CN110951746A - MtFRUITFULLc基因在调控豆科植物叶片产量及蛋白含量中的应用 - Google Patents

MtFRUITFULLc基因在调控豆科植物叶片产量及蛋白含量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了MtFRUITFULLc基因在调控豆科植物叶片产量和/或叶片蛋白含量和/或株高和/或开花中的应用，所述MtFRUITFULLc基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明利用蒺藜苜蓿Tnt1标记的突变体库，筛选到蒺藜苜蓿MtFRUITFULLc基因敲除突变体。分析表明在蒺藜苜蓿中敲除MtFRUITFULLc基因可以在生殖期使植株株高、地上部分鲜重以及叶片蛋白含量均有所提高。预示本发明实施后将会创造新型豆科牧草植物，可用于后续的牧草品质研究，对我国草业生产具有重大意义。

Description

MtFRUITFULLc基因在调控豆科植物叶片产量及蛋白含量中的 应用
技术领域
本发明涉及MtFRUITFULLc基因在调控豆科植物叶片产量及蛋白含量中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
苜蓿是一种重要的豆科牧草，也是当今世界栽培最广的多年生优质牧草。随着我国经济水平的快速增长，人们对于奶制品的需求空前提高，促使了我国草食畜牧业和奶业的快速发展，从而也导致国内对于高质量苜蓿的需求日益增长。但是目前国产苜蓿供应短缺，产业发展形势严峻，存在产量少、品质差、货源不稳定等问题。因此提高苜蓿的产量和品质是我国草业、畜牧业和奶业发展的重大迫切需求。
苜蓿的产草量主要以叶和茎为主，叶最多可贡献产草量的60％。叶片不仅是苜蓿生长发育、产量构成和品种特性的重要指标，更是栽培管理及病虫害监测的主要研究对象。而且叶片储藏了苜蓿70％的蛋白质，因此叶片所占比重越大，苜蓿的营养价值就越高，适口性就越好，同时利用价值也就相对越高。此外，牧草的收割多在初花期进行，初花期或以前刈割的牧草，颜色较青绿、气味芳香、叶量丰富、茎秆质地柔软、营养成分高、消化率高，开花结束后刈割，茎秆粗硬、叶量少且枯黄、其适口性及可消化率下降、品质低劣。所以开花期的早晚对于苜蓿具有产量和品质两方面的影响，一方面开花期提前会导致叶片产量降低，另一方面开花后叶片中的蛋白含量也会下降，因此选育叶量丰富、开花晚的苜蓿新品种一直是苜蓿育种工作者追求的目标。目前苜蓿叶片增多和开花延迟的性状已被作为形态学标记，被认为具有高产和优质的潜力。
植物的叶发育模式分为单叶和复叶，单叶结构指的是在一个叶柄上只有一个小叶片，而复叶结构指的是在一个叶柄上有多个小叶片生成，蒺藜苜蓿的叶为复叶结构，包括一个顶端叶和两个侧叶。植物的花序结构分为简单花序和复合花序，简单花序指进入生殖期后，顶端分生组织转变为初级花序，花朵直接长在初级花序上，而苜蓿的花序结构为复合花序，指进入生殖期后，顶端分生组织转变为初级花序，初级花序会分化出次级花序，花朵长在侧向的次级花序上。
在选育苜蓿新品种的过程中，多被关注于苜蓿小叶数量的改造上，到目前为止，只有少数小叶数量增多的苜蓿品种被商业化，但是这些品种出现小叶数量增多频率低，性状不能稳定遗传等现象，导致在生产上并未表现出明显优势。此外，牧草在进入开花期后，产草量和牧草品质都会降低，导致牧草的种植受到土壤胁迫、冻害、高温等自然条件的限制。基于以上原因，对苜蓿复叶发育分子机制进行研究，通过基因工程改造直接提高苜蓿叶片产量可为苜蓿优质新品种的分子设计改良和育种提供理论基础和技术手段，有助于高产优质的苜蓿新品种的培育。
发明内容
针对上述现有技术，针对现有苜蓿品种小叶数量增多频率低、性状遗传不稳定、开花后利用率降低的缺点，本发明通过研究发现，敲除蒺藜苜蓿的MtFRUITFULLc基因可提高苜蓿叶片数量和叶片蛋白含量，从而提高苜蓿的产量和质量。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本申请的发明人分离了蒺藜苜蓿MtFRUITFULLc基因的敲除突变体株系，这是首次在蒺藜苜蓿中获得该基因的突变体植株。实验研究表明，蒺藜苜蓿MtFRUITFULLc基因参与了调控叶片数量和叶片蛋白含量，并可通过敲除该基因的方式得到叶片数量和叶片蛋白含量高于野生型植株的转基因豆科植物。
MtFRUITFULLc基因在调控豆科植物叶片产量和/或叶片蛋白含量和/或株高和/或开花中的应用，所述MtFRUITFULLc基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述豆科植物，选自苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草等。
MtFRUITFULLc基因在制备转基因豆科植物中的应用。具体应用时，敲除豆科植物种子或植株中的MtFRUITFULLc基因，从而获得转基因豆科植物，其叶片产量和/或叶片蛋白含量和/或株高高于野生型豆科植物。
