序及数字PCR，但是由于仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期较长的缺点还没有被大面积推广使用。市场还没有专门针对利用ctDNA进行基因突变检测快速、灵敏的方法。

若能在无明显临床表现或癌症早期检测出癌基因，快速准确灵敏地检测这些与药物反应性有关的基因突变，早发现早治疗，可以大大提高癌症患者的存活率。ctDNA含量很少，且呈现碎片化，现有技术难以从大量正常DNA背景下检测到微量的、碎片化的ctDNA。CN109295176A公开了用于检测人类结直肠癌BRAF基因V600E突变的引物、检测方法及试剂盒，并提及基于荧光定量平台检测灵敏度可以达到0.001％。但是，基于荧光定量PCR检测原理和该检测技术的局限性，超过了技术的检测下限，从理论和实践中都未能达成该效果。而且，该法并未提及ctDNA，也并未提供采用血液作为样品的检测效果的实验依据。

发明内容

本发明的目的在于解决无明显临床表现或癌症早期的BRAF基因V600E突变癌症患者外周血中ctDNA难以检测的问题。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，包括用于检测BRAF基因V600E突变的引物和探针、抑制剂、内控引物及探针、外控引物及探针，其特征在于：

用于检测BRAF基因V600E突变的引物和探针序列如下：

上游引物：GTAAAAATAGGTGCTTTTGGTATAGCTGCCGA(SEQ ID NO.1)

下游引物：CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGG(SEQ ID NO.2)

荧光探针：FAM-AATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAAC-TARMA(SEQ ID NO.3)；

抑制剂为片段GGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTA(SEQ ID NO.4)；

内控引物及探针序列如下所示：

上游引物：CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGACCC(SEQ ID NO.5)

下游引物：AGAGTCCTACGGAAAACGGCAGAAGAGAG(SEQ ID NO.6)

荧光探针：VIC-CGCTACCTCTTCTGGTGGCCGCCTC-TARMA(SEQ ID NO.7)

外控引物及探针序列如下所示：

正向引物：TATTCTTAAATAAATATGAACCCTTAA(SEQ ID NO.8)

反向引物：AAATATGAAACACTGTTTATAAGACAT(SEQ ID NO.9)

荧光探针：FAM-ATATTTTGAAACCAGTTTCAGTGTATTTCAAAC-TARMA(SEQ ID NO.10)。

上述内控引物及探针根据人类ACTB基因保守序列设计，外控引物及探针根据人类BRAF基因保守序列设计。

上述检测BRAF基因V600E突变的探针、内控荧光探针及外控荧光探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1,更优选的方案为检测BRAF基因V600E突变的探针和外控荧光探针5’端荧光基团为FAM，检测BRAF基因V600E突变的探针和外控荧光探针3’端荧光淬灭基团为TAMRA；内控荧光探针5’端荧光基团为VIC，内控荧光探针3’端荧光淬灭基团为TAMRA。

上述抑制剂用于特异性封闭BRAF基因野生型模板扩增，3’端采用特殊修饰，优选方式为C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性封闭BRAF基因野生型模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。

上述试剂盒除了包含以上描述的引物和探针，还包括PCR反应液，阳性质控和阴性质控。PCR反应液包含了PCR反应所需要的热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP等物质。

本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的使用方法、检测方法。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

上述检测试剂盒的使用方法，包括实时荧光定量PCR和突变扩增PCR***(Arms-PCR)联合的PCR扩增。

上述试剂盒的优选的PCR扩增条件为：

预变性的条件为：95℃，2分钟；

PCR反应由两个阶段构成：

第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，20秒；延伸：72℃，20秒；

第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，20秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，20秒。

本发明还提供了该试剂盒结果的判读方法：在上述PCR反应体系和循环程序条件下，观察BRAF基因V600E突变的荧光检测信号是否形成对数扩增“S”型曲线；如果形成对数扩增“S”型曲线，该待检测样本含有V600E突变。

有益效果

1、本发明利用患者外周血，高效、无创的检测ctDNA中BRAF基因的突变，能够减少因取样给病人带来的痛苦，特别适合无法手术、不适合手术或者取样困难的患者。

2、本发明检测灵敏度高：采用特殊设计的引物、探针和针对野生型模板的抑制剂，其PCR检测特异性非常高，能够特异性识别BRAF(V600E)突变，基于荧光定量PCR检测，可以识别1ng模板条件下0.1％的突变，检测灵敏度高。

