CN106047887A - 落叶松LkANT基因、蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种落叶松LkANT基因、蛋白及应用，基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。落叶松LkANT基因所编码的蛋白质，其特征在于：蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，以及其在培育多分枝转基因植物中的应用。本发明借助现代分子生物学技术，对调控落叶松分枝和种子发育的关键基因进行克隆、分离和功能分析。此类关键基因的获得不仅具有重要的理论价值，而且为利用基因工程手段提高粮食产量提供重要的候选基因，在作物遗传改良等领域具有重要的应用前景。

Description

落叶松LkANT基因、蛋白及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其是一种落叶松LkANT基因、蛋白及应用。

背景技术

高等植物的分枝发育是决定植物形态建成的重要因素，与植物生物量和产量有着密切的关系。植物地上部分的株型源于胚胎发育时期的茎顶端分生组织和胚后发育的侧生分生组织。侧生分生组织可分化产生腋芽，腋芽进一步生长发育形成侧枝。侧枝同主茎相同，也具有形成叶片、花、叶腋分生组织和次级分枝的能力，但是物种不同分枝情况也不相同。植物分枝发育主要受遗传因素、植物激素和环境信号的多重调控。近年来，通过对多种植物的深入研究，获得了一系列调控分枝发育的重要基因。LAS是最早影响腋生分生组织形成的基因之一，在拟南芥中LAS基因的突变导致侧枝数目的减少。分蘖是水稻等禾本科植物生长发育过程中一个重要的分枝现象，也是一个重要的农艺性状，直接关系到植物的穗数并进一步影响产量。李家洋等通过图谱克隆技术，分离获得了在水稻分蘖调控中起重要作用的基因MOC1，功能分析发现该基因可以有效促进分蘖和腋芽的生长。而TB1基因则是分枝控制的负调控因子，该基因的过量表达会减少了侧枝的形成。随着研究的不断深入，人们发现了越来越多的调控分枝发育的相关基因，这些基因的发现为人们利用反向遗传学手段定向改造植株形态，培育具有理想株型以获得高产量植物新品种奠定了重要基础。

种子是人类赖以生存的重要的粮食来源，种子的大小和数量是影响农作物产量的主要因素。因此发现控制种子数量和大小的重要影响因素，并获得相关的功能基因，对作物高产育种具有重要的理论意义和应用价值。相关研究发现植株的分枝数与种子产量的增加有直接关系，无芒雀麦与多年生黑麦草种子的产量与单位面积分枝数呈正相关。GASA基因家族是受赤霉素调控的一个特异的基因家族。GASA4基因过量表达能够显著的增大转基因植株的种子大小。然而，有意思的是gasa4突变体的种子会变小，但是突变体植株单株种子的总产量却比野生型的高，这主要是由于gasa4突变体植株产生较多分支的原因。由此可见，植株的分枝与植株种子的产量有着密切的关系。ANT转录因子属于AP2亚家族的一员，主要参与调节与器官生长相协调的细胞***。拟南芥中ANT基因的功能缺失突变体由于细胞数目减少而使花器官变小，然而，该基因的过量表达增加了花序轴和花器官的大小。

目前对于调控植物分枝发育和种子发育相关基因的克隆主要集中在草本植物，而在木本植物、特别是裸子植物中该类基因的克隆和对其的应用还甚为稀少。落叶松是针叶树种的典型代表，也是我国主要的用材树种，具有十分重要的经济价值和生态价值。同时，落叶松作为木本植物又具有无限生长能力，其中蕴含着丰富的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种落叶松LkANT基因及应用，本发明首次获得该基因，并对该基因进行了性状研究，获得了良好的效果。

本发明实现目的的具体步骤如下：

落叶松LkANT基因，基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

落叶松LkANT基因所编码的蛋白质，蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

落叶松LkANT基因在培育多分枝转基因植物中的应用。

落叶松LkANT基因在培育以种子为收获对象，获得高产量转基因植物新品种中的应用。

本发明的优点和积极效果如下：

本发明借助现代分子生物学技术，对调控落叶松分枝和种子发育的关键基因进行克隆、分离和功能分析，提供的关键基因的获得不仅具有重要的理论价值，而且为利用基因工程手段提高粮食产量提供重要的候选基因，在作物遗传改良等领域具有重要的应用前景。

