CN110819635B

CN110819635B - 豆科植物han同源基因在调控豆科植物根瘤数目中的应用

Info

Publication number: CN110819635B
Application number: CN201911067613.6A
Authority: CN
Inventors: 周传恩; 许艺腾; 韩璐
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2039-11-04
Also published as: CN110819635A

Abstract

本发明公开了豆科植物HAN同源基因在调控豆科植物根瘤数目中的应用，所述豆科植物HAN同源基因选自MtHAN1基因、MtHAN2基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1、2所示。本发明首次分离得到了蒺藜苜蓿MtHAN1，MtHAN2基因的敲除突变体株系，发现双突变体植株的根瘤数目有显著增加。这证明，该基因及其在其他豆科植物中的同源基因参与调控豆科植物的根瘤产生，影响根瘤数量。敲除该基因，可以得到根瘤数量高于野生型植株的转基因豆科植物，预示本发明实施后将会创造氮肥施用更少，氮肥利用效率更高的新型豆科植物，可用于后续的牧草品质及粮食产量提升，对我国草业和粮食生产具有重大意义。

Description

豆科植物HAN同源基因在调控豆科植物根瘤数目中的应用

技术领域

本发明涉及豆科植物HAN同源基因在调控豆科植物根瘤数目中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

根瘤是根瘤菌与豆科植物根系相互作用而在植物根部产生的膨大组织。在共生过程中，根瘤菌利用植物提供的矿物质和能源，将空气中游离的氮气固定成含氮化合物提供给植物利用。根瘤菌和植物在拮抗关系中保持均衡，互利共生。

氮是植物必须的营养元素，也是作物施肥中使用最多的肥料之一。我国是一个农业大国、人口大国，在人口多，耕地少的背景下，必须努力提高农作物产量以应对粮食需求，因而，我国氮肥施用量也是逐年增加。据统计，19世纪80年代初期时，我国氮肥施用量不足1000万吨，但是到19世纪90年代中叶时，我国的氮肥使用量已经突破2000万吨，且有逐年增加的趋势。虽然氮肥施用量在迅速增加，但是植物的氮肥利用效率却没有增加，一直稳定在35％左右，这也就导致了大量氮肥的流失。于此同时，大量的氮肥施用和流失也导致了一系列严重的生态问题。流入河湖中的氮肥引起严重的水体富营养化，使藻类快速繁殖，水质变坏，进而对渔业带来间接危害。为了应对水体富营养化，改善水质，我国每年投入大量的人力物力进行污染防治，给地方财政带来负担。

与根瘤菌共生固氮是豆科植物特有的功能属性。根瘤菌具有强大的固氮能力，据统计，地球表面上每年生物固氮的总量约为10⁸t，其中豆科植物体内根瘤菌的固氮量约为5.5×10⁷t，占生物固氮总量的55％左右。因此研究清楚植物根瘤形成机理，通过提高根瘤数目或者根瘤固氮效率并应用到农业生产中具有巨大的经济和社会价值。

在蒺藜苜蓿，百脉根和大豆中的研究表明，CLAVATA3/ESR(CLE)小肽中的CLAVATA3/ESR(CLE)-RELATED-ROOT SIGNAL1(CLE-RS1)，CLE-RS2和CLE-RS3是根瘤形成的负调控因子，它们的缺失突变体均能够导致豆科植物根瘤数目的不同程度增加。这些小肽的表达受NODULE INCEPTION(NIN)和NIN-like protein NITRATE UNRESPONSIVESYMBIOSIS1(NRSYM1)基因表达的诱导。同时LjPLENTY，MtRDN1和PsNOD这些糖基转移酶参与了这些小肽的糖基化过程。这种糖基化过程对小肽的生物活性具有重要作用。除此之外，生长素、细胞***素、赤霉素、乙烯等植物激素也都广泛参与了豆科植物根瘤发生。虽然对根瘤的形成过程中的下游基因功能已经有相当报道，但是对上游转录因子基因通过对下游一系列基因的调控来影响根瘤数目方面却还鲜有报道。

发明内容

针对上述现有技术，为了研究通过基因工程技术手段改变豆科植物根瘤数目，本发明发现了两个调控根瘤数目的基因，并提供了一种敲除该基因以获得根瘤数目增加的转基因豆科植物的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

豆科植物HAN同源基因在调控豆科植物根瘤数目中的应用。所述豆科植物HAN同源基因选自MtHAN1基因、MtHAN2基因，所述MtHAN1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述MtHAN2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述豆科植物，选自苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草、大豆、花生。

豆科植物HAN同源基因在制备转基因豆科植物中的应用。具体应用时，敲除豆科植物种子或植株中的HAN同源基因(MtHAN1基因和MtHAN2基因)，从而获得转基因豆科植物，其根瘤数量高于野生型豆科植物。

