CN115851935A - 一种用于met基因外显子14跳跃突变检测的引物探针组和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测技术领域,具体涉及一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的引物探针组和试剂盒,其中,引物探针组包括:靶标基因引物对MET‑E13‑F1和MET‑E15‑R1,序列如SEQ ID NO:1~2所示;探针MET‑13/15‑P1,序列如SEQ ID NO:3所示。本发明基于荧光定量PCR检测技术开发的c‑MET基因外显子14跳跃突变检测试剂盒灵敏度高,最低可检测到50拷贝/30ng的MET基因外显子14跳跃突变RNA,并且特异性好,假阳性低;操作简单安全,检测廉价,可以大规模推广;检测速度快,检测过程大约需要2小时就可完成。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域,具体涉及一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的引物探针组和试剂盒。
背景技术
肺癌是全球很常见的癌症类型,全球每年新发200万例左右,世界卫生组织(WHO)将肺癌分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC),其中NSCLC占85%以上。NSCLC的靶向治疗发展迅速,目前已获批准的靶向药物有EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)如吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达可替尼、奥希替尼、阿美替尼;ALK抑制剂如克唑替尼、塞瑞替尼、阿来替尼、恩沙替尼;ROS1抑制剂克唑替尼;BRAF/MEK抑制剂、MET抑制剂、RET抑制剂、ERBB2抑制剂等。随着靶向药物的不断发展和临床上的广泛应用,与之配合的分子伴随诊断变得必不可少。
间质表皮转化因子(c-Mesenchymal-epithelial transition factor,c-Met)是MET基因编码产生的具有自主磷酸化活性的跨膜受体,属于酪氨酸激酶受体超家族。c-Met的配体为肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)。当与配体HGF结合后,c-Met通过形成二聚体和近膜区域若干位点的磷酸化实现活化,激活下游的一系列信号通路,如PI3K-Akt、Ras-MAPK、STAT等,从而发挥促进细胞增殖、细胞生长、血管生成等效应。
但是,当c-Met异常激活时,如MET 14外显子跳跃突变、MET扩增、MET蛋白过表达,则可能启动正常细胞向肿瘤细胞转化,促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。MET通路异常激活在许多实体瘤中发生,包括脑癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、头颈癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、***癌和软组织癌等。对于非小细胞肺癌患者,c-Met/HGF信号通路与疾病的进展关系密切,约3%-5%的患者伴有MET信号通路改变,包括MET外显子14跳跃改变、MET扩增以及MET蛋白过度表达,其中MET外显子14跳跃突变占比2%-3%。对于接受第一代EGFR抑制剂治疗后出现耐药的NSCLC患者,大约50%的患者发生T790M+突变,另外还有10%的患者发生MET+/T790M-突变,而对于使用第三代EGFR抑制剂后出现耐药的患者,大约有30%的患者发生MET+突变。
目前,针对c-Met通路的治疗策略主要包括单克隆抗体和靶向MET基因的小分子TKIs。其中,小分子TKIs的发展已十分成熟,FDA已经批准克唑替尼、卡马替尼和特泊替尼用于治疗MET 14号外显子跳跃突变的转移性非小细胞肺癌成人患者。国内和黄医药的赛沃替尼于2021年6月22日在中国成功获批,是中国第一个上市的单靶点MET抑制剂。这为这类患者提供了治疗希望,但急需精准、高效、便捷的检测方法对潜在的患者进行筛选。
