CN110938693B - 用于检测braf基因突变的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测braf基因突变的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110938693B
CN110938693B CN201911230036.8A CN201911230036A CN110938693B CN 110938693 B CN110938693 B CN 110938693B CN 201911230036 A CN201911230036 A CN 201911230036A CN 110938693 B CN110938693 B CN 110938693B
Authority
CN
China
Prior art keywords
braf
primer
mutation
probe
mixed solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911230036.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110938693A (zh
Inventor
徐雪
宋萍
汪进平
陈苗苗
杨玉霞
罗俊峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carrier Gene Technology Suzhou Co ltd
Original Assignee
Carrier Gene Technology Suzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carrier Gene Technology Suzhou Co ltd filed Critical Carrier Gene Technology Suzhou Co ltd
Priority to CN201911230036.8A priority Critical patent/CN110938693B/zh
Publication of CN110938693A publication Critical patent/CN110938693A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110938693B publication Critical patent/CN110938693B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于检测BRAF基因突变的引物组、试剂盒及方法，属于基因检测技术领域。本发明提供的引物组包括BRAF上游引物和BRAF下游引物；所述BRAF上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述BRAF下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。另外，本发明提供的试剂盒包括PCR扩增反应试剂、阳性质控品和阴性质控品、引物混合液、引物探针混合液和标准曲线方程。本发明提供的用于检测BRAF基因突变的方法具有高效、简便、直观、灵敏度高等特点，其可以对BRAF基因的突变频率进行定量分析。

Description

用于检测BRAF基因突变的引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体是一种用于检测BRAF基因突变的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B)基因编码B-RAF蛋白，参与细胞信号调节，生长和生存。BRAF基因的V600E突变可以导致B-RAF蛋白单体的组成性活化以及后续MEK1和MEK2蛋白的活化，从而促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。BRAF突变在人类肿瘤中约占8％，其中主要发生于黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌和非小细胞肺癌中，绝大部分突变形式为BRAF V600E突变。研究发现存在BRAF V600E突变的肿瘤预后较差，对化疗不敏感，生存期短。目前FDA已经分别针对不同肿瘤的BRAF V600E突变批准了不同的靶向治疗药物。
达拉非尼(Dabrafenib)和曲美替尼(Trametinib)组合疗法可以对BRAF V600E或BRAF V600K突变的合并***转移后完全切除的黑色素瘤和不可切除或转移性黑色素瘤进行辅助治疗，也可对BRAF V600E突变的转移性NSCLC和BRAF V600E突变且无合适局部治疗方案的局部晚期或转移性甲状腺未分化癌进行辅助治疗。维莫非尼(Vemurafenib)和考比替尼(Cobimetinib)的联合用药，可以辅助治疗BRAF V600E或BRAF V600K突变的不可切除或转移性黑色素瘤。