一种通过敲除豆科植物HAN同源基因获得转基因豆科植物的方法：敲除豆科植物种子或植株中的HAN同源基因(MtHAN1基因和MtHAN2基因)，从而获得转基因豆科植物，其根瘤数量高于野生型豆科植物。

本发明首次分离得到了蒺藜苜蓿HAN同源基因家族成员MtHAN1，MtHAN2基因的敲除突变体株系，并通过实验证明，该基因参与调控豆科植物根瘤数量，并可通过敲除该基因的方式得到根瘤数量高于野生型植株的转基因豆科植物。

本发明利用特异性引物(核苷酸序列如SEQ ID No.5、6、7、8所示)，通过RT-PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆MtHAN1，MtHAN2基因，利用构建的突变体群体，筛选出MtHAN1，MtHAN2基因的敲除突变体株系，并通过杂交的方法获得mthan1mthan2的双突变体植株。将野生型R108和mthan1mthan2双突变体种子4℃萌发5天后种在沙子：珍珠岩为1:3为生长基质的育苗穴里，在第3天和第5天在根部接种中华根瘤菌，并间隔3天用低氮培养液浇灌根部。3周以后观察根瘤形态并分别统计野生型和双突变体的根瘤数目。实验中分别统计了37株野生型和41株双突变体植株的根瘤数目。统计发现，野生型和突变体植株根瘤形态没有明显差异，但是根瘤数目有显著差异。野生型植株根瘤数目平均在13个左右，而双突变体植株根瘤数目平均在20个左右。相对于野生型，双突变体植株根瘤数目有显著增加。这证明，这两个基因参与调控豆科植物的根瘤形成。敲除该基因，可以在转基因豆科植物中显著提高该物种的根瘤数目，预示本发明实施后将会创造更有利于生物固氮的新型豆科植物，可用于后续的豆科植物品种改良，对我国豆科植物种植时减少氮肥使用量，提高作物产量具有重大意义。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：蒺藜苜蓿MtHAN1，MtHAN2基因的克隆和突变体的鉴定，其中，A：MtHAN1，MtHAN2的基因结构及突变体中Tnt1转座子的***位置；B：RT-PCR检测野生型和突变体中MtHAN1，MtHAN2基因转录情况。MtHAN1，MtHAN2各自2个突变体株系中，Tnt1均***在该基因的外显子区域。RT-PCR方法检测两个单突变体中MtHAN1，MtHAN2转录情况时，均没能检测到该基因的正常转录本。

图2：蒺藜苜蓿mthan1mthan2双突变体的根瘤表型分析，其中，A：野生型植株诱导根瘤时根瘤生长情况；B：双突变体植株诱导根瘤时根瘤生长情况。

图3：野生型和双突变体植株诱导根瘤时根瘤数目变化情况统计，MtHAN1，MtHAN2均突变时，根瘤数目会显著增加。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1克隆蒺藜苜蓿基因MtHAN1，MtHAN2

通过拟南芥数据库网站TAIR获得拟南芥HAN基因的序列，然后利用BLAST进行序列比对搜索，获得MtHAN1，MtHAN2的基因组序列(如SEQ ID No.1、2所示)，其表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3、4所示。根据序列设计SEQ ID No.5、6(HAN1-RT-F、HAN1-RT-R)和SEQ ID No.7、8(HAN2-RT-F、HAN2-RT-R)所示的引物。利用TRIzol试剂盒提取蒺藜苜蓿野生型叶组织RNA，运用RT-PCR方法扩增MtHAN1，MtHAN2基因的全长CDS序列。利用Gateway技术将基因序列连入pEARLEYGATE103载体，然后测序验证克隆序列的正确性。

实施例2蒺藜苜蓿MtHAN1，MtHAN2突变体的获得和鉴定

利用Thermal asymmetric interlaced-PCR(TAIL-PCR)技术，筛选了蒺藜苜蓿Tnt1标记的突变体库，在22000个突变体株系中分别筛选出Tnt1***到MtHAN1，MtHAN2基因中的各自两个突变体株系(图1A)。分子生物学鉴定结果表明，在四个突变体株系中，Tnt1均***到MtHAN1，MtHAN2基因的第二个外显子区域，导致该基因非正常转录(图1B)。

实施例3蒺藜苜蓿MtHAN1，MtHAN2基因突变体植株的根瘤表型分析

对蒺藜苜蓿野生型R108和mthan1mthan2双突变体种子萌发后接种中华根瘤菌(将野生型R108和mthan1mthan2双突变体种子4℃萌发5天后种在沙子：珍珠岩为1:3为生长基质的育苗穴里，在第3天和第5天在根部接种中华根瘤菌，并间隔3天用低氮培养液浇灌根部)，3周后分别观察野生型和双突变体的根瘤生长情况并统计根瘤数目。结果表明，同时敲除MtHAN1，MtHAN2基因不影响根瘤形态发生，但是可以显著增加植株根瘤产生数目。实验中分别统计了37株野生型和41株双突变体植株的根瘤数目。统计显示，野生型植株根瘤数目平均在13个左右，双突变体根瘤数目平均在20个左右。相对于野生型，双突变体植株根瘤数目有显著增加(图2A、B，图3)。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 申请人名称

<120> 豆科植物HAN同源基因在调控豆科植物根瘤数目中的应用

<141> 2019-10-29

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 792

<212> DNA

<213> Medicago truncatula

<400> 1

atgatgcatc gttcatctca agggcaacac gtgatgggac actgttcatg tggtatgttt 60

catggacaaa acaactcatt ctcaatgtta ttctcctcct ctacacctta tgatcatgaa 120

cctgaaacat attgcttcac tccgaattct tcatcttctt ctgttgattg tactctttca 180

cttggaacac catccactcg tttcagtgaa gatgaagaga aaagaacccg acatcatgaa 240

cgtcgttctg tcaaaaattt ctgttgggat ttgttaacac ctaaacagta caacagtact 300

cagtctcaaa caaaggcaac acgtgcaagt accaataata acaacaatga ttctcttctt 360

gctcgtagat gtgcaaactg tgacaccacc tccacaccgc tttggaggaa cggccctcga 420

ggcccaaagg taaaaaaaat actctaaata tatacattcc aaatatataa ctttatttca 480

atcttttgat agtttcaatt tgaatgggaa ttacagtcac tatgcaatgc atgtgggatc 540

agattcaaga aggaagagag aagagcaact tctgccgccg gcacagcgac agcgccatct 600

attggcgtaa tggagtcagc ttcgatgtat aaccaccacc accatcacaa caacaacaac 660

tcatggtacg tacaaccaca gaaccagaag atgcagtgtt tctctccagc aatgactaac 720

gagttccgtt tcattgatga aaccaatcat gattctgaaa atggcattcc atttctctct 780

tggagactct ga 792

<210> 2

<211> 963

<212> DNA

<213> Medicago truncatula

<400> 2

atgatgcatc attgttgtag tagctctcaa caaggtcaca taatgggagg aacatgcaca 60

tgtggtatgt ttcatcctca aacaaattct aattactctt tgctttactc taactaccaa 120

caacatgatc attacgattt tgacccttac tcatacacta ctccatcttc ttcttcttct 180

tcttctgttg attgcacact ctcccttgct accccttcca cacgtttatc tgaagaccaa 240

gataaacgaa accgtcgctc ttctcttgct aattttttct gtaccaaatc ttcaaacact 300

aaacataatt ctcaatctca atccaagtca aacaatattg gtagtaactc taacaatgat 360

tctcttcttg ctcgtcgatg tgctagctgt gactccactt ctacacccct ttggaggaat 420

ggtcctcgtg gccctaaggt aaaaatacat taccaatacc acctttgtgt ctatgttcaa 480

aatatatgag ccaagacctc gtagtagact ataaatgttc ggcaaaaatc atttatagct 540

tactaggtct cagctgtaag agtttgactt tgttagatat gagacaatgt catgctatta 600

ataataattt tttgtttctt aatgttatct gttcttttta tcttctttta agaatgtttt 660

gtaataatgg ttgaattgaa attgcagtca ctatgcaatg cttgtgggat tagatacaag 720

aaggaagaga gaagagcaaa cgccgcggtt gccacgacag ccgcgactaa cggcggcata 780

atggagtcag gaaacttcta cagtaacaac aacaacaatt catggtactc acaaccacag 840

agtcaaatgt atggcaatga gctacgtttc atggatgatt cagatgcaga atcagaaaat 900

ggcattccta atttcctttc ttggagactc aacacaagtc ttgttcacga ttacacaaga 960

tga 963

<210> 3

<211> 235

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 3

Met Met His Arg Ser Ser Gln Gly Gln His Val Met Gly His Cys Ser

1 5 10 15

Cys Gly Met Phe His Gly Gln Asn Asn Ser Phe Ser Met Leu Phe Ser

20 25 30

Ser Ser Thr Pro Tyr Asp His Glu Pro Glu Thr Tyr Cys Phe Thr Pro

35 40 45

Asn Ser Ser Ser Ser Ser Val Asp Cys Thr Leu Ser Leu Gly Thr Pro

50 55 60

Ser Thr Arg Phe Thr Glu Asp Glu Glu Lys Arg Thr Arg His His Glu

65 70 75 80

Arg Arg Ser Val Lys Asn Phe Cys Trp Asp Leu Leu Thr Pro Lys Gln

85 90 95

Tyr Asn Ser Thr Gln Ser Gln Thr Lys Ala Thr Arg Ala Ser Thr Asn

100 105 110

Asn Asn Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ala Arg Arg Cys Ala Asn Cys Asp

115 120 125

Thr Thr Ser Thr Pro Leu Trp Arg Asn Gly Pro Arg Gly Pro Lys Ser

130 135 140

Leu Cys Asn Ala Cys Gly Ile Arg Phe Lys Lys Glu Glu Arg Arg Ala

145 150 155 160

Thr Ser Ala Ala Gly Thr Ala Thr Ala Pro Ser Ile Gly Val Met Glu

165 170 175

Ser Ala Ser Met Tyr Asn His His His His His Asn Asn Asn Asn Asn

180 185 190

Ser Trp Tyr Val Gln Pro Gln Asn Gln Lys Met Gln Cys Phe Ser Pro

195 200 205

Ala Ile Thr Asn Glu Phe Arg Phe Ile Asp Glu Thr Asn His Asp Ser

210 215 220

Glu Asn Gly Ile Pro Phe Leu Ser Trp Arg Leu

225 230 235

<210> 4

<211> 238

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 4

Met Met His His Cys Cys Ser Ser Ser Gln Gln Gly His Ile Met Gly

1 5 10 15

Gly Thr Cys Thr Cys Gly Met Phe His Pro Gln Thr Asn Ser Asn Tyr

20 25 30

Ser Leu Ile Tyr Ser Asn Tyr Gln Gln His Asp His Cys Asp Phe Asp

35 40 45

Pro Tyr Ser Tyr Thr Thr Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Val Asp

50 55 60

Cys Thr Leu Ser Leu Ala Thr Pro Ser Thr Arg Leu Ser Glu Asp Gln

65 70 75 80

Asp Lys Arg Asn Arg Arg Ser Ser Leu Ala Asn Phe Phe Cys Thr Lys

85 90 95

Ser Ser Asn Thr Lys His Asn Ser Gln Ser Gln Ser Lys Ser Asn Asn

100 105 110

Ile Gly Ser Asn Ser Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ala Arg Arg Cys Ala

115 120 125

Ser Cys Asp Ser Thr Ser Thr Pro Leu Trp Arg Asn Gly Pro Arg Gly

130 135 140

Pro Lys Ser Leu Cys Asn Ala Cys Gly Ile Arg Tyr Lys Lys Glu Glu

145 150 155 160

Arg Arg Ala Asn Ala Ala Val Ala Thr Thr Ala Ala Thr Asn Gly Gly

165 170 175

Ile Met Glu Ser Gly Asn Phe Tyr Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser

180 185 190

Trp Tyr Ser Gln Pro Gln Ser Gln Met Tyr Gly Asn Glu Leu Arg Phe

195 200 205

Met Asp Asp Ser Asp Ala Glu Ser Glu Asn Gly Ile Pro Asn Phe Leu

210 215 220

Ser Trp Arg Leu Asn Thr Ser Leu Val His Asp Tyr Thr Arg

225 230 235

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atgatgcatc gttcatctca agggc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tcagagtctc caagagagaa atgga 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atgatgcatc attgttgtag tagc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tcatcttgtg taatcgtgaa caag 24

Claims

1.敲除豆科植物HAN同源基因在提高豆科植物根瘤数目中的应用，其特征在于：所述豆科植物HAN同源基因为MtHAN1基因和MtHAN2基因，所述MtHAN1基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述MtHAN2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述豆科植物选自蒺藜苜蓿。

2.敲除豆科植物HAN同源基因在制备转基因豆科植物中的应用，其特征在于：所述豆科植物HAN同源基因为MtHAN1基因和MtHAN2基因，所述MtHAN1基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述MtHAN2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；具体应用时，敲除豆科植物种子或植株中的MtHAN1基因和MtHAN2基因，从而获得转基因豆科植物，其根瘤数量高于野生型豆科植物；所述豆科植物选自蒺藜苜蓿。

3.一种通过敲除豆科植物HAN同源基因获得转基因豆科植物的方法，其特征在于：敲除豆科植物种子或植株中的HAN同源基因，从而获得转基因豆科植物，其根瘤数量高于野生型豆科植物；所述豆科植物HAN同源基因为MtHAN1基因和MtHAN2基因，所述MtHAN1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述MtHAN2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述豆科植物选自蒺藜苜蓿。