一种通过敲除MtFRUITFULLc基因获得转基因豆科植物的方法：敲除豆科植物种子或植株中的MtFRUITFULLc基因，从而获得转基因豆科植物，其叶片产量和/或叶片蛋白含量和/或株高高于野生型豆科植物。
本发明利用构建的突变体群体，筛选出MtFRUITFULLc基因的敲除突变体株系，发现植株在生殖期时无法产生次级花序，初级花序持续分化长出侧枝，代替花的形成，植株始终不能开花，突变体株系在生殖期相比野生型能持续产生更多的叶片，植株叶片数量增加，地上部分重量增加，株高增加，同时叶片蛋白含量增加。实验表明，敲除MtFRUITFULLc基因获得的植株相比于野生型，株高约提高20％，地上部分鲜重约提高66％，叶片蛋白含量约提高18％,这一数据远高于目前现有的苜蓿品种，并且MtFRUITFULLc基因的敲除突变体植株持续进行营养生长，不会开花，大大延长使用寿命，可以解决开花后牧草利用率降低的问题。应用本发明的技术，可显著提高转基因植物的叶片数量和蛋白含量，预示本发明实施后将会创造新型豆科牧草植物，可用于后续的牧草品质，对我国草业生产具有重大意义。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：MtFRUITFULLc的基因结构，方框代表外显子，突变体***在第二个外显子区域。
图2：100天时MtFRUITFULLc基因突变体植株与野生型植株。
图3：野生型和MtFRUITFULLc基因突变体植株的株高统计示意图。
图4：野生型和MtFRUITFULLc基因突变体植株的地上部分鲜重统计示意图。
图5：野生型和MtFRUITFULLc基因突变体植株的叶片蛋白含量测定示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1蒺藜苜蓿MtFRUITFULLc基因突变体的获得和鉴定
利用Thermal asymmetric interlaced-PCR(TAIL-PCR)技术，筛选了蒺藜苜蓿Tnt1标记的突变体库，在22000个突变体株系中筛选出Tnt1***到MtFRUITFULLc基因中的突变体株系NF10716。分子生物学鉴定结果表明，Tnt1***到MtFRUITFULLc基因的第二个外显子(图1)。蒺藜苜蓿MtFRUITFULLc基因突变体在生殖期不会开花，并持续产生新的叶片(图2)。
实施例2蒺藜苜蓿MtFRUITFULLc基因突变体植株的生物量测定
对蒺藜苜蓿MtFRUITFULLc基因突变体植株的地上部分进行表型分析和生物量测定，结果表明，在进入生殖期后的同一生长时期时，突变体植株的叶片明显较野生型多，与野生型相比，突变体植株株高约提高20％(图3)，地上部分鲜重约提高66％(n＝10)(图4)。
实施例3蒺藜苜蓿MtFRUITFULLc基因突变体植株的叶片蛋白含量测定
对蒺藜苜蓿MtFRUITFULLc基因突变体植株的叶片蛋白含量进行测定，结果表明，在进入生殖期后的同一生长时期时，突变体植株的叶片蛋白含量相比野生型提高约18％(R2＝0.9944)(图5)。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 山东大学
<120> MtFRUITFULLc基因在调控豆科植物叶片产量及蛋白含量中的应用
<140> 2019110460470
<141> 2019-10-30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6886
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 1
attggtggta gctaggttaa acaaaaaaaa aatcattcat catcatggga aggggtaggg 60
ttcagctgaa acggatcgag aacaaaacaa gccaacaagt aacttttttc aaaagaagaa 120
ctggacttct caagaaagct aatgaaattt ctgttctttg tgatgctcaa gttgctttga 180
ttatgttctc taccaaagga aaactttttg agtattcctc tgcaccaagg ttagttaatt 240
aattagtttg cttcacttat atatatccac tattttattt ccatttttgg ggttattaat 300
ttctatatat catatatata cttttgattg ttttggatcc atcttttttc aacatcatca 360
tcaaaatcta gttaaggaaa cttttgattt ttttaataat aataaataat atatagatcc 420
taattaatta ttttctttgt tgttgtcatg tgatgtatgt caatatattt acatttttat 480
tataatcaag aagatgttaa ttaattaata tagatatata cattttttgt ttaaaatcat 540