液体活检技术是一种非侵入性取样、能检测肿瘤早期进展、辅助治疗的突破性技术，特别是来自血浆的循环游离DNA(Circulating free DNA or cell free DNA,cfDNA)检测，正迅速成为标准肿瘤活检的重要微创辅助手段，可以动态反映肿瘤基因谱全貌。研究还表明，血液中的游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，其主要为小片段的双链DNA，对血浆cfDNA中的源自肿瘤细胞的cfDNA，即ctDNA(Circulating tumor DNA)，进行定性和定量的检测可反映出肿瘤的特征性变化。然而，由于血浆ctDNA含量极少，且有大量其他来源的cfDNA干扰，那么开发一种能够高灵敏度、高准确性和高可靠性的DNA突变检测技术就尤其重要。
目前，现有技术一般可以通过采用ARMS-PCR荧光探针技术、寡核苷酸修饰技术和TspR I限制性酶切技术，来检测人B-raf基因V600E突变，但是，以上方法不适用于cfDNA的检测。另外，Sanger测序法是目前所有基因检测的国际金标准，其特异性能达到100％，是分子诊断方面的经典技术平台；但是Sanger测序的灵敏度较低，对于低突变频率的样本无法检测。因此，目前亟需一种可以用于检测cfDNA样本的低突变频率的高灵敏度的BRAF基因突变的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测BRAF基因突变的引物组、试剂盒及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种用于检测BRAF基因突变的引物组，包括BRAF上游引物和BRAF下游引物；所述BRAF上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述BRAF下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种用于检测BRAF基因突变的试剂盒，包括PCR扩增反应试剂、阳性质控品、阴性质控品和标准曲线方程，所述的试剂盒还包括引物混合液以及与所述引物混合液相对应的引物探针混合液。
优选的，所述的引物探针混合液包括上述的BRAF上游引物和BRAF下游引物以及BRAF探针；所述BRAF探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
优选的，所述引物混合液中BRAF上游引物和BRAF下游引物的摩尔浓度均为2-100μmol/L。
优选的，所述引物探针混合液中BRAF上游引物和BRAF下游引物的摩尔浓度均为2-100μmol/L，BRAF探针的摩尔浓度为10-1000μmol/L。
优选的，所述的阳性质控品包括BRAF基因V600E突变位点的突变质粒和健康人基因组DNA；所述突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。
优选的，所述的标准曲线方程是由突变质粒和健康人基因组DNA按照BRAF V600位置的分子数量比为50％，10％，5％，1％，0.1％和0％稀释得到的标准品的第一CT值和第二CT值的差值而得到的标准曲线方程，具体包括以下步骤：
将上述的引物探针混合液、上述的PCR扩增反应试剂以及6种突变频率的标准品混在一起进行PCR扩增反应，得到6种突变频率标准品的第一CT值；
将上述的引物混合液、上述的PCR扩增反应试剂以及6种突变频率标准品分别混合在一起进行PCR扩增反应，得到6种突变频率标准品的第二CT值；
根据所述计算6种标准品的第一CT值与所述第二CT值的差值，得到标准曲线方程。
本发明实施例的另一目的在于提供一种用于检测BRAF基因突变的方法，每轮检测反应中，测样品与阳性质控品和阴性质控品同时进行分析，包括以下步骤：
获取待测样品的基因组DNA或者血浆游离DNA(cell-free DNA)，作为模板；
将上述的引物探针混合液、上述的PCR扩增反应试剂以及上述模板混在一起进行PCR扩增反应，得到第一PCR产物和第一CT值；
将上述的引物混合液、上述的PCR扩增反应试剂以及上述模板混在一起进行PCR扩增反应，得到第二PCR产物和第二CT值；
将上述的引物探针混合液、上述的PCR扩增反应试剂以及上述的阴性质控品与混在一起进行PCR扩增反应，得到第一阴性参考CT值；
将上述的引物混合液、上述的PCR扩增反应试剂以及上述的阴性质控品混在一起进行PCR扩增反应，得到第二阴性参考CT值；
将上述的引物探针混合液、上述的PCR扩增反应试剂以及上述的阳性质控品与混在一起进行PCR扩增反应，得到第一阳性参考CT值；
将上述的引物混合液、上述的PCR扩增反应试剂以及上述的阳性质控品混在一起进行PCR扩增反应，得到第二阳性参考CT值；
计算第一CT值和第二CT值的差值以及阴性参考CT差值和阳性参考CT差值，并判断样本的阴阳性。
优选的，用于检测BRAF基因突变的方法还包括：
对所述判断结果为阳性的样本的第一PCR产物和第二PCR产物进行测序(比如Sanger测序，二代高通量测序，单分子测序，纳米孔测序，焦磷酸测序)，得到测序结果；
如使用Sanger测序，可以使用通用引物M13RP直接测序，即可得到测序峰图；
对测序结果进行分析，识别待测样品的BRAF基因突变类型；
根据识别出的BRAF基因突变类型，将所述第一CT值与所述第二CT值的差值代入到对应突变类型的上述标准曲线方程中，得到对应BRAF基因突变类型的突变频率。
与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：
