CN102168086B - 蝴蝶兰miR172编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体为蝴蝶兰miRNA172序列及其应用。本发明包含蝴蝶兰全基因组中克隆出的miR172基因的编码序列，基因表达模式分析，在拟南芥中的转基因表达载体构建，引物序列，转基因纯系植株，以及相应表型。蝴蝶兰miRNA172在拟南芥中表达，能促使顶端分生组织活跃，表现为提前开花。

Description

蝴蝶兰 miR172 编码序列及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及蝴蝶兰miR172及其应用，包含蝴蝶兰miR172的蝴蝶兰转基因表达载体，引物序列，转基因纯系植株，以及通过纯系植株所验证的该基因的功能应用。

背景技术

蝴蝶兰（Phalaenopsisamabilis）属于被子单子叶植物兰花纲蝴蝶兰科，是一种气生兰花，有气根，能吸收空气中的养分而生存。多生长于亚洲热带潮湿地区，适应高温高湿通风的环境。单茎短，叶片肉质肥厚，花朵形似展翅的蝴蝶，颜色鲜艳多彩，是一种重要的经济花卉，近年来越来约受到消费者的喜爱。具有很好的经济效益。但是蝴蝶兰开花周期很长，一般2年以后才能开花。而且其成花要求的条件很严格，无法实现周年开花。目前主要催花的方法是通过春化作用，低温诱导开花。但是低温催花的耗电量大，增加了培养成本，而且能源的过量消耗不符合可持续发展的战略要求。同时，低温催花需要很好的密闭环境，容易滋生灰霉菌等真菌病害，降低了经济效益。由于miR172对开花具有促进作用，一经过量表达，即可显著促进植物开花。对蝴蝶兰成花途径相关miR172的研究和进一步应用有助于低成本的实现蝴蝶兰周年催花，具有很强的实践意义。

microRNA是一类参与动植物发育、细胞***分化时间调控的重要基因，位于非编码区，表达时转录后经过剪切加工形成长度在21nt左右的短核苷酸分子。MicroRNA基因不编码蛋白质，而是通过编码形成小分子RNA引发靶基因mRNA的裂解或与之特异性结合从而抑制把基因的表达，这种调控机制依赖于microRNA基因编码的microRNA序列与之所调控的目的基因序列所存在的不同程度的互补（David et al., 2004）。MicroRNA的研究最早开始于20世纪九十年代 (Wightman et al., 1993) ，但局限于动物microRNA。2003年Lee等人发表了miR172在植物开花过程中的功能研究，首次证明microRNA在植物发育过程中也同样存在重要的作用，其中miR172之后被证明是调控开花和发育的重要基因 (Aukerman et al., 2003) ，属于AP2 基因家族，并被定位在调控开花的光周期通路中（Schmid et al., 2003）。目前已克隆该基因的植物有拟南芥，玉米，苹果等。MiR172在不同物种中的作用也有细微的差别，例如在拟南芥中主要表现为促进开花和引发干旱逃逸（Schmid et al., 2003），在玉米中更多地参与花朵性别决定和细胞***的控制 (Jae-Hoon Jung et al., 2007) 。但在具有经济价值的高等观赏植物中却鲜有报道。

本发明通过设计引物，首次从蝴蝶兰全基因组中获得蝴蝶兰miR172基因；经过PCR扩增后电泳分离纯化获得长度约250bp的片段；并且通过原位杂交、mRNA分离验证了该基因的表达；以农杆菌质粒为载体将miR172转基因到拟南芥中表达；通过育种筛选培养出具有明显表型：早花和顶端分生组织活跃的转基因拟南芥，充分证明了蝴蝶兰miRNA的功能。为miRNA172在植物中功能的全面了解提供了可靠的理论基础和实践经验。

发明内容

本发明的目的在于通过将单子叶植物蝴蝶兰的miR172基因转入双子叶植物拟南芥中，获得具有明显表型的纯系植株，并鉴定PhmiRNA172在转基因植株中的表达，验证蝴蝶兰miRNA172的功能。