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ttgaagttta tgtgtttaat agtctcccat tttgacctat gaaacagtat ggaagacatt 3900
ttggagcgat atgagagaca aaatcataca gaacttactg gagctaccaa tgaaacacag 3960
gtacttcact tgaaaacata aatttctatt gaatattaca aagaaaaaca ataaatttaa 4020
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catagtaatt gggataattt ttttgtaggg aaattggtct tttgaataca tgaagctcac 4140
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cgacacttgc acgatgcagc agctatgatg gatccgaact cttccacgtg catctggatc 4320
cccccccccc cccccctact gcaccatgca gcggattgca ggaccgttta gataggaatg 4380
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ggagatccaa actcaacacg gaaaatgagt ttgacaatcc ttttgcggtc ttcgttttaa 4500
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aaatataaat aaatagaaat aataagtgct aacataagaa taacatttaa tccaaatgta 4620
gctattttgg tagggttttc tttttactgg gaacaattca tttgcaaact cttccacatg 4680
catctggatc ctctattgca ccatgcagcg gtttgcagga ccgttgtatc taacggccct 4740
gcagccctct gtactttgca gtaattatag gggatcgaaa ctcaatgaat ttaacaatca 4800
ttttgcgctc tttgttttta caatgaacac aatatcgata tgaagctatt ttcctatagt 4860
gttttgtttt tactgggaac aattcatttg ctaaatagta ttcatcaatt acattatgtg 4920
ctagatgttt caaaatcaat aatattatgg aaaaaaaaaa tatactatat accttatatc 4980
atcttcaata taggaacttt gtgggaaatg atctggaccc tttgagtgtg aaagagctgc 5040
agagtttgga gcaacagctt gacacttcgc taaagcgaat ccgaacaaga aaggtaagaa 5100
tgtttattct ttaacaagaa aaaagaagag aataaatgag ttaacatttg atttttcagc 5160
tgaggatcaa ttaactgatc aatatgattt ttgcagaacc aagttatgaa tcaatccatc 5220
tcagagctgc ataaaagggt aagatattta tgttatagat ttgatttaat ttttctaaaa 5280
ttgaatactt acaataagta cattgaatga cacaaaaaag tgaccagtat cagaatatct 5340
ttgatatact ttttggaaat gaatttcata tgcaaattgc aatgacatgt taaagctaag 5400
tgatatatat aacaaaattg tttgatactt cacaagcaat taaatcatat gccatttgag 5460
tattatctta gatatcattt gtgaagtgta actagttttc atataaatgg aagcaagatt 5520
tttcacataa attttttaga tatataaata taaatataaa actttgctat gtatatgaca 5580
ggcaaggaca ttgcaggagc aaaacaacaa gctagcaaag gtagaattca catttctctc 5640
taacatttca gcatacaaat agggtttcaa ataaaggtct gcgatcgcaa cgtgagctgc 5700
aacacaacac ttttttatgt tgtcaaaccc gcaatgcgac tgcaattgag gccccattgg 5760
