CN111607646A - 一种用于检测braf基因突变的核苷酸序列组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核苷酸序列组，包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变位点的BRAF基因的一部分；正向引物的3’末端对应BRAF基因的突变位点、对应突变位点向BRAF基因5’端1‑10个碱基的位置或对应BRAF突变位点向BRAF基因3’端1‑10个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应BRAF基因的突变位点、对应突变位点向BRAF基因5’端1‑10个碱基的位置或对应BRAF突变位点向BRAF基因3’端1‑10个碱基的位置。采用本发明的核苷酸序列组，配合荧光定量PCR检测方法，可以将BRAF突变基因的检测灵敏度提升至0.05％。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于基因突变检测的核苷酸序列组及其应用。
背景技术
BRAF是人类最重要的原癌基因之一，目前检测到的BRAF突变已逾30种，其中V600E占80％以上，主要发生在黑色素瘤、结肠癌和甲状腺癌中，是RAS-RAF-MEK-ERK信号转导通路重要的转导因子，主要通过有丝蛋白激酶通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶来发挥作用。该酶将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内转录因子相连接，启动多种因子参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。该基因的突变，最常见的突变为V600E，最常发生在黑色素瘤，非霍奇金淋巴瘤，大肠癌，甲状腺癌，非小细胞肺癌，多毛细胞白血病和腺肺癌中。此外，BRAF突变与靶向药物西妥昔单抗及帕尼单抗的耐药相关。
BRAF基因V600E突变的黑色素瘤临床样本在V600E检测体系中具有特异性的扩增，灵敏度和特异性均较高。AGAP3-BRAF融合基因会导致BRAF V600E突变的黑色素瘤对维莫非尼产生耐药。在BRAF V600E突变的黑色素瘤细胞系中表达AGAP3-BRAF融合基因，会导致维莫非尼耐药，然而，这些细胞仍然对MEK抑制剂(丝裂原活化抑制剂)较为敏感。BRAF基因是一种原癌基因，如果出现了突变，身体患癌的可能性就比较大。而V600E是BRAF基因最容易突变的一个位点。
经过大量研究证实，BRAF V600E基因突变与甲状腺癌的诊断、治疗和判断预后都有重要联系。BRAF V600E突变发生在40％-70％的PTC中，而在FTC、MTC、嗜酸性细胞腺癌、腺瘤和良性甲状腺增生中极少发现，因此BRAF V600E可作为PTC临床鉴别诊断指标。因BRAFV600E与PTC恶性特征具有相关性，与肿瘤大小等高风险特征呈正相关，可辅助PTC诊断。
现有技术中活检侵袭性大、测序法操作复杂、成本高及周期长以及常规荧光定量PCR检测方法灵敏度不够高。
因此，本领域技术人员致力于开发一种提高BRAF基因突变检测灵敏度的方法。
发明内容
有鉴于现有技术中活检侵袭性大、测序法操作复杂、成本高及周期长以及常规荧光定量PCR检测方法灵敏度仅能达到1％的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种提高BRAF基因突变检测灵敏度的方法。
为实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种核苷酸序列组。在一个具体实施方式中，该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变位点的突变型BRAF基因的一部分；正向引物的3’末端对应突变型BRAF基因正义链中突变位点、突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型BRAF基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。
可选地，正向引物或反向引物上包括人为突变位点；该人为突变位点使得正向引物与突变型BRAF基因的反义链不能完全互补；或者该人为突变位点使得反向引物与突变型BRAF基因的正义链不能完全互补。
可选地，人为突变位点位于距正向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置；或者人为突变位点位于距反向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置。
在另一个具体实施方式中，核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列，所述阻断核苷酸序列能与对应于所述突变位点处的一段野生型BRAF基因的反义链互补。
可选地，该阻断核苷酸序列的3’端添加有2-5个相对于野生型基因的非互补碱基，或者添加有使阻断核苷酸序列本身不能延伸的3’端化学修饰。
进一步可选地，3’端化学修饰为3'ddC、3'反向dT(3'Inverted dT)、3'C3间隔子(3'C3spacer)、3'氨基(3'Amino)或3'磷酸化(3'phosphorylation)。
在又一个具体实施方式中，正向引物和反向引物扩增的片段为包括突变位点的60-120bp长度的序列。
可选地，正向引物和反向引物的序列长度为15-35bp，退火温度为55-65℃。
可选地，该核苷酸序列组还包括探针，该探针带有荧光基团和淬灭基团。可选地，荧光基团选自FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE和ROX；淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、TAMRA和MGB。
在又一个具体实施方式中，该核苷酸序列组还包括内标正向引物和内标反向引物，内标正向引物和反向引物的扩增区域为BRAF基因相对保守的一段序列。
可选地，还包括内标探针。可通过设置不同的荧光基团，实现同一检测孔中同时检测突变位点和内标序列
在又一个具体实施方式中，突变位点为野生型BRAF基因的第1799位碱基，或者突变位点对应野生型BRAF基因所编码的氨基酸序列的第600位。
在一个具体实施方式中，该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变位点的突变型BRAF基因的一部分，正向引物序列选自如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:11所示的序列中的一个或两个。