本发明通过具体实验，观察并统计不同生长发育时期转基因植株和对照组植株叶片、分枝和角果等生物学特征。结果显示：(1)与野生型拟南芥相比较，转基因植物植株叶片显著增大；(2)与野生型拟南芥相比较，转基因植物植株分枝数明显增多；(3)与野生型拟南芥相比较，转基因植物植株角果明显变大，单株种子重量约为野生型的2.5倍。

本发明借助现代分子生物学技术，对调控落叶松分枝和种子发育的关键基因LkANT进行克隆、分离和功能分析，LkANT基因的获得不仅具有重要的理论价值，而且为利用基因工程手段提高粮食产量提供重要的候选基因，在作物遗传改良等领域具有重要的应用前景。

附图说明

图1转基因植株T1代抗性筛选(图1a)和T3代抗性筛选(图1b)。

图2野生型植株(左)与转基因植株(右)不同生长发育时期表型特征。图2a：野生型植株(左)与转基因植株(右)2周龄生长情况；图2b：野生型植株(左)与转基因植株(右)3周龄生长情况；图2c：野生型植株(左)与转基因植株(右)5周龄生长情况；图2d：野生型植株(左)与转基因植株(右)8周龄生长情况。

图3野生型植株与转基因植株茎生叶分枝状况分析图。

图4野生型植株与转基因植株角果长度分析图。

图5野生型植株与转基因植株单株种子重量分析图。

图6阳性重组克隆PCR鉴定结果图。MIII：DNA markerIII；1-5：阳性重组克隆。

具体实施方法

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中，利用Illumina/Solexa高通量测序技术对落叶松转录组进行测序分析。通过深入数据挖掘和序列拼接得到一个1465bp的unigene，并且该unigene在腋芽中呈现高表达模式。为深入分析该unigene的功能特征，因此，根据所获得的unigene序列信息设计特异引物，采用RT-PCR技术在落叶松mRNA中扩增该unigene序列。利用ORF Finder对该unigene的开放阅读框(ORF)进行分析发现该unigene包含一个1395bp的ORF，编码464个氨基酸的蛋白质，将其命名为LkANT。

BLAST比对分析发现该基因序列编码的蛋白序列与黑松、烟草、番茄和葡萄等物种ANT-Like转录因子的同源性仅为60％-80％，这表明裸子植物落叶松的在LkANT基因在长期的进化中相对较为保守，保留了自身独特的序列结构特征。基因的结构决定其功能，因此深入探究该基因的功能特征对于发掘、克隆落叶松优质基因通过基因工程手段用于作物遗传改良具有较好的应用潜力。

一种落叶松LkANT基因的克隆及培育多分枝和高产量转基因植物的方法如下：

1、落叶松总RNA提取及第一链cDNA合成

以落叶松当年生幼嫩叶片为试验材料，采用CTAB法提取总RNA，并利用M-MLV逆转录试剂盒逆转录获得第一链cDNA。

2、LKANT基因的分离及克隆

(1)利用primer premier 5.0软件设计带酶切位点引物

正向引物：5’-GACGGTACCATGTATTTTGATCACAATGTAGG-3’(下划线为KpnI酶切位点)

反向引物X：ba5I’-TCGCGGCCGCTTAGGTTATGAAGAGCTGCCAG-3’(下划线为NotI酶切位点)

(2)PCR反应体系

(3)PCR扩增反应参数

94℃1min；

94℃20s，52℃20s，72℃30s,35cycles；

72℃5min；

(4)1％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。

3、目的基因的回收及克隆测序

(1)连接反应

轻轻混合，室温(20℃-37℃)反应5-10min；

反应结束后，将离心管置于冰上。

(2)转化

加连接产物于50μL Trans1-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；

42℃热激30s，立即置于冰上2min；

加250μL平衡至室温的LB，200rpm 37℃孵育1h；

取8μL 100mmol IPTG，40μL 25mg/mL X-gal，25μL 100mg/mL Amp混合，均匀地涂于准备好的平板上，37℃放置30min；