目前对于c-MET基因外显子14跳跃突变的检测常采用的方法有直接测序法、荧光定量PCR法。直接测序法检测步骤包括PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、产物切胶回收纯化、上机测序等步骤,步骤繁琐,耗费时间长,虽然检测成本较低,但其灵敏度也比较低,且假阴性率高。荧光定量PCR法是通过设计特异的探针和引物,结合荧光PCR检测技术来检测血液、外泌体或肿瘤组织中MET基因14外显子跳跃缺失的检测,但目前市场上用于检测MET基因14外显子跳读突变的实时荧光定量PCR的试剂盒非常少,且灵敏度较低,如公告号为CN106282339A的中国发明专利所描述的,其最低可检测到的MET基因外显子14跳跃突变RNA为450个拷贝数,并且需要额外加入BLOCK引物来提高特异性。少数研究机构使用高通量测序的方法,如公告号为CN106834515A的中国发明专利所描述的,利用该DNA探针库对MET基因14外显子及相邻内含子进行富集及检测,可以发现是否存在MET14外显子剪接突变,该方法灵敏度高,可以同时检测几十甚至几百个肿瘤相关基因,但是操作复杂,后期数据处理繁琐,检测周期长且检测的成本昂贵,对于操作和判读技术的要求很高,临床实际应用中仍存在许多不足。
发明内容
本发明以RNA为模板,基于荧光定量PCR检测技术开发的c-MET基因外显子14跳跃突变检测试剂盒灵敏度高,最低可检测到50拷贝/30ng的MET基因外显子14跳跃突变RNA,并且特异性好,假阳性低;操作简单安全,检测廉价,可以大规模推广;检测速度快,检测过程大约需要2小时就可完成。
本发明的第一方面,提供一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的引物探针组,包括:靶标基因引物对MET-E13-F1和MET-E15-R1,序列如SEQ ID NO:1~2所示;探针MET-13/15-P1,序列如SEQ ID NO:3所示。
MET-E13-F1:5’-tctcaatatcaacagcactgttattactactt-3’;
MET-E15-R1:5’-tgaaccgttctgagatgaattagg-3’;
MET-13/15-P1:5’-aagcaaattaaagatcagtttc-3’。
本发明的一实施方式中,探针MET-13/15-P1的荧光基团为FAM,淬灭基团为MGB。
本发明的一实施方式中,还包括内参基因引物对MET-E7-F3和MET-E8-R4,序列如SEQ ID NO:4-5所示;探针MET-7/8-P,序列如SEQ ID NO:6所示。
MET-E7-F3:5’-ttcaaatggccacgggac-3’;
MET-E8-R4:5’-gtaagtaaagtgccaccagccat-3’;
MET-7/8-P:5’-cctatgtggatcctgtaata-3’。
本发明的一实施方式中,探针MET-7/8-P的荧光基团为VIC,淬灭集团为MGB。
本发明的第二方面,提供一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒,包含有靶标基因引物对MET-E13-F1和MET-E15-R1,序列如SEQ ID NO:1~2所示;探针MET-13/15-P1,序列如SEQ ID NO:3所示序列。
本发明的一实施方式中,试剂盒中还包括内参基因引物对MET-E7-F3和MET-E8-R4,序列如SEQ ID NO:4-5所示;探针MET-7/8-P,序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明的一实施方式中,试剂盒中还包括MET基因外显子14跳跃突变的阳性对照。
本发明的一实施方式中,试剂盒中还包括MET基因外显子14跳跃突变的阴性对照。
本发明的一实施方式中,试剂盒最低可检测到50拷贝/30ng的MET基因外显子14跳跃突变RNA。
本发明的第三方面,提供一种待测样本中c-MET基因外显子14是否跳读的检测方法,包括如下步骤:
S-1.用上述引物探针对待测样本的RNA进行荧光PCR扩增,得到待测样本Exon13/15基因的扩增Ct值和内参基因Exon7/8的扩增Ct值;
S-2.利用下述公式进行计算:
待检样本靶标基因ΔCt=Ct_靶标基因-Ct_内参基因;
S-3.根据如下判定标准对检测样本中c-MET基因外显子14是否跳读进行定性分析;
判定标准:
a)若FAM信号Ct值≤37且ΔCt值(Ct值FAM-Ct值HEX/VIC)≤8,则该样本含有MET基因外显子14跳跃突变;
b)若FAM信号Ct值≤37但ΔCt值(Ct值FAM-Ct值HEX/VIC)>8,则该样本不含有MET基因外显子14跳跃突变或突变比例低于本试剂盒的检测下限;
c)若FAM信号Ct值>37,则该样本不含有MET基因外显子14跳跃突变或突变比例低于本试剂盒的检测下限。
通过实施上述的技术方案,本发明至少具有如下的有益效果:
1.对c-MET基因外显子14跳跃突变检测灵敏度高,最低可检测到50拷贝/30ng的MET基因外显子14跳跃突变RNA,并且特异性好,假阳性低;
2.只需要一对引物和一条探针即可对突变靶标进行检测,操作简单安全,检测廉价,可以大规模推广;
3.检测速度快,检测过程大约需要2小时就可完成。
附图说明
附图1为以阴性临床样本P1101244为模板、使用不同内参基因引物进行扩增的荧光曲线图;