3、本发明反应周期短：采用热启动taq酶预混体系，常温下体系稳定，包含引物、探针、反应缓冲液、热启动taq酶等预先混入一个反应管，一次性加样，一次性闭管检测，无需产物后处理，不需要测序结果验证，60分钟即可完成检测，显著缩短检测时间，提高了检测效率。

4、本发明检测成本低：基于荧光定量平台，采用Arms-PCR和taqman探针技术，检测引物和探针价格低廉，在实验过程中节省了实验消耗和人力成本，单次检测成本和一次PCR反应相当。相比于测序和其他方法，大大节约检测成本。

5、本发明检测结果判读简单准确：本试剂盒精心设置了内控基因和外控基因的双质控检测体系，可以分析待检DNA能否被正常扩增，排除可能造成PCR失败的原因，保证实验的可靠性和可追溯性。本发明包含特异性抑制剂，在达到0.1％高灵敏度的前提下，无非特异性扩增，仍可保证高特异性，客观判读结果，不需人工计算△CT值，结果判读简单明确，能满足临床要求。

6、本发明针对现有技术检测BRAF基因突变时，采用有创的肿瘤样本检测，给病人带来极大痛苦，同时检测灵敏度低、周期长、成本高、数据分析过程繁琐等不足之处进行改进，提供了一种基于实时荧光定量PCR和Arms-PCR技术平台，以肿瘤患者外周血中ctDNA作为样本进行BRAF基因突变检测的引物、探针、特异抑制剂等试剂盒和方法。本发明具有无创、检测灵敏度高、周期短、成本低、判读简单等特点，具有高效、快速、准确的通过外周血中ctDNA中检测基因突变的特点，具有巨大的临床推广应用价值。

附图说明

图1：阴性对照反应信号；阴性对照的外控由FAM信号指示，阴性对照中V600E突变信号由FAM指示，阴性对照中内控信号由VIC指示。

图2：阳性对照反应信号；阳性对照的外控由FAM信号指示，阳性对照中V600E突变信号由FAM指示，阳性对照中内控信号由VIC指示。

图3：突变体检测反应信号；反应体系中内控信号由VIC指示，反应体系中V600E突变信号由FAM指示。

图4：野生型抑制剂对反应体系的影响；反应体系中内控信号由VIC指示，反应体系中V600E突变信号由FAM指示。

图5：灵敏度检测信号；反应体系中V600E突变信号由FAM指示，每个体系中加入模板总量为10ng。

图6：1-10号外周血样品ctDNA检测结果

图7：1-10号样本穿刺组织一代测序结果

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1

1、用于检测人类血液样本中BRAF基因V600E突变的试剂盒包含的引物、探针及抑制剂的制备

根据NCBI数据库公布的BRAF基因(Gene ID:673)野生型序列，以BRAF基因V600E突变位点(rs113488022)为参考，设计特异性arms-PCR引物和探针。以基因工程构建的突变质粒和野生型质粒为模板，建立了实时荧光PCR检测体系，实现对BRAF基因V600E突变的高灵敏度和高特异性检测。

用于检测BRAF基因V600E突变的引物和探针，其特征在于所述检测引物及探针根据BRAF基因V600E突变位点设计，序列如下：

上游引物：GTAAAAATAGGTGCTTTTGGTATAGCTGCCGA

下游引物：CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGG

荧光探针：FAM-AATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAAC-TARMA

其中，突变上游引物，其长度为32个碱基，其中3’末端的第1位碱基为突变位点，与BRAF基因V600E突变位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列。为了增加引物特异性，使得引物与突变模板特异性结合，本发明方案经过大量优化实验，除了在引物的3’末端的第1位碱基设计和突变位点一致，还在突变引物的3’末端的第3、5、11和19位碱基引入特异碱基突变；下游引物，其长度均为28个碱基，与BRAF基因保守序列结合。

上述检测BRAF基因V600E突变的探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1,更优选的方案为检测BRAF基因V600E突变的探针5‘端荧光基团为FAM，检测BRAF基因V600E突变的探针3‘端荧光淬灭基团为TAMRA。