本发明提供首次克隆得到蝴蝶兰miRNA172基因序列，以及其编码的miRNA172的二级结构。该基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供用于从蝴蝶兰全基因组序列中，根据同源miRNA172保守特异性区域两端非保守区域设计的引物序列，该引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示 。

本发明还提供含有上述基因的 用于转基因的pHB植物表达载体。该载体含有如SEQ ID NO.1所示的目的基因序列和潮霉素抗性标记基因，可转入农杆菌并侵染拟南芥，能稳定遗传。

本发明所述载体在拟南芥开花和顶端分生组织调控中发生作用，具体转基因操作步骤如下：

（1）将编码序列可操作的连接于植物表达载体，形成含有SEQ ID NO.1序列的表达载体；

（2）将步骤（1）中的表达载体转化拟南芥；

（3）通过抗生素筛选，RT-PCR鉴定，获得转基因阳性单株，自交获得转基因纯合体，该纯合体开花提前，顶端分生组织活跃。

本发明还提供一种用于检测蝴蝶兰花苞内miR172表达量的方法，包括用SEQ ID NO.1所示序列制备RNA探针与蝴蝶兰花苞石蜡切片样本杂交，检测探针是否发生结合。

本发明还提供一对用于扩增PhmiR172在蝴蝶兰中的靶基因TOE1的引物序列。该序列如：

Ph-TOE1-F: AAGTTCACAGTATAGAGG （SEQ ID NO.4）

Ph-TOE1-R: GCATGCCTGCAGGTCGAC （SEQ ID NO.5）

本发明还提供一种用于鉴定蝴蝶兰中PhmiR172表达量的方法，包括用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所述引物分别对样品进行半定量PCR反应，然后比较蝴蝶兰不同器官中miR172和TOE1表达情况。

本发明还提供一种用于检测转基因拟南芥中是否存在PhmiR172的方法，包括用 PhmiR172的引物 ：

PhmiR172-F：5’ GCC AAG CTT GTG TTT GCG GGC GTG GCA TCA TCA AGA TTC 3’ （SEQ ID NO.2）

PhmiR172-R：5’GCG AGC TCT TGT CTG CGG ATG CAG CAT CAT CAA GAT 3’ （SEQ ID NO.3）

对样品进行PCR反应，然后检测是否扩增出目的片段，若有则该样品来自转基因拟南芥。

本发明还包括具有以上两种蝴蝶兰miRNA172基因的拟南芥纯系植株，该转基因植株具有明显的表型主要为开花提前，以及顶端分生组织在营养生殖早期的活跃，表现为多个顶端同时存在。

附图说明

图1用软件ClustalX对At172a,At172b, At172c, At172e, Os172a, Os172b, Os172c, Os172d以及新发现的PhmiR172序列进行比对（B），并构建进化树（A）。在进化树中，PhmiR172与已知的拟南芥miR172e, miR172d聚在一起，另外两个平行分支分别为来自水稻的miR172家族、AtmiR172c以及AtmiR172a和b。发现新的PhmiR172序列含有上述已知同源基因的共同保守序列，如软件截图（B）中长度20bp左右，*号标记位点所在区域。

图2 软件预测PhmiR172成熟序列，具有典型的颈环结构。

图3根据PhmiR172的同源靶基因PhTOE1设计引物，对PhmiR172和靶基因PhTOE1-LIKE的mRNA水平进行半定量PCR。在部分组织中，PhmiR172的表达与靶基因的表达有互补效应。如在根、茎中有PhmiR172的转录本，则没有PhTOE1-LIKE的表达。在叶、萼片中没有检测到PhmiR172，则检测到了靶基因的表达。此外PhmiR172在花梗和花苞表达较高，说明其可能参与了开花调控。

图4 将蝴蝶兰PhmiR172和靶基因PhTOE1构建在pSPT19载体，进行原位杂交。如图所示PhmiR172信号在外侧苞片等早期花器官中十分明显（A、B、C、D）。TOE1则在花粉粒中有高表达，外轮器官中也有表达（E、F、G、H）。图中：po表示花粉粒(pollen)；b为苞片(bracteole)； c是合蕊柱(column)；s代表萼片(sepal)； p为花瓣(petal)；l代表唇瓣(lip)；st柱头(stigma)；lpj为唇瓣突出处(lip pre)。