附图2为以阳性临床样本P0124612为模板、使用不同内参基因引物进行扩增的荧光曲线图;
附图3为以阴性临床样本P0112806为模板、探针为MET-13/15-P1,使用不同靶标基因引物的荧光曲线图;
附图4为以阳性临床样本P1108025为模板、探针为MET-13/15-P1,使用不同靶标基因引物的荧光曲线图;
附图5为以阴性临床样本P0112806为模板、探针为MET-13/15-P2,使用不同靶标基因引物的荧光曲线图;
附图6为以阳性临床样本P1108025为模板、探针为MET-13/15-P2,使用不同靶标基因引物的荧光曲线图;
附图7为不同拷贝数梯度的样本和阴性细胞系样本PC-9样本的内参和靶标的荧光曲线图;
附图8为45例NSCLC FFPE阴性样本内参检测的荧光曲线图;
附图9为45例NSCLC FFPE阴性样本的靶标检测的荧光曲线图;
附图10为10例NSCLC FFPE阳性样本的内参检测的荧光曲线图;
附图11为10例NSCLC FFPE阳性样本的靶标检测的荧光曲线图。
附图1和附图2中,F1R1是指引物MET-E7-F1与MET-E8-R1的组合、F1R2是指引物MET-E7-F1与MET-E8-R2的组合、F1R3是指引物MET-E7-F1与MET-E8-R3的组合、F1R4是指引物MET-E7-F1与MET-E8-R4的组合、F2R1是指引物MET-E7-F2与MET-E8-R1的组合、F2R2是指引物MET-E7-F2与MET-E8-R2的组合、F2R3是指引物MET-E7-F2与MET-E8-R3的组合、F2R4是指引物MET-E7-F2与MET-E8-R4的组合、F3R1是指引物MET-E7-F3与MET-E8-R1的组合、F3R2是指引物MET-E7-F3与MET-E8-R2的组合、F3R3是指引物MET-E7-F3与MET-E8-R3的组合、F3R4是指引物MET-E7-F3与MET-E8-R4的组合、F4R1是指引物MET-E7-F4与MET-E8-R1的组合、F4R2是指引物MET-E7-F4与MET-E8-R2的组合、F4R3是指引物MET-E7-F4与MET-E8-R3的组合、F4R4是指引物MET-E7-F4与MET-E8-R4的组合。
附图3至附图6中,F1R1是指引物MET-E13-F1与MET-E15-R1的组合、F1R2是指引物MET-E13-F1与MET-E15-R2的组合、F1R3是指引物MET-E13-F1与MET-E15-R3的组合、F1R4是指引物MET-E13-F1与MET-E15-R4的组合、F2R1是指引物MET-E13-F2与MET-E15-R1的组合、F2R2是指引物MET-E13-F2与MET-E15-R2的组合、F2R3是指引物MET-E13-F2与MET-E15-R3的组合、F2R4是指引物MET-E13-F2与MET-E15-R4的组合、F3R1是指引物MET-E13-F3与MET-E15-R1的组合、F3R2是指引物MET-E13-F3与MET-E15-R2的组合、F3R3是指引物MET-E13-F3与MET-E15-R3的组合、F3R4是指引物MET-E13-F3与MET-E15-R4的组合、F4R1是指引物MET-E13-F4与MET-E15-R1的组合、F4R2是指引物MET-E13-F4与MET-E15-R2的组合、F4R3是指引物MET-E13-F4与MET-E15-R3的组合、F4R4是指引物MET-E13-F4与MET-E15-R4的组合。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明的范围。
实施例1
试剂盒中引物探针、反应体系及扩增条件的筛选
1.1RNA的提取
采用康为固定组织RNA提取试剂盒抽提4例阳性临床样本P0112220、P0112123、P0124612和P1108025,2例阴性临床样本P1101244和P0112806以及阴性细胞系PC-9的RNA,使用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度,确保RNA浓度大于30ng/μL且A260/A280在1.9-2.1之间、A260/A230大于1.7。
1.2内参基因exon7/8引物、探针序列的筛选
(1)引物设计
采用引物探针设计软件Primer Express 3.0.1设计内参基因的探针和引物,在c-MET基因7号外显子上设计上游引物4条,在8号外显子上设计下游引物4条,探针MET-7/8-P序列为5’-cctatgtggatcctgtaata-3’,探针位置在跨越7号外显子和8号外显子处,荧光基团为VIC,淬灭集团为MGB。各引物序列见下表1。
表1内参检测引物序列表
名称 | 序列(5’→3’) |
MET-E7-F1 | atggccacgggacaacac |