为了进一步区分野生型序列与突变型序列，本发明添加了野生型模板抑制剂，包括匹配BRAF野生型基因的核酸序列及化学修饰基团。用于特异性封闭BRAF基因野生型模板扩增的抑制剂，其特征在于根据BRAF基因V600E突变位点设计，3’端采用ddC修饰，序列如下所示：

GGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTA。

上述的用于特异性封闭BRAF基因野生型模板扩增的抑制剂，3’端采用特殊修饰，优选方式为C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性封闭BRAF基因野生型模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。上述抑制剂能与BRAF基因V600E突变位点野生型序列特异性结合，抑制野生型基因非特异扩增。

为了检测反应体系的有效性，本发明在反应体系中加入了用于检测BRAF基因V600E突变的内控引物及探针。本发明优选了人类ACTB基因的一段保守序列。根据NCBI数据库公布的ACTB基因(Gene ID:60)序列，设计特异性arms-PCR引物和探针。其特征在于所述内控引物及探针序列如下所示：

上游引物：CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGACCC

下游引物：AGAGTCCTACGGAAAACGGCAGAAGAGAG

荧光探针：VIC-CGCTACCTCTTCTGGTGGCCGCCTC-TARMA

上述检测BRAF基因内控ACTB的探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1,更优选的方案为检测BRAF基因内控ACTB荧光探针5’端荧光基团为VIC，3’端荧光淬灭基团为TAMRA。

为了监控待测样品模板质量，本发明引入了用于检测BRAF基因V600E突变的外控引物及探针。本发明中，外控序列采用人类BRAF基因中比较保守的，不包含V600E区段的一段序列。根据NCBI数据库公布的BRAF基因(Gene ID:673)野生型序列，设计特异性arms-PCR引物和探针。其特征在于所述外控引物及探针序列如下所示：

上游引物：TATTCTTAAATAAATATGAACCCTTAA

下游引物：AAATATGAAACACTGTTTATAAGACAT

荧光探针：FAM-ATATTTTGAAACCAGTTTCAGTGTATTTCAAAC-TARMA

上述检测BRAF基因V600E突变的外控荧光探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1,更优选的方案为检测BRAF基因V600E突变的外控荧光探针5’端荧光基团为FAM，检测BRAF基因V600E突变的外控荧光探针3’端荧光淬灭基团为TAMRA。

为了增加检测结果的对照性，本发明方法引入了阳性质控和阴性质控。

本发明中的阳性质控根据NCBI数据库公布的BRAF基因(Gene ID:673)野生型序列，以BRAF基因V600E突变位点(rs113488022)为参考，设计序列引入V600E突变位点，以基因工程构建的方法进行突变质粒构建。以基因工程构建的含有V600E突变位点突变质粒为模板，建立了实时荧光PCR检测体系，实现对BRAF基因V600E突变的阳性对照检测。所述阳性质控序列如SEQ ID NO.11所示，其中，第329位是突变位点碱基。

通过绝对定量的方法，将含有V600E突变的阳性质粒(M)溶解在没有V600E突变的野生型(WT)人类外周血提取的ctDNA水溶液中，混合成M:WT为1:99的1ng/μl阳性对照品备用(即：突变率为1％的模板)。本发明中的阴性对照为灭菌的去离子水。

2、待测样品核酸提取

本发明中选用的样本可以是血液、肿瘤组织、胸腹水等其他含有基因组DNA的待测样本,尤其是可以针对外周血中提取的循环肿瘤DNA(ctDNA)进行检测。本发明推荐样本DNA的提取采用商业化成熟的核酸提取试剂盒。本发明中采用美基生物核酸提取试剂盒HiPureCirculating DNA Midi Spin Kit S(D3182-03S，Magen)，具体使用方法参考试剂盒说明书进行。待测样本采用商业化试剂盒提取ctDNA后保存备用。

3、反应体系

为了保证PCR反应体系的稳定性，本发明中PCR反应体系采用了包含热启动taq酶、缓冲液、镁离子和dNTP等试剂的反应体系。热启动taq酶(M7406，Promega)、缓冲液、镁离子和dNTP(U1515，Promega)等实验耗材购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。