图5检测T2代转基因植物中潮霉素抗性基因（hpt），选取阳性株系（A）种子种下，获得纯合体T3代。抽提PhmiRNA172转基因T3代植株RNA，逆转录成cDNA以引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3进行PCR特异扩增检测其转录本（B），以2株野生型植物为对照，图中4个转基因株系检测均呈阳性，并且具有两个不同大小的转录本。

图6 以蝴蝶兰miRNA172的转基因拟南芥为实验组，不含该基因的空表达载体和野生型为对照组，比较转基因T3代在生长发育同一时期顶端分生组织的生长情况。发现转基因植株提前开花，并且顶端分生组织活跃，较早出现多个顶端。图中：A野生型植株第23d未有开花迹象；B转基因植株23d开花；C转基因植株第23d出现花芽的放大图；D转基因植株第26d花芽的放大图；E转基因植株第26d已经抽苔；F转基因植株29d，抽苔开花更加旺盛；G野生型第26d，刚刚出现开花现象。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例 1 蝴蝶兰 miRNA172 的克隆

1、 根据已知miRNA172基因序列的保守区域，设计蝴蝶兰miRNA172引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。对由组织抽提的蝴蝶兰全基因组进行特异性PCR扩增；

2、 常温13V凝胶电泳分离产物，检测到大小约250bp的条带；

3 、回收条带纯化，再次用同一引物扩增后测序，结果如SEQ ID NO.1。

实施例 2 蝴蝶兰 miRNA172 的基因序列信息与同源性分析

1、将实施例1中所得序列与拟南芥、水稻已知miR172基因进行了同源性分析和保守区域比对，发现其与两个来自拟南芥的miR172家族序列聚在一起（图1 A），并且具有上述miR172共有的长度约20bp的同源保守区域序列（图1 B），初步确定为miRNA172基因；

2、利用获得的序列以RNA-fold软件进行miRNA二级结构预测，结果如图2，该RNA能形成有典型的颈环结构。

实施例 3 蝴蝶兰不同组织中 PhmiR172 和靶基因 TOE1 的表达情况（ mRNA 半定量 PCR ）

1、根据miR172的同源靶基因TOE1（序列如SEQ ID NO.6）设计引物（SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5）；

2 、用上述引物，以及PhmiR172引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3分别在蝴蝶兰各组织cDNA中扩增PhmiR172和靶基因PhTOE1-LIKE；

结果如图3所示。部分组织中，PhmiR172的表达与靶基因的表达有互补效应。如在根、茎中有PhmiR172的转录本，则没有TOE1的表达。在叶、萼片中没有检测到PhmiR172，则检测到了靶基因的表达。此外PhmiR172在花梗和花苞表达较高，说明其可能参与了开花调控。

实施例 4 蝴蝶兰花器官中 PhmiR172 基因和靶基因 PhTOE1 的表达模式分析和比较（原位杂交）

1、将PhmiR172基因和靶基因PhTOE1分别构建在pSPT19载体，制备原位杂交探针；

2、 将蝴蝶兰花苞进行脱水包埋取样和石蜡切片脱水与包埋，以4%PFA固定 15min（预先4 ºC保温），洗去残留石蜡，50 ºC预杂交2h（圈阻液中加鱼精杂交液）；

3 、将制备好的探针对目的基因进行杂交。山羊血清封闭后加抗体，抗体37 ºC处理2h，避光显色：NBT/BCIP+左旋咪唑* L/mL)1常温1-4h ，消除内源性碱性磷酸酶；