本发明公开一种用于BRAF基因突变检测的聚合酶链反应，可以选择性的扩增变异序列，在大约20个核苷酸窗口区域内，可以使突变型序列比野生型序列扩增效率高达1000倍或以上。根据已知的基因突变位点，设计特异性引物和探针，在同一退火温度可以检测同一位点的多种突变方式，并可以对基因突变频率进行定量分析。经过本专利所公开的聚合酶链反应选择性的扩增变异序列之后，能够将sanger测序的灵敏度从10％提高到了0.1％。其中：
(1)本发明可以采用M13RP通用引物对检测时的PCR扩增产物直接进行测序，通过软件进行突变的分析。
(2)本发明提供的用于检测BRAF基因突变的方法的灵敏度高，其可以检测低至0.1％的突变频率，并且可以对突变型模板富集，以满足Sanger测序低灵敏度的问题。
(3)本发明提供的用于检测BRAF基因突变的方法具有高效、简便、直观、灵敏度高等特点，其可以对BRAF基因的突变频率进行定量分析。
附图说明
图1为实施例3得到的BRAF基因V600E突变位点的标准曲线图。
图2为BRAF V600E不同突变频率的PCR扩增曲线图。
图3为实施例3中5％标准品的引物探针组产物的sanger测序峰图。
图4为实施例3中5％标准品的引物组产物的sanger测序峰图。
图5为实施例3中1％标准品的引物探针组产物的sanger测序峰图。
图6为实施例3中1％标准品的引物组产物的sanger测序峰图。
图7为实施例3中0.1％标准品的引物探针组产物的sanger测序峰图。
图8为实施例3中0.1％标准品的引物组产物的sanger测序峰图。
图9为实施例3中0％标准品的引物探针组产物的sanger测序峰图。
图10为实施例3中0％标准品引物组的sanger测序峰图。
图11为实施例4中检测黑色素瘤患者cfDNA的引物探针组产物的sanger测序峰图。
图12为实施例4中检测黑色素瘤患者的cfDNA引物组产物的sanger测序峰图。
图13为实施例4中检测甲状腺癌患者cfDNA引物探针组产物的sanger测序峰图。
图14为实施例4中检测甲状腺癌患者cfDNA引物组产物的sanger测序峰图。
图15为实施例4中检测结直肠癌患者cfDNA引物探针组产物的sanger测序峰图。
图16为实施例4中检测结直肠癌患者cfDNA引物组产物的sanger测序峰图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂未经特别注明的话，均是采用市售的设备和试剂。
实施例1
该实施例提供了一种用于检测BRAF基因突变的引物组，其包括BRAF上游引物和BRAF下游引物；所述BRAF上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述BRAF下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
具体的，各引物探针的序列如下表1所示：
表1
Figure BDA0002303284310000061
本发明实施例所设计的引物探针组主要针对BRAF基因V600位点的热点突变，其可以检测V600位点的多种突变方式，包括BRAF p.V600E、BRAF p.V600E2、BRAF p.V600K和BRAF p.V600 K601>E等。
实施例2
该实施例提供了一种用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其包括PCR扩增反应试剂、阳性质控品和阴性质控品和标准曲线方程，所述的试剂盒还包括引物混合液以及与所述引物混合液相对应的引物探针混合液；所述的引物混合液包含上述实施例1提供的BRAF上游引物和BRAF下游引物。具体的，PCR扩增反应试剂为ZoomBDA Master Mix；引物混合液中BRAF上游引物和BRAF下游引物的摩尔浓度均为2-100μmol/L；所述的引物探针混合液包括上述BRAF上游引物、上述BRAF下游引物以及BRAF探针；所述BRAF探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，具体的，BRAF探针与相应基因的特异性BRAF上游引物有10bp的重叠序列，并且在探针的3’端进行C3 Spacer修饰，当探针与野生型模板结合时可以竞争性抑制野生型模板的扩增。引物探针混合液中BRAF上游引物和BRAF下游引物的摩尔浓度均为2-100μmol/L，BRAF探针的摩尔浓度为10-1000μmol/L。
另外，阴性质控品为健康人全血基因组DNA(DeoxyriboNucleic Acid，脱氧核糖核酸)；阳性质控品为BRAF基因V600E的突变质粒和健康人基因组DNA混合液，突变质粒的浓度为50％；突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。
实施例3
该实施例提供了一种利用上述实施例2提供的试剂盒且用于检测BRAF基因突变的方法，每轮检测反应中，样本应该与阳性质控品和阴性质控品同时进行分析。其包括以下步骤：
(1)获取待测样品的cfDNA，作为模板；具体的，获得的cfDNA的OD260/OD280值应控制在1.8～2.0；另外，使用琼脂糖凝胶电泳观察cfDNA片段范围，需小于1000bp，立即进行后续的样本检测或置于-20℃保存备用。
(2)将上述引物探针混合液、上述PCR扩增反应试剂以及上述模板混在一起进行PCR扩增反应，得到第一PCR产物和第一CT值；具体的，先取6μL的引物探针混合液、25μL的PCR扩增反应试剂混合在一起，得到反应液，置于96孔板或者8连管对应的孔中，再往反应液中添加步骤(1)得到的模板，其中，cfDNA模板的加入量为洗脱体积的1/2，最大体积不超过19ul，然后使用无核酸酶水补充至总体积为50ul。