待IPTG和X-gal被吸收后，取150μL菌液涂板，培养过夜。

(3)阳性重组子的鉴定

随机挑取白色菌落于含有1mg/LAmp的LB液体培养基中；

200rpm 37℃孵育约8h；

取1μL菌液用作PCR反应的模板，用LKANT特异引物鉴定重组子；

PCR反应体系如下

PCR反应条件

94℃10min；

94℃30s，55℃30s，72℃90s；72℃10min。

琼脂糖凝胶电泳检测片段大小(图6)。

(4)菌种保存及测序

阳性克隆重组子菌液加入等体积40％甘油LB培养基，混匀，-20℃保存。阳性克隆重组子菌液送往上海生工测序部进行测序，测序结果是序列1。

4、质粒酶切

(1)含目的基因克隆载体质粒和pRI201-AN-GUS载体质粒同时采用KpnI和NotI双酶切；

(2)酶切体系如下

(3)轻轻混匀；

(4)37℃3h；

(5)琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果；

(6)回收目的片段。

5、酶切片段的连接

(1)回收的带酶切位点目的基因片段与带相应酶切位点的pRI201-AN-GUS载体连接；

(2)连接体系

(3)轻轻混匀；

(4)16℃水浴保温12h。

6、重组质粒转化农杆菌

(1)取1μg重组质粒加入100μL农杆菌感受态中，轻轻混匀；

(2)冰浴30min；

(3)液氮速冻5min；

(4)迅速转至37℃水浴保温5min；

(5)加入YEB 600μL；

(6)28℃200rpm复苏4h；

(7)取150μL复苏菌液涂于YEB平板(含三抗)；

(8)28℃倒置培养2-3d。

(9)经鉴定的阳性菌株于-20℃保存备用。

7、.拟南芥的种植

(1)拟南芥种子置于1.5mL离心管中，加入1mL 70％乙醇，振荡洗涤30s；

(2)6,000rpm 1min收集种子，弃上清；

(3)加入1mL无菌水，振荡洗涤1min，收集种子，重复2次；

(4)加入2％次氯酸钠和0.05％tween-20振荡消毒15min；

(5)6,000rpm 1min收集种子，弃上清；

(6)加入1mL无菌水，振荡洗涤1min，收集种子，重复5次；

(7)将种子均匀播种于MS固体培养基中；

(8)4℃黑暗条件下春化3-4d；

(9)春化完成后，置于22℃光照培养箱，16h光照，8h黑暗培养；

(10)将4叶期拟南芥转至营养土中，每盆1棵，人工气候室培养(22℃，16h光照，8h黑暗，相对湿度50-70％)。

8、农杆菌转化拟南芥

(1)将-20℃保存的含有目的重组质粒的农杆菌接种于10mLYEB培养基中；

(2)28℃200rpm活化过夜；

(3)1：100稀释菌体于250mLYEB培养基中；

(4)28℃200rpm培养至OD600＝1.2～1.6；

(5)室温5,000rpm离心15min收集菌体；

(6)等体积转化缓冲液(5％蔗糖)重悬菌体；

(7)将拟南芥倒置于重悬菌体的转化缓冲液，浸染10s；

(7)取出植株，用保鲜膜将植株包裹好，侧放暗培养24h；

(8)去遮盖物，植株直立培养；

(9)正常条件下培养至拟南芥开花结果，收集种子。

9、转基因植株Kan抗性筛选

(1)转基因拟南芥种子消毒后播种于MS固体培养基中(含50mg/L Kan)；

(2)4℃黑暗条件下春化3-4d；

(3)置于22℃光照培养箱，16h光照，8h黑暗培养；

(4)未成功转基因的拟南芥长至两片子叶开始白化死亡，而成功转基因的拟南芥植株叶片为绿色，根系发达，生长健壮(图1)。待抗性苗长至4叶期，转至营养土中，每盆1棵，人工气候室培养(22℃，16h光照，8h黑暗，相对湿度50-70％)。