4、 TSM3 5min´2 (1MTris pH8.0 10mL+0.5M EDTA 2mL+ddH₂O 88mL) 终止反应；

5、封片后用蓝色滤光镜进行显微观察，结果如图4所示。

实施例 5 蝴蝶兰 miRNA172 转基因拟南芥进行验证功能

1 、含目的基因 PhmiR172 表达载体的构建

1）将PhmiRNA172序列的5’端和3’端分别加上HindⅢ限制酶切位点和Sac I 酶切位点。然后以正义连入植物表达载体pHB；

2）、将重组载体以冻融法转入农杆菌EH105，于利福平(40mg/L)+链霉素 (50mg/L) +卡那霉素 (50mg/L)平板上筛选阳性菌落，扩大培养；

3）、挑取阳性单菌落扩大，煮菌后取裂解液以目的基因引物（序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3）PCR，含有200bp左右一直的条带则为转基因克隆。

、花序浸染法转化拟南芥

1）挑取农杆菌阳性单菌落在3ml LB+利福平(40mg/L)+链霉素 (50mg/L) +卡那霉素 (50mg/L)培养基中，28℃、250rpm摇菌培养过夜；

2）取50μl菌液接种到50ml同样抗性的LB培养基中，相同条件下扩大培养过夜，至0D600为1.2；

3）室温下4500rmp离心5min，去上清，转化缓冲液重悬菌体至0D600在0.8之间；

拟南芥转化缓冲液配制：

1/2MS+6-BA(0.01mg/L)+5%蔗糖+0.03% silwet ；

4）农杆菌喷雾法转化拟南芥：侵染前过夜保湿培养野生型拟南芥材料，并将已开放的花和果荚剪去。将用转化缓冲液重悬的菌液倒入50ml的小喷壶中，对野生型拟南芥（Col.）尚未开放的花蕾进行充分雾喷，保湿暗培养过夜后转为正常培养，5d后重复转化1次。

、对转基因植株的筛选

1）分批采摘成熟果夹，50℃烘箱脱水干燥数天，取出种子，清理干净后放回干燥器中室温保存备用；

2）将转基因种子消毒，在拟南芥筛选培养基上（MS+25mg/Lhyg）无菌培养，4℃暗培养2d后转至人工气候室正常培养。10d后将有4片真叶并生根的抗性小苗转移到盆土，盖上薄膜保湿，在温室中培养，3d取下薄膜转为正常培养，生长良好的植株即为转基因株系。

连续按上述步骤筛选出T1代、T2代转基因株系，验证T2代植株中潮霉素抗性基因（hpt），若为阳性则收其种子种植获得T3代纯合株系。

、转基因植株目的基因表达鉴定

1）以SDS法小量抽提T2拟南芥单株的的基因组DNA，以野生型拟南芥作空白对照，根据潮霉素抗性基因特异序列设计引物，进行PCR检测，结果见图5A；

2）提取含有潮霉素抗性单株子代（T3代纯合）的轮生叶RNA，RT-PCR得到cDNA样本，在cDNA样本中检测外源基因PhmiR172的表达，结果如图5B。三个转基因株系的外源基因都较野生型拟南芥有明显的表达。

、转基因株系表型鉴定

以转空载体的野生型（3个重复）作为对照，比较转基因纯合株系（3个重复）和野生型的开花时间，轮生叶数目发现转基因PhmiR172的拟南芥出现了提前开花的表型。轮生叶数目与野生型相差不大（图6A，B）。同时，顶端分生组织十分活跃，较早就出现了多个顶端同时生长的情况（图6 C，D，E），并且在生长26天时进行抽薹（图6 F），而野生型此时才开始开花（图6 G）。说明PhmiR172在转基因拟南芥中促进提前开花，并促使顶端分生组织活跃。

参考文献

[1] David P. Bartel et al., MicroRNAs: Genomics, Review Biogenesis, Mechanism, and Function [J].Cell, 2004,116: 281–297.

[2] Jae-Hoon Jung et al., The GIGANTEA-Regulated MicroRNA172 Mediates Photoperiodic Flowering Independent of CONSTANS in Arabidopsis [J]. The Plant Cell, 2007, 19: 2736–2748.

[3] Milo J. Aukerman et al., Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and itsAPETALA2-Like target genes [J]. The Plant Cell, 2004, 15: 2730–2741.