MET-E7-F2 | ccacgggacaacacaatacagt |
MET-E7-F3 | ttcaaatggccacgggac |
MET-E7-F4 | cgggacaacacaatacagtacattc |
MET-E8-R1 | cagccataggaccgtatttcg |
MET-E8-R2 | ccaccagccataggaccgtat |
MET-E8-R3 | aagtgccaccagccataggac |
MET-E8-R4 | gtaagtaaagtgccaccagccat |
(2)筛选优化过程
将不同的上下游引物组合测试,模板采用1例阳性临床样本P0124612和1例阴性临床样本P1101244的RNA,扩增试剂为艾科瑞的Evo M-MLV One Step RT-qPCR Kit(Probe)(UDG Plus),PCR扩增条件为25℃10min(UDG酶处理条件),逆转录42℃5min,95℃预变性30sec,95℃变性5sec、60℃退火34sec、45个循环,于60℃退火步骤末采集荧光信号。仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪,扩增体系见下表2。筛选扩增效果更好的引物组合,测试荧光曲线图如图1(阴性临床样本P1101244)、图2(阳性临床样本P0124612)所示,不同exon7/8引物对检测Ct值结果见下表3。结果表明,不同引物对于exon7/8基因检测结果相差较大,其中,MET-E7-F3和MET-E8-R4对exon7/8的扩增效果较好,因此,将MET-E7-F3和MET-E8-R4作为内参检测的引物对。
表2内参检测体系
成份 | 加入量 |
Template | 1uL |
2×buffer | 10uL |
RT酶 | 0.5uL |
MET-E7-F | 1uL |
MET-E8-R | 1uL |
MET-7/8-P | 0.5uL |
H<sub>2</sub>O | 6uL |
总体积 | 20uL |
表3不同内参引物组合的检测结果
1.3exon13/15引物、探针序列的筛选
(1)引物设计
根据c-MET基因14外显子跳读突变后exon13/15的保守区域,采用引物探针设计软件Primer Express 3.0.1设计检测c-MET基因exon14跳读的引物和探针,在13号外显子上设计上游引物4条,在15号外显子上设计下游引物4条,探针设计两条MET-13/15-P1和MET-13/15-P2,探针位置在跨越13号外显子和15号外显子处,探针荧光基团为FAM,淬灭基团为MGB,各引物序列见下表4。
表4突变检测引物探针序列表
名称 | 序列(5’→3’) |
MET-E13-F1 | tctcaatatcaacagcactgttattactactt |
MET-E13-F2 | aacagcactgttattactacttgggttt |
MET-E13-F3 | ttattactacttgggtttttcctgtgg |
MET-E13-F4 | gggtttttcctgtggctgaa |
MET-E15-R1 | tgaaccgttctgagatgaattagg |
MET-E15-R2 | ggcatgaaccgttctgagatg |
MET-E15-R3 | gtcggcatgaaccgttctg |
MET-E15-R4 | aggatactgcacttgtcggcat |
MET-13/15-P1 | aagcaaattaaagatcagtttc |
MET-13/15-P2 | caaattaaagatcagttt |
(2)筛选优化过程
将不同的上下游引物和探针组合测试,模板采用1例阳性临床样本P1108025和1例阴性临床样本P0112806的RNA,扩增试剂为艾科瑞的Evo M-MLV One Step RT-qPCR Kit(Probe)(UDG Plus),PCR扩增条件为25℃10min(UDG酶处理条件),逆转录42℃5min,95℃预变性30sec,95℃变性5sec、60℃退火34sec、45个循环,于60℃退火步骤末采集荧光信号。仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪,突变检测体系见下表5。筛选扩增效果和特异性最好的引物组合,测试荧光曲线图如图3(探针为MET-13/15-P1,阴性临床样本P0112806)、图4(探针为MET-13/15-P1,阳性临床样本P1108025)、图5(探针为MET-13/15-P2,阴性临床样本P0112806)、图6(探针为MET-13/15-P2,阳性临床样本P1108025)所示,不同突变引物探针组合的检测结果见下表6。结果表明,不同引物探针组合的检测结果相差较大,其中,MET-E13-F1和MET-E15-R1与探针MET-13/15-P1组合对突变的检测效果和特异性均较好。因此,将MET-E13-F1和MET-E15-R1作为突变检测的引物对,MET-13/15-P1作为突变检测探针。