(5)经过抗性筛选为阳性的植株提取其基因组DNA和cDNA，进一步进行PCR和RT-PCR鉴定。

10、转基因植物生物学性状观察

观察并统计不同生长发育时期转基因植株和对照组植株叶片、分枝和角果等生物学特征(图2-图5)。结果显示：

(1)与野生型拟南芥相比较，转基因植物植株叶片显著增大；

(2)与野生型拟南芥相比较，转基因植物植株分枝数明显增多；

(3)与野生型拟南芥相比较，转基因植物植株角果明显变大，单株种子重量约为野生型的2.5倍。

本发明提供的落叶松LkANT基因可以在培育多分枝转基因植物中的应用。

本发明提供的落叶松LkANT基因可以在培育以种子为收获对象，获得高产量转基因植物新品种中的应用。

SEQID NO：1落叶松LKANTcDNA序列

5′-ATGTATTTTGATCACAATGTAGGCGAAGATAATAACGGTCCCTGCAAAATGATCAACGTAAATCAGATGCCATATTCAGAGTGCAGGCGCATGGGCGTTCCATCTTCATTTCATACATACGGGGACAATGGAAACAATACATATGAGGCGGCAATGCACGAACAAGGGCTTAGCCAGCATAATATGTTCGCAGATTGCAGTTTACAGTTCAATCCTCCCGGGCCAGGAATTATAGAGAACCCATCGAGCTGCATGGTGGGGATATCAGCAATGAAAACATTGCTAAGGCAATACCCCAACGGTGGTTCTTCTGACAAGAATTCAACCAATGAGTCTCATGAGACCCTTAATAATATTGGGGATTTGCAGTCTCAGGCTCTGACTCTAACAATGAGTCCGGGATCCCAGTCCAGTTCGGTTACCATAGTTCCCCATTCGGGCACAAATACAGAATGTGTTGCAGTGGAGACGAGCAGAAAGAGAGCTGCTGGATCAAAATCTGGTAACACCAGACAGCCTGTTCCTCGGAAATCCATTGATACATTTGGTCAACGGACATCCCAGTACCGTGGTGTCACAAGGCATCGGTGGACAGGGCGCTACGAGGCGCACCTATGGGATAACAGTTGCAAGAAAGAAGGTCAGACTAGGAAAGGGAGACAAGTGTATTTGGGAGGTTATGATAAAGAAGAAAAGGCTGCTAAATCTTATGACTTGGCCGCACTGAAGTACTGGGGGCCTTCAACGCATATTAACTTCCCGTTGAACACTTATGAGAAAGAACTTGAAGAGATGAAGCACATGACCAGGCAGGAGTACGTTGCCAATTTGAGGAGGAAGAGTAGTGGATTTTCCAGAGGGGCATCTATGTACCGAGGAGTAACAAGGCACCACCAGCATGGCAGATGGCAGGCGCGCATTGGCAGAGTTGCAGGGAACAAGGACCTCTACCTTGGAACTTTCAGTACTCAGGAAGAGGCCGCAGAAGCCTACGACATCGCTGCCATCAAGTTCAGGGGAACGAATGCTGTGACAAATTTTGATATCAGCAGATATGACGTGAAACGCATCCTGGCAAGCAATACCTTGCTAGTTGGTGAGTTGGCCAGACTAAACAGGGATCAGCTGGCGGAGCCATTAACGGCTGAGCCCGCTCAGGCCGACGTCCCCATCGTGATTCATCAAATTACCAACGAAAAGTACAACGCTAAGGAAATTGAATACGAAGATGAGGATACTAAGAACAACTGGCAGATGCAGATGAGCTGCGATGAGGAGCAAAACCAGATTAATTCTTGTTCCAATGAGCCTTCCGATCATGACAAAATGTGGGATGATCAGAAGCAAGCCAGTCCTTTACAGAATCTCAACATCTGGCAGCTCTTCATAACCTAA-3′

SEQ ID NO：2落叶松LKANT蛋白序列

MYFDHNVGEDNNGPCKMINVNQMPYSECRRMGVPSSFHTYGDNGNNTYEAAMHEQGLSQHNMFADCSLQFNPPGPGIIENPSSCMVGISAMKTLLRQYPNGGSSDKNSTNESHETLNNIGDLQSQALTLTMSPGSQSSSVTIVPHSGTNTECVAVETSRKRAAGSKSGNTRQPVPRKSIDTFGQRTSQYRGVTRHRWTGRYEAHLWDNSCKKEGQTRKGRQVYLGGYDKEEKAAKSYDLAALKYWGPSTHINFPLNTYEKELEEMKHMTRQEYVANLRRKSSGFSRGASMYRGVTRHHQHGRWQARIGRVAGNKDLYLGTFSTQEEAAEAYDIAAIKFRGTNAVTNFDISRYDVKRILASNTLLVGELARLNRDQLAEPLTAEPAQADVPIVIHQITNEKYNAKEIEYEDEDTKNNWQMQMSCDEEQNQINSCSNEPSDHDKMWDDQKQASPLQNLNIWQLFIT

Claims (4)

1.落叶松LkANT基因，其特征在于：基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.落叶松LkANT基因所编码的蛋白质，其特征在于：蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.落叶松LkANT基因在培育多分枝转基因植物中的应用。

4.落叶松LkANT基因在培育以种子为收获对象，获得高产量转基因植物新品种中的应用。