为了保证检测的准确性和严谨性，本发明设置了内控基因和外控基因的双质控检测体系，可以分析待检DNA能否被正常扩增，排除可能造成PCR失败的原因。一个待测样本需要进行两管反应，其中BRAF基因V600E突变的检测和内控基因的检测在一个反应管中进行；外控基因检测在另一个反应管中进行。

待测样品的反应体系除了包含热启动taq酶、缓冲液、镁离子和dNTP等试剂以外，还包含了检测BRAF基因V600E突变的引物、探针和野生型模板抑制剂，还应包含内控引物和探针。待测样品检测反应体系如下：

外控的反应体系除了包含热启动taq酶、缓冲液、镁离子和dNTP等试剂以外，还包含了外控基因检测的引物和探针。具体的外控反应体系如下：

4、PCR反应

本发明中待测样本需要进行两个PCR反应，一个反应中包括检测待测样本BRAF(V600E)和内控基因，另一反应包含外控基因检测；同时每个检测样本应该设置阳性对照反应和阴性对照反应。

将待测样本ctDNA浓度调为1ng/ul，取1ul分别加入如上所述的待测样本反应体系和外控反应体系中，共计20μl体系。将配置好的反应体系进行荧光定量PCR反应，本发明方案中使用的仪器是ABI 7500。本发明中，荧光通道选择为FAM和VIC，优选的PCR扩增条件为：

预变性的条件为：95℃，2分钟；

PCR反应由两个阶段构成：

第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：

变性：95℃，15秒；

退火：60℃，20秒；

延伸：72℃，20秒；

第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：

变性：95℃，15秒；

退火：60℃，20秒，设置荧光信号采集；

延伸：72℃，20秒；

本发明方案中，针对待测样本同时按照上述方法设置阳性对照反应和阴性对照反应。

5、检测结果分析

在上述PCR反应体系和温度循环程序条件下，根据内控信号和外控信号的情况对反应体系和结果进行评估。本发明中，Ct值的确定以扩增过程前3-15循环的荧光值的10倍标准差为阈值，以荧光值超过阈值的循环数为阈值循环数(Ct值)。FAM信号用于检测待测样品V600E突变、外控基因；VIC用于检测内控基因。检测结果按照以下方案进行判读：

1)阴性对照反应中，FAM和VIC都不应该起峰，没有Ct值(见图1)；如果阴性对照中FAM或者VIC起峰，说明该反应体系有污染，请排除污染后重新进行反应。

2)阳性对照反应中，FAM和VIC都应该正常起峰，并且呈现“S”型曲线(见图2)；如果阳性对照反应中，FAM和VIC不正常起峰，请检查反应程序设置是否正确。

3)待测样品反应体系中VIC正常起峰，并且呈现“S”型曲线，且15<Ct值<25；如果Ct值<15，说明加入模板过量，请将模板稀释后重新进行反应；如果Ct值>25，说明加入模板量不足，请重新加入足量模板进行反应。

4)外控反应中FAM正常起峰，并且呈现“S”型曲线，且15<Ct值<25；如果Ct值<15，说明反应体系中加入模板过量，请将模板稀释后重新进行反应；如果Ct值>25，说明反应体系中有PCR抑制剂，请重新提取模板进行反应。

5)在满足1)、2)、3)和4)条的情况下，观察待测样品反应体系中FAM信号。如果反应体系中FAM信号呈现对数增长“S”曲线或者有起峰，则判读为阳性，待检测样本中含有V600E突变；如果反应体系中FAM信号没有起峰，则判读为阴性，待检测样本中不含有V600E突变或者超出本发明试剂盒的检测下限(见图3)。

6、灵敏度分析

本发明体系中加入了针对野生型模板的抑制剂，3’端采用特殊修饰，优选方式为C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷等，更优选的方案为用于特异性封闭BRAF基因野生型模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。上述抑制剂能与BRAF基因V600E突变位点野生型序列特异性结合，抑制野生型基因非特异扩增(见图4)。

通过绝对定量的方法，将含有V600E突变的阳性质粒(M)溶解在没有V600E突变的野生型(WT)ctDNA水溶液中，混合成M:WT为5:95、2.5:97.5、1:99、0.5:99.5和0.1:99.9的1ng/ul阳性对照品,即为5％、2.5％、1％、0.5％和0.1％的突变率。取定量后突变样本ctDNA按照实施例1的方法进行检测，结果表明本发明的灵敏度至少可以检测到1ngDNA背景条件下含有0.1％的V600E的突变样本(见图5)。