ccgtatttta ttgtgattct ccgtaatatc aagaatcgca acatagctgc aactgctacc 5820
acgactgtta tttaaaacct tctagccaat aaagggaagt aaaataaaaa gactaatgtt 5880
ttattacatt tatgtttaga caaaggagaa agagaagaca gtgagtgaac atccacaaag 5940
atgcctagaa accataggca tagggcaatg ttcatccacc ctcaacttaa tttgtcagcc 6000
agaggtgcta ccaccaccac aaagactggt tccttctcta aatctcaggt atttcttttc 6060
ccttctaagc ataatgtaga tcctaatatg atttaggaac tacatattga tgttgttaaa 6120
tagccacact acagtgctat agtgtagcag aatttggaca aatcgttaat gttccacaat 6180
acgctatata gtacaaaatg ttgtcaaata acgactatag tggccctatg ggttagcgaa 6240
aatttaacaa accgctatat tccatgattt gcatttgtca tcattacata caaatataac 6300
tcacttgagt tggtccggtg atcttggttt aagaccttag aatgtgcacc ttttaaagtt 6360
ctcaggttcg aatctccctg atgtcaattt cggtggacta gtttgacttc ttaaaaaaaa 6420
aaaaaaaaac aaattacata caaacataca ttcctatata tacatatgtg tgtgtacatg 6480
catgtagcaa attttgttga gacaatgtta gcaagcaatg tacattgttg tactatgata 6540
ataaaatgtg tgaaaatgat gtgtggatgg gtgcagtggg actttacaag caagaggatc 6600
attggaattt gaagaagcag gtgaagctca aactgttcct agaagcaatc atagtctcat 6660
accaccatgg atgctccatc atctcaccaa ctagattgac atctatgtat ttatgtatgt 6720
atgtgaaaga catattttat tattattatt attattatta ttattattat taaatctgta 6780
tgatgaatgt gtaagtaagc cttatattaa ggcatcaact cttctgttat ataagggccc 6840
tgccctgctc ttcatatttc aaatcaatga gaatgcagtc tttcct 6886

Claims (8)

1.MtFRUITFULLc基因在调控豆科植物叶片产量和/或叶片蛋白含量和/或株高和/或开花中的应用，所述MtFRUITFULLc基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：MtFRUITFULLc基因在提高豆科植物叶片产量和叶片蛋白含量中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述豆科植物选自苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草。
4.MtFRUITFULLc基因在制备转基因豆科植物中的应用，所述MtFRUITFULLc基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述豆科植物选自苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：具体应用时，敲除豆科植物种子或植株中的MtFRUITFULLc基因，从而获得转基因豆科植物，其叶片产量和/或叶片蛋白含量和/或株高高于野生型豆科植物。
7.一种通过敲除MtFRUITFULLc基因获得转基因豆科植物的方法，其特征在于：敲除豆科植物种子或植株中的MtFRUITFULLc基因，从而获得转基因豆科植物，其叶片产量和/或叶片蛋白含量和/或株高高于野生型豆科植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述豆科植物选自苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草。
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