表5突变检测体系
成份 | 加入量 |
Template | 1uL |
2×buffer | 10uL |
RT酶 | 0.5uL |
MET-E13-F | 1uL |
MET-E15-R | 1uL |
MET-13/15-P | 0.5uL |
H<sub>2</sub>O | 6uL |
总体积 | 20uL |
表6不同突变引物探针组合的检测结果
1.3扩增试剂的筛选
将筛选出的内参和靶标引物探针组合为双重反应体系,采用1例阳性临床样本P0112220和阴性细胞系PC-9(100ng/ul)的RNA进行扩增试剂的筛选,同时检测空白对照NTC,待选的扩增试剂分别为艾科瑞的Evo M-MLV One Step RT-qPCR Kit(Probe)(UDGPlus)、翌圣的HieffV Universal Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit(UDGplus)和诺唯赞的HiScript III U+One Step qRT-PCR Probe Kit。仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪,突变检测体系和PCR扩增条件按照试剂盒说明书进行。不同扩增试剂的检测结果见下表7。结果表明,艾科瑞试剂盒对突变的检测效果和特异性均较好。综合考虑,选择艾科瑞的Evo M-MLV One Step RT-qPCR Kit(Probe)(UDG Plus)作为扩增试剂。
表7不同扩增试剂的检测结果
1.4双重反应体系及反应条件优化
(1)双重反应体系中扩增buffer浓度优化
将筛选出的内参和靶标引物探针组合为双重反应体系,采用一例阳性临床样本P0112220和阴性细胞系PC-9(100ng/ul)的RNA作为测试样本进行扩增buffer浓度优化,模板上样量为1ul,扩增试剂为艾科瑞的Evo M-MLV One Step RT-qPCR Kit(Probe)(UDGPlus),扩增buffer加入量分别为8.5ul、9.5ul、10ul、10.5ul进行优化。PCR扩增条件为25℃10min(UDG酶处理条件),逆转录42℃5min,95℃预变性30sec,95℃变性5sec、60℃退火34sec、45个循环,于60℃退火步骤末采集荧光信号。仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪,PCR扩增后,比较靶标和内参检出Ct值情况,见表8。从靶标和内参检出Ct值情况来看,在野生性背景为100ng的情况下不同扩增buffer加入量的特异性均保持良好,扩增buffer加入量为10ul时,阳性样本P0112220(5ng/ul)的突变检出效果更好。综合考虑,选择扩增buffer加入量为10ul作为最优条件。
表8不同浓度的扩增buffer检测结果
(2)双重反应体系中RT酶浓度优化
将筛选出的内参和靶标引物探针组合为双重反应体系,采用一例阳性临床样本P0112220和阴性细胞系PC-9(100ng/ul)的RNA作为测试样本进行RT酶浓度优化,模板上样量为1ul,扩增试剂为艾科瑞的Evo M-MLV One Step RT-qPCR Kit(Probe)(UDG Plus),RT酶加入量分别为0.2ul、0.3ul、0.4ul、0.5ul进行优化。PCR扩增条件为25℃10min(UDG酶处理条件),逆转录42℃5min,95℃预变性30sec,95℃变性5sec、60℃退火34sec、45个循环,于60℃退火步骤末采集荧光信号。仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪,PCR扩增后,比较靶标和内参检出Ct值情况,见表9。从靶标和内参检出Ct值情况来看,RT酶加入量为0.3ul时,阴性细胞系的检出结果表明特异性更好,阳性样本的检出结果表明扩增效果相对较好。综合考虑,选择RT酶加入量为0.3ul作为最优条件。
表9不同浓度的RT酶检测结果
(3)双重反应体系中内参引物、探针浓度优化
采用一例阳性临床样本P0112123和阴性细胞系PC-9(100ng/ul)的RNA作为测试样本,模板上样量为1ul,内参引物加入量分别为0.4ul、0.8ul、1ul,内参探针加入量分别为0.2ul、0.5ul、0.8ul进行正交测试优化。扩增试剂为艾科瑞的Evo M-MLV One Step RT-qPCR Kit(Probe)(UDG Plus),PCR扩增条件为25℃10min(UDG酶处理条件),逆转录42℃5min,95℃预变性30sec,95℃变性5sec、60℃退火34sec、45个循环,于60℃退火步骤末采集荧光信号。仪器为ABI7500荧光定量PCR仪,PCR扩增后,比较靶标和内参检出Ct值情况,见表10。从靶标和内参检出Ct值情况来看,内参引物加入量为1ul,内参探针加入量为0.5ul时,阴性细胞系的检出结果表明特异性较好,阳性样本的检出结果表明扩增效果和荧光强度均较好。综合考虑,选择内参引物加入量为1ul,内参探针加入量为0.5ul为最优条件。