[4] Qian-Hao Zhu et al., Over-expression of miR172 causes loss of spikelet determinacy and floral organ abnormalities in rice (Oryza sativa) [J].BMC Plant Biology, 2009, 9:149.

[5] Qian-Hao Zhu et al., Regulation of flowering time and floral patterning by miR172 [J]. Journal of Experimental Botany, 2011, 62 (2):487-495.

[6] Xuemei Chen et al., Novel Genetic Mechanisms in Development 9, miR172 modulates the output of the AGAMOUS/APETALA2 antagonistic pair in floral patterning [J]. Developmental Biology, 2006, 295: 324 – 326.

[7] Nick Lauter et al., MicroRNA172 down-regulates glossy15 to promote vegetative phase change in maize [J].PNAS, 2005, 102(26): 9412-9417.

Sizolwenkosi M lotshwa et al., Floral patterning defects induced by Arabidopsis APETALA2 and microRNA172 expression in Nicotiana benthamiana [J]. Plant MolBiol, 2006, 61:781–793。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 蝴蝶兰miR172编码序列及其应用

<130> 001

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 206

<212> DNA

<213>

<400> 1

gtgtttgcgg gcgtggcatc atcaagattc acaaaatttg aatggagctt actcttttat 60

attttcatat attactatat attccctact ataatttaac agagagagag agatatatat 120

atatattttt tctccagaaa tagaatccaa gtgctctagc tcaaattaaa ggattgagaa 180

tcttgatgat gctgcatccg cagaca 206

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213>

<400> 2

gccaagcttg tgtttgcggg cgtggcatca tcaagattc 39

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213>

<400> 3

gcgagctctt gtctgcggat gcagcatcat caagat 36

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213>

<400> 4

aagttcacag tatagagg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213>

<400> 5

gcatgcctgc aggtcgac 18

<210> 6

<211> 136

<212> DNA

<213>

<400> 6

aagttcacag tatagaggag ttaccttcta ccggagaacc ggccgttggg aatcccacat 60

ctgggattgt ggcaaacaag tttatttagg aggattcgac actgctcatg ctgcaatcgt 120

cgacctgcag gcatgc 136

Claims (8)

1. 一种从蝴蝶兰全基因组序列中克隆获得的基因序列，其特征在于为蝴蝶兰miRNA172基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，全长250bp，含有miRNA172保守区域。

2. 一种用于获取蝴蝶兰miRNA172基因的引物序列，其特征在于根据权利要求1所述miRNA172基因两端非保守区域设计，序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

3. 一种含如权利要求1所述基因的编码序列的植物表达载体，含有如SEQ ID NO.1所示的目的基因序列和潮霉素抗性标记基因。

4. 如权利要求3所述的载体在转基因植物中的应用，该载体所含如权利要求1所述基因在拟南芥开花和顶端分生组织调控中发生作用，具体转基因操作步骤如下：

（1）将编码序列可操作的连接于植物表达载体，形成含有SEQ ID NO.1序列的表达载体；

（2）将步骤（1）中的表达载体转化拟南芥；

（3）通过抗生素筛选，RT-PCR鉴定，获得转基因阳性单株，自交获得转基因纯合体，该纯合体开花提前，顶端分生组织活跃。

5. 一种用于检测蝴蝶兰花苞内miR172表达量的方法，其特征在于它包括用SEQ ID NO.1所示序列制备RNA探针与蝴蝶兰花苞石蜡切片样本杂交，检测探针是否发生结合。

6. 一对用于扩增miR172在蝴蝶兰中的靶基因TOE1的引物序列，其特征在于如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

7. 一种用于鉴定蝴蝶兰中miR172表达量的方法，其特征在于，它包括用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所述引物分别对样品进行半定量PCR反应，然后比较蝴蝶兰不同器官中miR172和TOE1表达情况。

8. 一种用于检测转基因拟南芥中是否存在蝴蝶兰miR172的方法，其特征在于它包括用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述引物对样品进行PCR反应，然后检测是否扩增出目的片段，若有则该样品存在蝴蝶兰miR172。

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