(3)将上述引物混合液、上述PCR扩增反应试剂以及上述模板混在一起进行PCR扩增反应，得到第二PCR产物和第二CT值；具体的，先取4μL的引物混合液、25μL的PCR扩增反应试剂混合在一起，得到反应液，置于与步骤(2)相同的96孔板或者8连管对应的孔中；再往反应液中添加步骤(1)得到的模板，其中，cfDNA模板的加入量为洗脱体积的1/2，最大体积不超过19ul，然后使用无核酸酶水补充至总体积为50ul。
(4)将上述引物探针混合液、上述PCR扩增反应试剂以及上述阴性质控品混在一起置于96孔板或者8连管中进行PCR扩增反应，得到第一阴性参考CT值；具体的，用阴性质控品代替步骤(2)中的模板，其中阴性质控品的加入体积为10ul，然后使用无核酸酶水补充至总体积为50ul。其余的成分、用量及反应条件与步骤(2)的相同。
(5)将上述引物混合液、上述PCR扩增反应试剂以及上述阴性质控品混在一起置于96孔板或者8连管中进行PCR扩增反应，得到第二阴性参考CT值；具体的，用阴性质控品代替步骤(3)中的模板，其中阴性质控品的加入体积为10ul，然后使用无核酸酶水补充至总体积为50ul。其余的成分、用量及反应条件与步骤(3)的相同。
(6)将上述引物探针混合液、上述PCR扩增反应试剂以及上述阳性质控品混在一起置于96孔板或者8连管中进行PCR扩增反应，得到第一阳性参考CT值；具体的，用阳性质控品代替步骤(2)中的模板，其中阳性质控品的加入体积为10ul，然后使用无核酸酶水补充至总体积为50ul。其余的成分、用量及反应条件与步骤(2)的相同。
(7)将上述引物混合液、上述PCR扩增反应试剂以及上述阴性质控品混在一起置于96孔板或者8连管中进行PCR扩增反应，得到第二阳性参考CT值；具体的，用阳性质控品代替步骤(3)中的模板，其中阳性质控品的加入体积为10ul，然后使用无核酸酶水补充至总体积为50ul。其余的成分、用量及反应条件与步骤(3)的相同。
(8)将加好的96孔板或者8连管低速离心数秒，使液体全部置于管底并无气泡后，再置于ABI 7500PCR仪器进行Realtime PCR反应。
(9)将所述第一CT值和所述第二CT值的差值与所述阴性参考CT差值和阳性参考CT差值进行对比，根据对比结果判断BRAF基因是否存在突变。具体的，若前者差值位于阳性参考差值和阴性参考差值之间，则该样本的检测结果为阳性或者弱阳性，可能存在相应的基因突变。
(10)将步骤(2)和(3)得到的第一PCR产物和第二PCR产物分别进行Sanger测序，得到sanger测序峰图；具体的，将各样本的加探针和未加探针的反应管中的产物单独收集，每一个孔对应一个收集管，可以由测序公司进行Sanger测序，直接使用M13RP测序。
(11)对sanger测序峰图进行分析，识别待测样品的BRAF基因突变类型；具体的，应用sequencing analysis、Bioedit、Snapgene等软件进行序列比对分析，将测序得到的序列与检测基因扩增序列进行比对，并对基因突变类型进行识别。
(11)根据识别出的BRAF基因突变类型，将所述第一CT值与所述第二CT值的差值代入到对应突变类型的上述标准曲线方程中，得到对应BRAF基因突变类型的突变频率。具体的，将第一CT值与第二CT值的差值作为Y值带入到标准曲线方程中，如附图1所示，得到的X即为对应的BRAF基因突变类型的突变频率的对数值(log(VAF))，然后再计算10X，即为所检测的BRAF基因突变类型的突变频率。
另外，标准曲线包含上述突变质粒和健康人基因组DNA分别按突变质粒的浓度为0％、0.1％、1％、5％、10％、50％进行混合的标准品，并按照步骤(4)和步骤(5)进行PCR反应，得到的6组PCR扩增曲线如附图2所示，其中，A～F分别对应0％、0.1％、1％、5％、10％、50％的浓度。从图中可以知道，本发明实施例提供的检测BRAF基因V600位点突变的方法的灵敏度为0.1％。同时我们也对5％，1％，0.1％和0％四种标准品引物探针组和引物组的qPCR扩增产物进行Sanger测序，sanger测序峰图如附图3-10所示，其中，图3和图4分别为5％标准品的引物探针组和引物组产物的sanger测序峰图；图5和图6分别为1％标准品的引物探针组和引物组产物的sanger测序峰图；图7和图8分别为0.1％标准品的引物探针组和引物组产物的sanger测序峰图；图9和图10分别为0％标准品的引物探针组和引物组产物的sanger测序峰图。
从附图3～4可以看到，对于突变频率为5％的标准品，在引物探针组产物中是单峰，可以清楚地看到在V600位点T突变成A；在引物组产物中同样也是单峰，但是为野生型序列。
从附图5～6可以看到，对于突变频率为1％的标准品，在引物探针组产物中为单峰，并且显示为V600E突变型；在引物组产物中也为单峰，但是显示为野生型序列。
从附图7～8可以看到，对于突变频率为0.1％的标准品，与其他突变频率标准品的sanger测序峰图有所不同，在引物探针组产物中为套峰，并且显示为V600E突变型和野生型；在引物组产物中则显示清晰的野生型单峰，说明在引物探针组中对突变型序列进行了大量富集，从而可以被Sanger检测到。
从附图9～10可以看到，对于突变频率为0％的标准品，引物探针组和引物组产物的sanger测序峰图均为单峰，并且均显示为野生型序列。
从以上不同浓度梯度的sanger测序峰图可以看出，在引物探针组和引物组中qPCR产物单一，峰图清晰，说明引物和探针具有较高的特异性；同时可以明确区分0.1％以上突变频率的突变型和野生型样本，从而说明该方法具有较高的灵敏度和特异性。