表10内参基因不同引物、探针浓度检测结果
(4)双重反应体系中靶标引物、探针浓度优化
采用一例阳性临床样本P0112123和阴性细胞系PC-9(100ng/u1)的RNA作为测试样本,模板上样量为1ul,靶标引物加入量分别为0.4ul、0.8ul、1.2ul、1.6ul、2ul,靶标探针加入量分别为0.2ul、0.5ul、0.8ul、1.2ul、1.6ul进行正交测试优化。扩增试剂为艾科瑞的EvoM-MLV One Step RT-qPCR Kit(Probe)(UDG Plus),PCR扩增条件为25℃10min(UDG酶处理条件),逆转录42℃5min,95℃预变性30sec,95℃变性5sec、60℃退火34sec、45个循环,于60℃退火步骤末采集荧光信号。仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪,PCR扩增后,比较靶标和内参检出Ct值情况,见表11。从靶标和内参检出Ct值情况来看,靶标引物加入量为2ul,靶标探针加入量为0.5ul时,阴性细胞系的检出结果表明特异性较好,阳性样本的检出结果表明扩增效果较好。综合考虑,选择靶标引物加入量为2ul,靶标探针加入量为0.5ul为最优条件。
表11靶标基因不同引物、探针浓度检测结果
(5)双重反应体系扩增程序优化
采用一例阳性临床样本P0112123和阴性细胞系PC-9(100ng/ul)的RNA作为测试样本,模板上样量为1ul,扩增试剂为艾科瑞的Evo M-MLV One Step RT-qPCR Kit(Probe)(UDG Plus),在保持PCR扩增程序中其他变量不变的情况下,分别设置反转录温度50℃、55℃;反转录时间10min、15min;预变性时间2min、5min;退火温度58℃、62℃;循环数43、47对扩增程序进行优化。PCR扩增后,比较靶标和内参检出Ct值情况,见表12。从靶标和内参检出Ct值情况来看,当PCR扩增程序中其他变量不变的情况下,设置循环数43时,阴性细胞系的检出结果表明特异性较好,阳性样本的检出结果表明扩增效果较好,为最优条件。
表12不同扩增程序检测结果
(6)试剂盒组分及其检测方法
经过一系列的调整优化,试剂盒最终所确定引物探针序列、组成成分和荧光定量PCR反应体系及扩增程序分别见表13、表14、表15、表16所示。
表13试剂盒中靶标和内参的引物探针序列
名称 | 序列(5’→3’) | 5’端修饰基团 | 3’端修饰基团 |
Exon13上游引物 | tctcaatatcaacagcactgttattactactt | - | - |
Exon15下游引物 | tgaaccgttctgagatgaattagg | - | - |
Exon13/15探针 | aagcaaattaaagatcagtttc | FAM | MGB |
Exon7上游引物 | ttcaaatggccacgggac | - | - |
Exon8下游引物 | gtaagtaaagtgccaccagccat | - | - |
Exon7/8探针 | cctatgtggatcctgtaata | VIC | MGB |
表14试剂盒组成成分
表15试剂盒反应体系
表16试剂盒反应程序设置
分析条件设置:ABI 7500仪器结果分析时使用仪器默认基线和默认阈值。FAM通道和HEX/VIC通道扩增曲线呈现“S”型扩增才可计算Ct值。
试剂盒检测方法:
建议在每次PCR反应中,每份样本和MET阳性对照品、阴性对照(NTC,自备纯化水)共同进行分析。
1.试剂准备:(试剂准备区)
1)从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温,各组分充分融解,快速离心10秒。
2)核算当次实验所需要的反应数(n),并根据表3反应体系配制方法计算当次实验所需要的各种试剂量,按照计算结果配制PCR反应混合液。
n=样本数+空白对照(1T)+阳性对照(1T)
表17PCR反应混合液配制方法
名称 | 单反应体系配方 | n个反应体系配方 |
MET反应液A | 7uL | 7×n uL |
MET反应液B | 10uL | 10×n uL |
MET RT酶 | 0.3uL | 0.3×n uL |
Nuclease free water | 1.7uL | 1.7×n uL |
3)按照19uL每孔分装量将配制好的PCR反应混合液分装至PCR反应管中。