进一步地，反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。。
可选地，该核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列，所述阻断核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
可选地，该核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团，探针的序列如SEQ ID NO:6所示。
可选地，核苷酸序列组还包括内标正向引物和内标反向引物，内标正向引物的序列如SEQ ID NO:4所示，内标反向引物的序列如SEQ ID NO:5所示。
可选地，核苷酸序列组还包括内标探针，内标探针的序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明的第二个方面提供了一种试剂盒。在一个具体实施方式中，该试剂盒包括如上所述的核苷酸序列组。
可选地，每一个正向引物的浓度均为300±200nM，每一个反向引物的浓度均为300±200nM，每一个阻断核苷酸序列的浓度均为0-4μM，探针的浓度为100-400nM。
可选地，该试剂盒中还包括DNA聚合酶、镁离子、dNTP和缓冲液。
本发明的第三个方面还提供了一种检测基因突变的方法，其特征在于，使用如上所述的核苷酸序列组进行PCR扩增。
可选地，上述方法适用于检测循环肿瘤DNA、肿瘤组织DNA。
可选地，采用荧光定量PCR进行检测。
可选地，荧光信号通过荧光染料或荧光探针获得。
采用本发明的核苷酸序列组，配合荧光定量PCR检测方法，可以将BRAF突变基因的检测灵敏度提升至0.05％，可以用于以血液中的ctDNA、肿瘤组织DNA、为样本进行检测，从而有助于临床上对患者的基因突变状态进行判断。
并且，当配合采用荧光定量PCR的检测方法时，实验操作简便，数据分析及结果判读直观，检测成本较低，能够在2小时内出具检测结果，能够最大限度满足临床需求。通过荧光染料对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。通过软件对荧光积累信息进行分析和计算，能获得待测样品模板的初始浓度。
以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的原理示意图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
本发明中所述的BRAF野生型基因的序列NCBI登录号为NCBI Gene ID:673。本文中除有特别说明，第1799位是根据BRAF野生型基因的第一个核苷酸位第1位开始计算的；第1799位核苷酸所在的密码子对应BRAF野生型基因的第600位氨基酸。野生型BRAF基因第二外显子及周边序列如SEQ ID NO:8所示，突变型BRAF基因第二外显子及周边序列如SEQ IDNO:9所示，内标引物扩增的序列如SEQ ID NO:10所示。
在第一个具体实施方式中，根据BRAF基因的突变点，设计能扩增包含突变位点的核苷酸序列组。该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，在一个可选的实施方式中，扩增的序列长度为60-120bp长度。正向引物的3’末端对应突变型BRAF基因正义链中突变位点、突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型BRAF基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。
在一个可选的实施方式中，正向引物或反向引物包括人为突变位点。该人为突变位点是设计引物时人为引入的，并且与样本中的突变点位置不同。人为突变位点使得正向引物与含有突变位点的BRAF基因不能完全互补，以增加野生型和突变型DNA的区分度。引入的人为突变位点数量可以根据正向引物的长度进行，一般可以引入1-2个人为突变位点。可选地，可以在正向引物上引入1个人为突变位点。可选地，人为突变位点位于距正向引物3’端1-10个碱基位置。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团，用于在检测时提供荧光信号。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括内标正向引物和内标反向引物，用于扩增BRAF基因相对保守的一段序列。可选地，还包括内标探针，内标探针带有荧光基团和淬灭基团，用于在检测时提供荧光信号。
在第二个具体实施方式中，根据BRAF基因的突变点，设计能扩增包含突变位点的的核苷酸序列组。该核苷酸序列组包括正向引物、反向引物和阻断核苷酸序列。，在一个可选的实施方式中，正向引物和反向引物扩增的序列长度为60-120bp长度。
正向引物及反向引物的设计原则与第一个具体实施方式中一致。
阻断核苷酸序列能竞争性抑制野生型基因扩增。阻断核苷酸序列与对应于所述突变位点处的一段野生型BRAF基因序列互补。阻断核苷酸序列的3’端添加有2-5个相对于野生型BRAF基因的非互补碱基，或者添加有使阻断核苷酸序列本身不能延伸的3’端化学修饰，通过非互补碱基或者化学修饰，实现抑制野生型基因扩增的目的。可选地，3’端化学修饰为3’ddC、3'Inverted dT、3'C3spacer、3'Amino或3'phosphorylation。
利用上述核苷酸序列组检测BRAF基因突变点的原理如图1所示，阻断核苷酸序列与野生型BRAF基因结合，使得正向引物不能与野生型BRAFBRAF基因结合，从而使野生型BRAF基因不能扩增。阻断核苷酸序列不能与突变型BRAF基因结合，此时正向引物与突变型BRAF基因结合，从而与反向引物一起扩增出目的片段。
在一个可选的实施方式中，正向引物或反向引物包括人为突变位点。人为突变点的设计原则与第一个具体实施方式中的一致。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团，用于在检测时提供荧光信号。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括内标正向引物和内标反向引物，用于扩增BRAF基因相对保守的一段序列。可选地，还包括内标探针，内标探针带有荧光基团和淬灭基团，用于在检测时提供荧光信号。在第三个具体实施方式中，根据如SEQ IDNO:8所示的野生型BRAF基因编码的蛋白序列的第600位氨基酸(即核苷酸序列第1798位、第1799位和第1800位核苷酸)及周边序列设计核苷酸序列组，用于检测第600位氨基酸(主要是第1799位核苷酸)。