需要说明的是，上述ABI 7500PCR仪器在使用时，选择“SYBR Green Reagents”模式，并设定如表2所示的PCR程序：
表2
Figure BDA0002303284310000101
实施例4
该实施例为临床样本的检测实验，具体的，先取部分临床患者已经检测确定存在BRAF V600E突变的样本，包括有黑色素瘤患者的cfDNA，甲状腺癌患者cfDNA，和结直肠癌患者cfDNA；接着，按照实施例3提供的检测方法，对上三个样本进行检测，其检测得到的测序峰图如附图11～16所示。其中，图11和图12分别为黑色素瘤患者的cfDNA加BRAF探针(引物探针组)、黑色素瘤患者的cfDNA不加探针(引物组)的测序峰图；图13和图14分别为甲状腺癌患者cfDNA加BRAF探针(引物探针组)、甲状腺癌患者cfDNA不加探针(引物组)的测序峰图；图15和图16分别为结直肠癌患者cfDNA加BRAF探针(引物探针组)、结直肠癌患者cfDNA不加探针(引物组)的测序峰图。
从附图11～12中可以看到，在加BRAF探针组中明确检测到T突变成A，而不加探针的则没有检测到，说明发生的突变率较低，在普通Realtime PCR扩增的过程中虽然有富集，但是相较于野生型所占比例较低，因此不加探针组中没有检测到突变型。将该样本检测得到的△CT值(第一CT值与第二CT值的差值)代入图1提供的曲线的方程式中，计算其突变频率为13％。
从附图13～14中可以看到，在加BRAF探针组中明显检测到T突变成A，在不加探针组中仍然是野生型。将该样本检测得到的△CT值代入图1提供的标准曲线的方程式中，计算得到其突变频率为3％。
从附图15～16中可以看到，在加BRAF探针组中明显检测到T突变成A，同时是双峰，突变型和野生型同时存在，而在不加探针组中没有检测到突变，说明该样本中BRAF V600E突变频率很低，使用本发明提供的方法扩增之后，突变序列进行了大量富集。将该样本检测得到的△CT值代入图1提供的标准曲线的方程式中，计算得到其突变频率为0.2％。
需要说明的是，通过本发明提供的检测方法获得的突变频率可以给临床医生提供预后治疗数据参考，但不得直接作为临床诊治的唯一依据。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Figure BDA0002303284310000121
Figure BDA0002303284310000131
序列表
<110> 阅尔基因技术（苏州）有限公司
<120> 用于检测BRAF基因突变的引物组、试剂盒及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggacccac tccatcgaga t 21
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcggataac aatttcacac aggattactt actacacctc agatatattt cttcatg 57
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccatcgagat ttcactgtag ctagaccaaa a 31
<210> 4
<211> 304
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttttaaaga atattatatt acagaattat agaaattaga tctcttacct aaactcttca 60
taatgcttgc tctgatagga aaatgagatc tactgttttc ctttacttac tacacctcag 120
atatatttct tcatgaagac ctcacagtaa aaataggtga ttttggtcta gctacagaga 180
aatctcgatg gagtgggtcc catcagtttg aacagttgtc tggatccatt ttgtggatgg 240
taagaattga ggctattttt ccactgatta aatttttggc cctgagatgc tgctgagtta 300
ctag 304

Claims (4)

1.用于检测BRAF基因突变的试剂盒，包括PCR扩增反应试剂、阳性质控品、阴性质控品和标准曲线方程，其特征在于，所述的试剂盒还包括引物混合液以及与所述引物混合液相对应的引物探针混合液；所述的引物混合液包括BRAF上游引物和BRAF下游引物；所述的引物探针混合液包括BRAF上游引物、BRAF下游引物以及BRAF探针；所述BRAF上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述BRAF下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2；所示所述BRAF探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；
所述的标准曲线方程是由突变质粒和健康人基因组DNA按照BRAF V600位置的分子数量比为50%，10%，5%，1%，0.1%和0%稀释得到的标准品的第一CT值和第二CT值的差值而得到的标准曲线方程，具体包括以下步骤：
将所述的引物探针混合液、所述的PCR扩增反应试剂以及6种突变频率的标准品混在一起进行PCR扩增反应，得到6种突变频率标准品的第一CT值；