4)PCR反应管转移至样本准备区。剩余试剂放回-20℃±5℃冰箱冷冻避光保存。
2.样本准备:(样本准备区)
1)样本RNA提取:参考所购买的商用FFPE-RNA提取试剂盒说明书进行操作。
2)加样:
a)将待测样本的FFPE-RNA、阳性对照、空白对照,分别加入已分装有PCR反应混合液的反应管中。加入量为1uL/孔。待测样本的FFPE-RNA推荐浓度为30-50ng/uL。
b)检测。若PCR反应管内加入模板后遇临时情况不能立即上机,建议将加好模板的PCR反应管放于2~8℃暂时保存,并在24小时内尽快上机检测。
3.PCR扩增:(核酸扩增区)
1)开机,并进行仪器性能自检。
2)取样本准备区准备好的PCR反应管,放置在仪器样品槽相应位置,并记录放置顺序。
3)按照表15设置PCR的反应条件:
4.结果分析
反应结束后,计算ΔCt(ΔCt=突变检测Ct-质控检测Ct)并进行结果判读。
结果判读方法:
1.按照单一荧光信号进行分析,同时选择阳性对照反应管、样本反应管和阴性对照反应管,根据阈值线要求设置阈值线,得到各反应管的Ct值。
2.阴性对照的FAM信号应无扩增曲线升起。若FAM信号有扩增曲线升起,则此次实验结果无效,建议重新检测。
3.阳性对照的FAM和HEX/VIC信号应有扩增曲线升起,且其Ct值一般小于35。
4.样本HEX/VIC信号扩增Ct值:
a)若Ct值≤37,则继续分析;
b)若Ct值>37,说明RNA可能存在片段化或降解或抑制剂或漏加或MET基因表达量低于本试剂盒检测下限,建议重新检测或重新提取RNA后再进行检测。
5.样本阴阳性判定:
a)若FAM信号Ct值≤37且ΔCt值(Ct值FAM-Ct值HEX/VIC)≤8,则该样本含有MET基因外显子14跳跃突变;
b)若FAM信号Ct值≤37但ΔCt值(Ct值FAM-Ct值HEX/VIC)>8,则该样本不含有MET基因外显子14跳跃突变或突变比例低于本试剂盒的检测下限;
c)若FAM信号Ct值>37,则该样本不含有MET基因外显子14跳跃突变或突变比例低于本试剂盒的检测下限。
实施例2
试剂盒检测灵敏度测试
本实验在实施例1获得的结果的基础上进行,将阳性细胞系样本H596(30ng/ul)用阴性细胞系样本PC-9(30ng/ul)分别稀释至200拷贝、150拷贝、100拷贝、75拷贝、50拷贝,按照试剂盒优化后的反应体系及反应条件进行检测,同时检测阴性细胞系样本PC-9(30ng/ul),以说明所述试剂盒的高灵敏度的特点。具体的实验操作如下:
2.1实验操作
(1)提取RNA
采用康为固定组织RNA提取试剂盒抽提阳性细胞系FFPE样本H596和阴性细胞系FFPE样本PC-9的RNA,使用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度,确保RNA浓度大于30ng/μL且A260/A280在1.9-2.1之间、A260/A230大于1.7,将两例样本的RNA浓度稀释至30ng/ul,采用数字PCR定量阳性细胞系样本H596中的拷贝数,并用阴性细胞系样本PC-9(30ng/ul)梯度稀释至200拷贝、150拷贝、100拷贝、75拷贝、50拷贝,其拷贝数浓度分别为200拷贝/30ng、150拷贝/30ng、100拷贝/30ng、75拷贝/30ng、50拷贝/30ng。
(2)PCR检测
PCR检测稀释后的不同拷贝数梯度的样本,同时对阴性细胞系样本PC-9(30ng/ul)进行检测,本实验采用的引物、探针如表13所示,反应体系如表15所示,反应程序如表16所示。
(3)结果分析
不同拷贝数梯度的样本和阴性细胞系样本PC-9样本的内参和靶标CT值及ΔCt值结果见表18,荧光曲线见图7。
表18灵敏度测试结果
因此,本发明对野生背景为30ng FFPE样本RNA中含有50拷贝的MET基因外显子14跳跃突变RNA可准确检出,检测灵敏度低至50拷贝/30ng。
实施例3
试剂盒检测准确性测试
本实验在实施例1获得的结果的基础上进行,对经过NGS验证的45例NSCLC FFPE阴性样本和10例NSCLC FFPE阳性样本进行考察以说明所述试剂盒的高特异性、高准确性等特点。具体的实验操作如下:
(1)提取RNA
采用康为固定组织RNA提取试剂盒抽提45例NSCLC FFPE阴性样本和10例NSCLCFFPE阳性样本的RNA,使用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度,确保RNA浓度大于30ng/μL且A260/A280在1.9-2.1之间、A260/A230大于1.7。
(2)PCR检测
本实验采用的引物、探针如表12所示,反应体系如表14所示,反应程序如表15所示。
(3)结果分析
不同NSCLC FFPE临床样本的内参和靶标CT值及ΔCt值结果见表19,荧光曲线见图8(45例NSCLC FFPE阴性样本内参检测)、荧光曲线见图9(45例NSCLC FFPE阴性样本的靶标检测)、荧光曲线见图10(10例NSCLC FFPE阳性样本的内参检测)和图11(10例NSCLC FFPE阳性样本的靶标检测)。