该核苷酸序列组包括正向引物、反向引物、阻断核苷酸序列和探针。正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示，阻断核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在一个可选的实施方式中，核苷酸序列组还包括内标正向引物、内标反向引物和内标探针，内标正向引物的序列如SEQ ID NO:4所示，内标反向引物的序列如SEQ ID NO:5所示，内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在第四个具体实施方式中，根据如SEQ ID NO:8所示的野生型BRAF基因编码的蛋白序列的第600位氨基酸(即核苷酸序列第1798位、第1799位和第1800位核苷酸)及周边序列设计核苷酸序列组，用于检测第600位氨基酸(主要是第1799位核苷酸)。
该核苷酸序列组包括正向引物、反向引物、阻断核苷酸序列和探针。其中，在正向引物上引入了一个人为突变位点。正向引物的序列如SEQ ID NO:11所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在一个可选的实施方式中，核苷酸序列组还包括内标正向引物、内标反向引物和内标探针，内标正向引物的序列如SEQ ID NO:4所示，内标反向引物的序列如SEQ ID NO:5所示，内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
实施例1检测灵敏度实验
本实施例使用的核苷酸序列组用于扩增含有突变位点的DNA的正向引物、反向引物、阻断核苷酸序列和探针(序列由上海生工生物工程有限公司合成)，具体如表1所示：
表1核苷酸序列组
探针的荧光基团为FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE或者ROX；淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、TAMRA或者MGB。通过探针法获得荧光信号。
1、突变型细胞系DNA
突变型细胞系DNA购自科佰生物(货号：CBP10234)，采用NGS定量突变频率。
2、灵敏度实验的检测模板处理
检测模板中，DNA突变频率分别为1％、0.1％、0.05％、0％。
阳性参考品(即含有突变位点的突变型DNA)浓度为30ng/ul，阴性参考品(即不含有突变位点的野生型DNA)浓度为30ng/ul，将阳性参考品与阴性参考品按比例混合，将阳性样本分别稀释到1％，0.1％，0.05％。
3、荧光定量PCR检测，
使用如表1所示的引物，以及如上检测模板DNA，按照如下所示的PCR扩增体系配置PCR反应液。每个突变位点设置三个重复。其中，定量PCR试剂购自赛默飞(TaqPathTMProAmpTM Master Mix)、Kapa Biosystems(KK4701)或Toyobo(QPS-101)。
PCR的扩增反应体系如下：
使用配置的反应体系进行荧光定量PCR检测(定量PCR仪为Bio-rad CFX96)，PCR扩增的反应条件为：
表2荧光定量PCR检测结果
根据表2中的结果，表明采用如表1中的核苷酸序列组合，BRAF基因突变位点的检测下限可达0.05％。
实施例2检测灵敏度实验
本实施例使用的核苷酸序列组包括正向引物、反向引物、阻断核苷酸和探针(序列由上海生工生物工程有限公司合成)，具体如表1所示：
表3核苷酸序列组
探针的荧光基团为FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE或者ROX；淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、TAMRA或者MGB。通过探针法获得荧光信号。
1、突变型细胞系DNA
突变型细胞系DNA购自科佰生物(货号：CBP10234)，采用NGS定量突变频率。
2、灵敏度实验的检测模板处理
检测模板中，DNA突变频率分别为1％、0.1％、0.05％、0％。
阳性参考品(即含有突变位点的突变型DNA)浓度为30ng/ul，阴性参考品(即不含有突变位点的野生型DNA)浓度为30ng/ul，将阳性参考品与阴性参考品按比例混合，将阳性样本分别稀释到1％，0.1％，0.05％。
3、荧光定量PCR检测，
使用如表3所示的引物，以及如上检测模板DNA，按照如下所示的PCR扩增体系配置PCR反应液。每个突变位点设置三个重复。其中，定量PCR试剂购自赛默飞(TaqPathTMProAmpTM Master Mix)、Kapa Biosystems(KK4701)或Toyobo(QPS-101)。
PCR的扩增反应体系如下：
使用配置的反应体系进行荧光定量PCR检测(定量PCR仪为Bio-rad CFX96)，PCR扩增的反应条件为：
表4荧光定量PCR检测结果
根据表4中的结果，表明采用如表3中的核苷酸序列组合，BRAF基因突变位点的检测下限可达0.05％。
实施例3检测灵敏度实验
本实施例使用的核苷酸序列组包括引入突变位点的正向引物、反向引物和探针(序列由上海生工生物工程有限公司合成)，具体如表1所示：
表5核苷酸序列组
探针的荧光基团为FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE或者ROX；淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、TAMRA或者MGB。通过探针法获得荧光信号。
1、突变型细胞系DNA
突变型细胞系DNA购自科佰生物(货号：CBP10234)，采用NGS定量突变频率。
2、灵敏度实验的检测模板处理
检测模板中，DNA突变频率分别为1％、0.1％、0.05％、0％。
阳性参考品(即含有突变位点的突变型DNA)浓度为30ng/ul，阴性参考品(即不含有突变位点的野生型DNA)浓度为30ng/ul，将阳性参考品与阴性参考品按比例混合，将阳性样本分别稀释到1％，0.1％，0.05％。
3、荧光定量PCR检测，
使用如表5所示的引物，以及如上检测模板DNA，按照如下所示的PCR扩增体系配置PCR反应液。每个突变位点设置三个重复。其中，定量PCR试剂购自赛默飞(TaqPathTMProAmpTM Master Mix)、Kapa Biosystems(KK4701)或Toyobo(QPS-101)。