实施例2

下面结合具体实例2对本发明试剂盒用法进行详细描述，本实例在本发明技术前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。本实施例2同时收集了10例甲状腺癌患者外周血样本和穿刺组织样本，并分别命名为1-10号样本，通过本发明方法对1-10号外周血中ctDNA进行检测，将1-10号外周血中ctDNA的检测结果和1-10号穿刺组织DNA中BRAF基因一代测序的结果进行比对，用来确认本发明的准确性。

1、检测方法：

(1)临床患者样本ctDNA提取：将1-10号甲状腺癌患者外周血样本提取ctDNA，样本ctDNA的提取采用商业化成熟的提取试剂盒。本发明中采用美基生物核酸提取试剂盒HiPure Circulating DNA Midi Spin Kit S(D3182-03S，Magen)，具体使用方法参考试剂盒说明书进行，并用Qubit 3调整其浓度到1ng/ul备用。

(2)阳性对照品的制备：通过绝对定量的方法，将含有V600E突变的阳性质粒(M)溶解在没有V600E突变的野生型(WT)ctDNA水溶液中，混合成M:WT为1:99的1ng/ul阳性对照品备用(即：突变率为1％的模板)。

(3)反应体系配制：

检测反应体系：

外控反应体系：

(4)反应体系模板的加入：分别取浓度为1ng/μl待测样本ctDNA、阳性对照品、阴性对照(去离子水)三组模板各1μl分别加入上所述的待测样本反应体系和外控反应体系中，共计20μl。

反应条件：本发明方案中使用的仪器是ABI 7500。本发明中，荧光通道选择为FAM和VIC，优选的PCR扩增条件为：

预变性的条件为：95℃，2分钟；

PCR反应由两个阶段构成：

第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：

变性：95℃，15秒；

退火：60℃，20秒；

延伸：72℃，20秒；

第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：

变性：95℃，15秒；

退火：60℃，20秒，设置荧光信号采集；

延伸：72℃，20秒；

2、结果分析

(1)评价标准：

阴性对照反应中，FAM和VIC都不应该起峰，没有Ct值；如果阴性对照中FAM或者VIC起峰，说明该反应体系有污染，请排除污染后重新进行反应。

阳性对照反应中，FAM和VIC都应该正常起峰，并且呈现“S”型曲线；如果阳性对照反应中，FAM和VIC不正常起峰，请检查反应程序设置是否正确。

待测样品反应体系中VIC正常起峰，并且呈现“S”型曲线，且15<Ct值<25；如果Ct值<15，说明加入模板过量，请将模板稀释后重新进行反应；如果Ct值>25，说明加入模板量不足，请重新加入足量模板进行反应。

外控反应中FAM正常起峰，并且呈现“S”型曲线，且15<Ct值<25；如果Ct值<15，说明反应体系中加入模板过量，请将模板稀释后重新进行反应；如果Ct值>25，说明反应体系中有PCR抑制剂，请重新提取模板进行反应。

在满足1)、2)、3)和4)条的情况下，观察待测样品反应体系中FAM信号。如果反应体系中FAM信号呈现对数增长“S”曲线或者有起峰，则判读为阳性，待检测样本中含有V600E突变；如果反应体系中FAM信号没有起峰，则判读为阴性，待检测样本中不含有V600E突变或者超出本发明试剂盒的检测下限。

(2)结果

参考附图1、2、3和4，阴性对照均未起峰，阳性对照均正常起峰，待检样品的内控和外控检测结果均正常起峰，且15＜CT值＜25。待测1-10号ctDNA样本中，有8例FAM信号没有明显起峰,分别为1、3-6和8号，则判读为阴性，即待检测样本中不含有V600E突变或者超出本发明试剂盒的检测下限；有2例具有明显的“S”曲线，分别为2号和7号，则判读为阳性，即待检测样本中含有V600E突变(见图6)。

将10例甲状腺癌患者穿刺样本经过提取基因组DNA，对BRAF基因进行测序，测序结果和本发明1-10号外周血ctDNA检测结果一致，说明本发明专利准确率达到100％(见图7)。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司