表19不同NSCLC FFPE临床样本检测结果
因此,本发明对NSCLC FFPE样本检测的准确性好。
通过上述具体的实施例对本发明技术方案的详细介绍,可以明显看出本发明的技术方案在检测MET基因外显子14跳跃突变的灵敏度和特异性上均具体明显的优势,最低可检测30ng基因组背景下50拷贝的MET基因外显子14跳跃突变RNA。本发明采用的基于荧光定量PCR平台的多重RT-PCR技术,能做到如此的高灵敏度和高特异性取决于多种因素,至少包括:
1)引物和探针的设计和筛选,通过对靶基因区域的特异性选择,引物、探针的序列、结构以及退火温度的选择,防止多条引物探针之间的干扰或交叉反应等方法确定最佳的引物探针;
2)RT-PCR反应体系的设计和优化,不同的引物探针可能适配不同的酶催化体系、反应缓冲液环境等,需要对反应体系中的buffer、酶及引物探针的用量等进行反复选择优化;
3)反应体系的抗干扰能力,临床样本中可能含有来自样品的抑制剂和其他干扰物质,需要对核酸提取、引物探针、反应体系等进行反复测试和优化,并经过临床样本验证确定所用引物探针、试剂等的最佳浓度;
4)不同扩增程序的选择,多重反应时,各基因的扩增效率不一致,扩增程序中不同变量的改变可能产生的扩增效果不一样,需要对各程序变量进行筛选及验证。
因此,本发明是在引物探针设计、反应体系、扩增程序等方面上进行了反复设计筛选、大量实验优化和测试验证,优选出的最佳解决方案,为MET基因外显子14跳跃突变的检测提供了即快速简便、低成本又高灵敏度、高特异性的检测方法。
Claims (10)
1.一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的引物探针组,其特征在于,包括:
靶标基因引物对MET-E13-F1和MET-E15-R1,序列如SEQ ID NO:1~2所示;探针MET-13/15-P1,序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的引物探针组,其特征在于,还包括:
内参基因引物对MET-E7-F3和MET-E8-R4,序列如SEQ ID NO:4-5所示;
探针MET-7/8-P,序列如SEQ ID NO:6所示。
3.一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒,其特征在于,包含:有靶标基因引物对MET-E13-F1和MET-E15-R1,序列如SEQ ID NO:1~2所示;
探针MET-13/15-P1,序列如SEQ ID NO:3所示序列。
4.根据权利要求3所述的一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒,其特征在于,试剂盒中还包括:
内参基因引物对MET-E7-F3和MET-E8-R4,序列如SEQ ID NO:4-5所示;
探针MET-7/8-P,序列如SEQ ID NO:6所示。
5.根据权利要求3或4所述的一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒,其特征在于,试剂盒中还包括PCR buffer、镁离子、 dNTPs、Taq 酶、UNG 酶、RT酶。
6.根据权利要求5所述的一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒,其特征在于,试剂盒中还包括MET基因外显子14跳跃突变的阳性对照。
7.根据权利要求5所述的一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒,其特征在于,试剂盒中还包括MET基因外显子14跳跃突变的阴性对照。
8.根据权利要求5所述的一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒,其特征在于,使用该试剂盒进行检测时,反应体系为:PCR buffer 10 uL、RT酶0.3 uL、MET-E13-F1 2uL、MET-E15-R1 2 uL、MET-13/15-P1 0.5 uL、MET-E7-F3 1 uL、MET-E8-R4 1 uL、MET-E7/8-P 0.5uL、模板1 uL、H2O1.7 uL,总体积20uL。
10.根据权利要求3所述的一种用于MET基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒,其特征在于,该试剂盒最低可检测到50拷贝/30ng的MET基因外显子14跳跃突变RNA。
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