将所述的引物混合液、所述的PCR扩增反应试剂以及6种突变频率标准品分别混合在一起进行PCR扩增反应，得到6种突变频率标准品的第二CT值；
根据所述计算6种标准品的第一CT值与所述第二CT值的差值，以及6种标准品的突变频率的对数值，得到标准曲线方程。
2.根据权利要求1所述的用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述引物混合液中BRAF上游引物和BRAF下游引物的摩尔浓度均为2-100μmol/L。
3.根据权利要求2所述的用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述引物探针混合液中BRAF上游引物和BRAF下游引物的摩尔浓度均为2-100μmol/L，BRAF探针的摩尔浓度为10-1000μmol/L。
4.根据权利要求2所述的用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品包括BRAF基因V600E突变位点的突变质粒和健康人基因组DNA；所述突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。
CN201911230036.8A 2019-12-04 2019-12-04 用于检测braf基因突变的引物组、试剂盒及方法 Active CN110938693B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911230036.8A CN110938693B (zh) 2019-12-04 2019-12-04 用于检测braf基因突变的引物组、试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911230036.8A CN110938693B (zh) 2019-12-04 2019-12-04 用于检测braf基因突变的引物组、试剂盒及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110938693A CN110938693A (zh) 2020-03-31
CN110938693B true CN110938693B (zh) 2022-02-25

Family

ID=69909171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911230036.8A Active CN110938693B (zh) 2019-12-04 2019-12-04 用于检测braf基因突变的引物组、试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110938693B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500727A (zh) * 2020-04-30 2020-08-07 北京和合医学诊断技术股份有限公司 用于检测kras基因和braf基因突变的引物组及其应用方法
CN114381510A (zh) * 2021-12-28 2022-04-22 迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司 用于检测braf基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法
CN114395619B (zh) * 2021-12-29 2024-04-30 福建和瑞基因科技有限公司 一种高通量测序方法以及内参质控品
CN114525340A (zh) * 2022-02-11 2022-05-24 求臻医学科技（北京）有限公司 一种用于jak2基因突变检测的特异性探针及检测方法
CN114525339A (zh) * 2022-02-11 2022-05-24 求臻医学科技（北京）有限公司 一种用于mpl基因突变检测的特异性探针及检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734136A (zh) * 2016-03-25 2016-07-06 上海今创医学检验所有限公司 一种检测人braf基因突变的探针法及检测试剂盒
CN109576372A (zh) * 2018-12-29 2019-04-05 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种用于braf基因v600e突变检测的核酸序列及其应用
CN110157703A (zh) * 2019-05-21 2019-08-23 珠海圣美生物诊断技术有限公司 一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734136A (zh) * 2016-03-25 2016-07-06 上海今创医学检验所有限公司 一种检测人braf基因突变的探针法及检测试剂盒
CN109576372A (zh) * 2018-12-29 2019-04-05 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种用于braf基因v600e突变检测的核酸序列及其应用