<120>一种人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒及检测方法

<160>

<210> 1

<211> 32

<212>

<213> Artificial(人工序列)

<400> 1

gtaaaaatag gtgcttttgg tatagctgcc ga 32

<210> 2

<211> 28

<212>

<213> Artificial(人工序列)

<400> 2

ctttctagta actcagcagc atctcagg 28

<210> 3

<211> 33

<212>

<213> Artificial(人工序列)

<400> 3

aatctcgatg gagtgggtcc catcagtttg aac 33

<210> 4

<211> 35

<212>

<213> Artificial(人工序列)

<400> 4

ggaaaatgag atctactgtt ttcctttact tacta 35

<210> 5

<211> 27

<212>

<213> Artificial(人工序列)

<400> 5

ccaaggccaa ccgcgagaag atgaccc 27

<210>6

<211> 29

<212>

<213> Artificial(人工序列)

<400> 6

agagtcctac ggaaaacggc agaagagag 29

<210>7

<211> 25

<212>

<213> Artificial(人工序列)

<400> 7

cgctacctct tctggtggcc gcctc 25

<210>8

<211> 27

<212>

<213> Artificial(人工序列)

<400> 8

tattcttaaa taaatatgaa cccttaa 27

<210>9

<211> 27

<212>

<213> Artificial(人工序列)

<400> 9

aaatatgaaa cactgtttat aagacat 27

<210>10

<211> 33

<212>

<213> Artificial(人工序列)

<400> 10

atattttgaa accagtttca gtgtatttca aac 33

<210>11

<211> 605

<212>

<213> Artificial(人工序列)

<400> 11

taggttctcc tataaactta ggaaagcatc tcacctcatc ctaacacatt tcaagcccca 60

aaaatcttaa aagcaggtta tataggctaa atagaactaa tcattgtttt agacatactt 120

attgactcta agaggaaaga tgaagtacta tgttttaaag aatattatat tacagaatta 180

tagaaattag atctcttacc taaactcttc ataatgcttg ctctgatagg aaaatgagat 240

ctactgtttt cctttactta ctacacctca gatatatttc ttcatgaaga cctcacagta 300

aaaataggtg attttggtct agctacagag aaatctcgat ggagtgggtc ccatcagttt 360

gaacagttgt ctggatccat tttgtggatg gtaagaattg aggctatttt tccactgatt 420

aaatttttgg ccctgagatg ctgctgagtt actagaaagt cattgaaggt ctcaactata 480

gtattttcat agttcccagt attcacaaaa atcagtgttc ttatttttta tgtaaataga 540

ttttttaact tttttcttta cccttaaaac gaatattttg aaaccagttt cagtgtattt 600

caaac 605

Claims

1.一种人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，包括用于检测BRAF基因V600E突变的引物和探针、抑制剂、内控引物及探针、外控引物及探针，其特征在于：检测引物为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，检测探针为SEQ ID NO.3；抑制剂为SEQ ID NO.4；内控引物为SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6，内控荧光探针为SEQ ID NO.7；外控引物为SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9，外控荧光探针为SEQ ID NO.10。

2.如权利要求1所述的人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，包括PCR反应液，阳性质控和阴性质控。

3.如权利要求1或2所述的人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，PCR反应液包含了热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP。

4.如权利要求1、2或3所述的人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒，阳性质控序列为SEQ ID NO.11，阴性质控为水。

5.采用权利要求1-4任一所述的人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒的检测方法，包括实时荧光定量PCR和突变扩增PCR***(Arms-PCR)联合的PCR扩增。

6.采用权利要求5所述的人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒的检测方法，所述PCR扩增条件为：

预变性的条件为：95℃，2分钟；

PCR扩增第一阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，20秒；延伸：72℃，20秒；

PCR扩增第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，20秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，20秒。

7.采用权利要求1所述的人类BRAF基因V600E突变的检测试剂盒的检测方法，包括判读步骤，所述判读是在PCR反应体系和循环程序条件下，观察BRAF基因V600E突变的荧光检测信号是否形成对数扩增“S”型曲线；如果形成对数扩增“S”型曲线，该待检测样本含有V600E突变。