PCR的扩增反应体系如下：
使用配置的反应体系进行荧光定量PCR检测(定量PCR仪为Bio-rad CFX96)，PCR扩增的反应条件为：
表6荧光定量PCR检测结果
根据表6中的结果，表明采用如表1中的核苷酸序列组合，BRAF基因突变位点的检测下限可达0.1％。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 成都华青精准医疗科技有限公司
<120> 一种用于检测BRAF基因突变的核苷酸序列组及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ataggtgatt ttggtctagc tacaga 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctcaattct taccatccac aaaatgg 27
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtctagcta cagtgaaatc tcgatggaga aaa 33
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attctgtaat ataatattct ttaaaacata gtact 35
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggctaaatag aactaatcat tgttttagac 30
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atctttcctc ttagagtc 18
<210> 8
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caaaaattta atcagtggaa aaatagcctc aattcttacc atccacaaaa tggatccaga 60
caactgttca aactgatggg acccactcca tcgagatttc actgtagcta gaccaaaatc 120
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<210> 9
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caaaaattta atcagtggaa aaatagcctc aattcttacc atccacaaaa tggatccaga 60
caactgttca aactgatggg acccactcca tcgagatttc tctgtagcta gaccaaaatc 120
acctattttt actgtgaggt cttcatgaag aaatatatct gaggtgtagt aagtaaagga 180
aaacagtaga tctcattttc 200
<210> 10
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgtagtaag taaaggaaaa cagtagatct cattttccta tcagagcaag cattatgaag 60
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ctttcctaag 250
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ataggtgatt ttggtctagc tacag 25
Claims (10)
1.一种核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变位点的突变型BRAF基因的一部分；所述正向引物的3’末端对应突变型BRAF基因正义链中突变位点、突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型BRAF基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。
2.如权利要求1所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述正向引物或所述反向引物上包括人为突变位点；所述人为突变位点使得正向引物与突变型BRAF基因的反义链不能完全互补；或者所述人为突变位点使得所述反向引物与突变型BRAF基因的正义链不能完全互补。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述人为突变位点位于距正向引物3’端1-10个碱基位置；或者所述人为突变位点位于距反向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置。
4.如权利要求1所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列，所述阻断核苷酸序列能与对应于所述突变位点处的一段野生型BRAF基因的反义链互补。
5.如权利要求4所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述阻断核苷酸序列的3’端添加有2-5个相对于野生型BRAF基因的非互补碱基，或者添加有使阻断核苷酸序列本身不能延伸的3’端化学修饰。
6.如权利要求5所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述3’端化学修饰为3'ddC、3'反向dT(3'Inverted dT)、3'C3间隔子(3'C3spacer)、3'氨基(3'Amino)或3'磷酸化(3'phosphorylation)。
7.如权利要求1所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物扩增的片段为包括所述突变位点的60-120bp长度的序列。
8.如权利要求1所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的序列长度为15-35bp，退火温度为55-65℃。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-8中任一项所述的核苷酸序列组。
10.一种检测基因突变的方法，其特征在于，使用如权利要求1-8中任一项所述的核苷酸序列组进行PCR扩增。
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