CN110157703A (zh) * 2019-05-21 2019-08-23 珠海圣美生物诊断技术有限公司 一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Evaluation of the Real-Q BRAF V600E Detection Assay in Fine-Needle Aspiration Samples of Thyroid Nodules;Park, KS等;《JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》;20150731;第17卷(第4期);第431-437页 *
甲状腺癌患者血浆循环肿瘤DNA含量及BRAF V600E突变联合检测的临床意义;黄铀新等;《实用医学杂志》;20170808;第33卷(第14期);第2318-2321页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110938693A (zh) 2020-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110938693B (zh) 用于检测braf基因突变的引物组、试剂盒及方法
Kuo et al. Comparison of KRAS mutation analysis of primary tumors and matched circulating cell-free DNA in plasmas of patients with colorectal cancer
CN101092644B (zh) 非小细胞肺癌疗效相关的egfr基因突变的快速检测
KR20180033587A (ko) 제자리 증폭에 의한 세포-유리 핵산 분자의 제조 방법
CN107447013B (zh) 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒
CN109457018A (zh) 一种基于多重荧光pcr的egfr突变基因检测方法
CN110863051B (zh) 一种met基因扩增检测的引物、体系及试剂盒
CN110923325B (zh) 用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组、试剂盒及方法
CN110982884B (zh) 用于检测aml相关基因突变的引物组、试剂盒及方法
CN106498028B (zh) Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒
CN109996891B (zh) 用于进行结肠癌和/或结肠癌前体细胞的早期检测和用于监测结肠癌复发的方法
Araki et al. Usefulness of peptide nucleic acid (PNA)-clamp smart amplification process version 2 (SmartAmp2) for clinical diagnosis of KRAS codon12 mutations in lung adenocarcinoma: Comparison of PNA-clamp SmartAmp2 and PCR-related methods
US20130029336A1 (en) KRAS Primers and Probes
CN115851935A (zh) 一种用于met基因外显子14跳跃突变检测的引物探针组和试剂盒
CN107022621A (zh) Braf基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN106755551A (zh) 一种egfr/l858r突变液体活检试剂盒及其应用
Chen et al. Establishment of multiplex allele-specific blocker PCR for enrichment and detection of 4 common EGFR mutations in non-small cell lung cancer
CN107586851A (zh) 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒
Su et al. Sensitive and selective detections of codon 12 and 13 KRAS mutations in a single tube using modified wild-type blocker
CN113881759A (zh) Egfr基因突变检测试剂盒及其检测方法
CN112795653A (zh) Kras基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用
CN113930501A (zh) 人egfr基因突变的数字pcr检测方法及应用
CN111635933A (zh) 一种检测人kras基因2号外显子突变的pcr试剂盒
CN111607646A (zh) 一种用于检测braf基因突变的核苷酸序列组及其应用
CN108753961B (zh) Braf v600e基因突变检测引物、方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant