CN112779270A - 一种增强植物缺铁耐受及铁积累的功能基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种增强植物缺铁耐受及铁积累的功能基因及应用，属于生物工程技术领域。所述增强植物缺铁耐受及铁积累的功能基因序列如序列表SEQ ID No：l所示。本发明是将序列表SEQ ID No：l所示的增强植物对缺铁胁迫耐受性的功能基因在植物中进行敲除，使其在植物中不表达，植物表现为缺铁耐受性状。本发明植物增强缺铁耐受及铁积累的功能基因可为农作物抗逆遗传改良提供新的基因资源和技术保障，应用其可培育出抗逆性和耐逆性增强的植物种子。

Description

一种增强植物缺铁耐受及铁积累的功能基因及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及利用该基因作为负调控因子增强植物对缺铁胁迫耐受及提高其体内铁含量的方法。

背景技术

铁（Fe）是动植物所必需的重要营养元素之一。其对维护动物机体正常生理功能具有重要作用，参与造血、维持生长发育和抵御感染性疾病等。同样，Fe对植物体有着重要作用，参与光合作用、生物固氮和呼吸作用中的细胞色素和非血红素铁蛋白的组成，是植物能量代谢的重要物质。叶绿体的合成需要Fe的参与，所以缺Fe胁迫下植物会出现叶片叶脉间失绿，叶片失绿常见于幼叶。土壤中虽然富含大量的Fe，但可利用率极低，高pH和高碳酸盐含量严重降低了土壤中Fe的有效性，导致植物难以从土壤中吸收Fe，造成缺Fe胁迫，严重影响植物生长，减少作物产量。所以提高作物对缺铁胁迫的耐受和提高对铁的吸收已经成为关系民生的大事,已经成为农业生产和食品安全进一步研究的重点，倍受世界各国政治界和学术界的关注，也是当前生命科学研究的热点。

拟南芥作为一种经典的模式植物，被广泛应用于植物遗传学、作物生物学、发育生物学和分子生物学等研究领域。拟南芥全基因组已测序完成，此外拟南芥具有结构简单、生长周期较短、繁殖系数高、生活力强、自花授粉和易于转化的特点，将拟南芥作为研究对象能够更快更好的达到实验预期目标，可以很大程度上缩短实验时间和简化实验条件，表现出其他生物无法比拟的优越性。利用模式生物拟南芥研究植物响应缺铁胁迫的机理将对农作物抗逆遗传改良提供新的基因资源。根据拟南芥测序数据库（www.arabidopsis.org）寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一,也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因。目前大部分基因的功能研究还尚不清楚，利用突变体筛选技术研究基因功能已成为一种有效的方法，目前可利用CRISPR/Case9介导的基因编辑技术方法，还可采用T-DNA***、转座子***、EMS诱变、RNAi干涉等方法，利用这些基因工程技术方法最终将研究功能基因进行敲除，并将转化的植物组织培育成突变体植株。通过对拟南芥突变体的研究，已发现了一些调控缺铁响应的功能基因，如：FIT、bHLH38、bHLH39、bHLH100、bHLH101、bHLH34、bHLH104、bHLH105、bHLH115、 PYE、MYB10、MYB72等。

根据拟南芥数据库公布的基因组序列，ATMYC1(AT4G00480)是拟南芥bHLH转录因子家族中的成员, bHLH是近年来在植物体内新发现的特有转录调控因子，属于bHLH家族转录调控因子。已有研究发现拟南芥中部分bHLH转录因子在响应植物缺铁胁迫中发挥至关重要的作用。对于ATMYC1基因目前仅有研究发现ATMYC1基因参与葡萄黄酮生物合成及植物根毛和毛细胞分化的调控，然而，其是否在植物非生物胁迫响应中起调控作用尚不清楚。

面对日益严峻的高pH和高碳酸盐土壤问题, 寻找调控植物铁稳态及增强铁积累的功能基因阐明其功能具有重要的理论及实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强植物缺铁耐受及铁积累的功能基因，本发明的第二个目的提供所述功能基因作为负调控因子在调控植物缺铁耐受及积累方面的应用。

一种增强植物缺铁耐受及积累的功能基因的DNA序列如SEQ ID No.1所示。

将序列表SEQ ID No：l所示的增强植物对缺铁胁迫耐受性及铁积累的功能基因在植物中进行敲除，即在植物中不表达，植物表现为缺铁耐受性状，所述植物为拟南芥。

将序列表SEQ ID No：l所示的增强植物缺铁耐受及积累的功能基因通过T-DNA***的方法，实现将拟南芥中的负调控蛋白ATMYC1基因敲除。以提高拟南芥对Fe的吸收，导致拟南芥体内的Fe含量上升，进而表现为对缺铁胁迫耐受性状。

本发明的有益技术效果体现在以下方面：

1.根据拟南芥数据库公布的基因组序列，ATMYC1是拟南芥bHLH转录因子家族中的一员，申请人发现ATMYC1基因突变后在缺铁胁迫处理下植株表现为对缺铁胁迫耐受，这表明该ATMYC1基因响应缺铁胁迫的调控。为此，我们研究了该基因功能，进一步研究结果表明，ATMYC1基因突变体植株体内Fe含量与野生型植株相比较高，这说明敲除基因ATMYC1可以提高拟南芥对Fe的吸收，导致拟南芥体内的Fe含量上升，进而表现为对缺铁胁迫耐受。

2.本发明所述的ATMYC1基因突变后可以增强植物缺铁耐受及积累，它为农作物抗逆遗传改良提供新的基因资源和技术保障，应用其可培育出抗逆性和耐逆性增强的植物种子。

附图说明

图1为T-DNA***位点示意图。

图2为atmyc1突变体中ATMYC1基因的转录水平鉴定。

图3为ATMYC1基因在野生型拟南芥中被缺铁胁迫诱导表达。

图4为atmyc1突变体与野生型植株（WT）在培养皿上垂直培养，分别直接点种于MS与-Fe的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周的比较照片，其中MS培养基为对照。

图5为ATMYC1基因的克隆、ATMYC1过表达载体鉴定及ATMYC1过表达植株的筛选。

图6为ATMYC1过表达植株中ATMYC1基因的表达水平检测。

图7为ATMYC1过表达植株（OE1和OE5）与野生型植株（WT）在培养皿上垂直培养，分别直接点种于MS、-Fe的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周的比较照片，其中MS培养基为对照。

图8为野生型与atmyc1突变体植株根、茎中的铁含量比较。

图9为atmyc1植株与野生型植株在MS培养基上正常生长2周，再移致-Fe培养基处理3天后检测缺铁相关基因的表达水平。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。

下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1 ATMYC1突变体的获得

我们利用从美国拟南芥种质资源库获得的拟南芥突变体种子筛选响应植物缺铁胁迫的突变体。使用不含有铁的MS培养基对拟南芥种子突变体库进行筛选，获得了一株对缺铁耐受的突变体，筛选鉴定发现该突变体为ATMYC1基因功能缺失突变体，命名为atmyc1-1，其种子编号为SALK-056899。为了进一步研究ATMYC1基因在植物响应缺铁胁迫中作用，我们从美国拟南芥种质资源库获取了另外一个ATMYC1基因功能缺失突变体，命名为atmyc1-2，其种子编号为SALK-057388。因为该种子为T-DNA***突变，通过特异引物进行PCR扩增并测序，测序结果在NCBI数据库Blast比对，综合分析得出T-DNA***位点信息，参见图1。利用半定量PCR，对atmyc1-1和atmyc1-2 突变体材料进行转录水平鉴定，发现这两个突变体中ATMYC1基因的表达水平均显著低于野生型（WT），参见图2。为了进一步确定ATMYC1基因是否参与植物缺铁胁迫响应，我们分别提取了不同时间点缺铁胁迫处理的野生型（WT）拟南芥的RNA并反转录成为cDNA，利用实时定量PCR技术进行ATMYC1基因的转录水平的分析，发现ATMYC1基因表达水平相对于对照组被缺铁胁迫显著抑制，该结果进一步表明ATMYC1是作为负调控因子来响应缺铁胁迫,参见图3。

将野生型(WT)与atmyc1-1和atmyc1-2同时播种于直径为90 mm的培养皿中，培养基为加铁和不加铁的固体培养基，置于22℃恒温光照培养箱中（光周期为16小时光照，8小时黑暗）垂直培养。两周后，可以观察到：在MS培养基上生长的WT、atmyc1-1、atmyc1-2的根长和叶绿素含量等方面均无显著差异,见图4中B和图4中C。在植株直接点种在不含有铁的培养基上培养，atmyc1-1和atmyc1-2表现出明显的缺铁耐受的性状,见图4中A。在缺铁胁迫下，atmyc1-1、atmyc1-2的根长和叶绿素含量明显比WT高，见图4中B和图4中C。上述结果表明，atmyc1-1、atmyc1-2较WT对缺铁胁迫表现出明显耐受。

实施例2、培育缺铁表型敏感拟南芥

1、ATMYC1基因过量表达转基因株系ATMYC1-OE1、OE5的获得

为进一步验证该基因在植物缺铁胁迫调控中的功能，我们构建了ATMYC1基因过量表达载体（35S: ATMYC1）。首先进行目的片段扩增。将野生型拟南芥在MS培养基上正常培养两周，提取植株总RNA，反转录合成cDNA，以合成的cDNA为模板，进行PCR，扩增出足够量的目的产物,见图5中A。再以PCR产物为模板，进行第二次扩增，目的是引入酶切位点。将PCR产物与载体pCAMBIA1301进行酶切回收。再将回收纯化好的目的DNA片段和载体用T4 DNA连接酶连接过夜。将上述连接液转入DH5a中，检测筛选出阳性克隆进行测序。测序结果确定无误后，利用电击转化法转入农杆菌GV3101。电击转化后的农杆菌GV3101，经活化后涂布于含双抗（Kan，Gen）的LB培养基平板。随机挑取单菌落，在含双抗（kan，Gen）的LB培养液中扩培并使用载体引物进行PCR鉴定,见图5中B。PCR扩增片段大小与目的基因一致后，采用浸花法转化拟南芥野生型植株，从而获得ATMYC1基因过表达转基因株系,见图5中C。其中，

引物1：F 5' NNNGGTACCATGTCTTTGACAATGGCTGATG 3'；

引物2：R 5' NNNAAGCTTTTAATGAAAGATACAAATCGCCC 3'。

2、ATMYC1过表达转基因植株转录水平鉴定及与野生型植株的缺铁性比较

利用半定量PCR我们对ATMYC1过表达转基因植株进行了转录水平的鉴定，最终选择OE1和OE5进行下一步实验,参见图6。将野生型(WT)与ATMYC1-OE1和OE5同时播种于直径为90 mm的培养皿中，培养基为加铁和不加铁的固体培养基，置于22℃恒温光照培养箱中（光周期为16小时光照，8小时黑暗）垂直培养。两周后，可以观察到：在MS培养基上生长的WT和ATMYC1-OE1、OE5在根长、叶绿素等方面均无显著差异,见图7中B和图7中C；在植株直接点种在不含有铁的培养基上培养ATMYC1-OE1、OE5都表现出明显的缺铁敏感的性状,见图7中A。在缺铁胁迫下，ATMYC1-OE1、OE5的根长和叶绿素含量明显比WT低，见图7中B和图7中C。上述结果表明，ATMYC1-OE1和OE5较WT对缺铁胁迫表现出更加明显的敏感性状，进一步证明了ATMYC1基因作为负调控因子从而响应缺铁胁迫的调控。

3、野生型和atmyc1突变体植株根、茎中的铁含量分析

atmyc1突变体和野生型植株（WT）在培养皿上垂直培养，分别直接点种于加铁和缺铁的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周。分别检测MS和-Fe处理条件下WT、atmyc1-1、atmyc1-2植物中根和茎中的铁含量。结果发现，在正常条件下，atmyc1-1、atmyc1-2茎和根中的铁含量要较野生型WT无明显差异，见图8中A和图8中B；在缺铁条件下，atmyc1-1、 atmyc1-2茎和根中的铁含量均高于野生型WT，见图8中A和图8中B，上述结果进一步表明了ATMYC1作为负调控因子从而增强植物缺铁耐受及积累的基因及其编码蛋白。

4、缺铁胁迫下atmyc1突变体与野生型WT植株中缺铁相关基因表达水平比较

取在缺铁胁迫处理3天条件下的atmyc1与野生型WT植株，提取RNA并反转录成cDNA后进行利用qRT-PCR技术，对相关基因（FIT、IRT1、FRO2）表达水平进行测定，发现atmyc1植株体内FIT、IRT1、FRO2基因表达水平明显高于WT，见图9中A、图9中B、图9中C，表明atmyc1植株对缺铁耐受可能与FIT、IRT1、FRO2基因表达显著诱导有关。

序列表

<110> 合肥工业大学

<120> 一种增强植物缺铁耐受及铁积累的功能基因及应用

<130> 2021

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1743

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgtctttga caatggctga tggtgtagaa gctgcagcag gaagaagtaa aagacaaaac 60

agcttattaa gaaaacaact tgctttagct gtaagaagtg ttcaatggag ctacgcaatc 120

ttctggtcgt cttcacttac tcaacctggg gttttggagt ggggagaagg atgttacaat 180

ggagatatga agaagaggaa gaagagttat gaatctcatt ataaatatgg gttgcaaaaa 240

agcaaggagc ttcggaaact ttatttgtct atgcttgaag gagacagtgg tactactgtt 300

agtactactc atgataatct caatgatgat gatgataatt gtcacagtac aagtatgatg 360

ctgtcaccag atgacctctc tgatgaagag tggtactatt tagtctccat gtcctatgtc 420

ttctctcctt cacaatgttt gcctggaaga gcttcagcga cgggtgagac catatggctc 480

tgcaacgctc aatatgcgga gaacaagctc ttctctcgtt ctttgttagc aagaagcgca 540

tcaattcaga ctgttgtgtg tttcccttac ttgggcggag tcattgagct gggcgtcact 600

gaattgattt cagaagacca taacctgctt cgaaacatca aatcttgctt gatggaaata 660

tctgcacacc aagacaacga tgacgagaag aagatggaga ttaagatcag tgaagagaag 720

catcagcttc cattaggtat ttctgatgaa gacttgcatt acaaaagaac catttcaaca 780

gtactcaact actccgcaga tagatcaggt aagaacgata agaacattcg tcatcgtcag 840

ccaaatattg ttacttctga acctggctca agtttcttgc ggtggaagca atgtgagcag 900

caagtctcgg gttttgttca gaaaaaaaag tcacagaatg tgttgcggaa gatattgcat 960

gatgtccctt tgatgcacac aaagagaatg ttcccaagtc agaactctgg tctgaatcaa 1020

gatgatcctt cagatagaag aaaagagaac gaaaagttca gtgtccttag aactatggtt 1080

cccactgtca acgaggttga taaagaatcg atactaaaca acacaatcaa gtacctgcaa 1140

gaactggagg caagagtaga agagctagaa tcttgtatgg gatcagttaa ttttgtagaa 1200

agacaaagaa agacgacaga gaaccttaac gactctgtgt tgatcgaaga gacatcaggg 1260

aactacgatg atagcacgaa gatcgatgac aattcaggag aaaccgaaca agtcactgtt 1320

ttcagagata agacacattt gagagttaaa ctcaaagaaa cagaagttgt gatcgaagta 1380

agatgttctt acagagacta catagttgcg gacatcatgg aaactctgag caatcttcac 1440

atggatgctt tctctgttag atctcacacg ctcaataagt tcctcacatt gaatctcaag 1500

gccaagtttc gcggggctgc agttgcgtcc gtaggaatga ttaagcgaga gctgagaaga 1560

gtcattgact ttcgtgaacc gatatgcgat gtgccattat ctttacatca agttttcagg 1620

gtttttgtat gtaaagtttg ccaaagtttg gttggaattt tcgacaacgt tgtctcttcc 1680

tcttctacaa aaccaagatc tatacttatt cataattcat gggcgatttg tatctttcat 1740

taa 1743

Claims (3)

1.一种增强植物缺铁耐受及铁积累的功能基因，其特征在于：所述功能基因的DNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的增强植物对缺铁耐受及铁积累的功能基因的应用，其特征在于：将序列表SEQ ID No：l所示的增强植物对缺铁胁迫耐受性及铁积累的功能基因在植物中进行敲除，即在植物中不表达，植物表现为缺铁耐受性状，所述植物为拟南芥。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将序列表SEQ ID No：l所示的增强植物缺铁耐受及积累的功能基因通过T-DNA***的方法，实现将拟南芥中的负调控蛋白ATMYC1基因敲除。

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