CN103570805A - 一种活性多肽及其在植物根部发育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种活性多肽及其在植物根部发育中的应用。具体地，发明人发现一种新的分离的多肽及其前体，所述多肽从N’端到C’端依次为：Y、I、Y、T、N。本发明还提供了所述多肽的衍生物及其前体。所述的活性小肽具有种属特异性，并参与植物根部的发育，能促进拟南芥根部的增长，增加侧根的形成，对豆科植物根瘤的形成具有促进作用。

Description

一种活性多肽及其在植物根部发育中的应用

技术领域

本发明属于植物生理学领域，具体地，本发明涉及一种活性多肽及其在植物根部发育中的应用。

背景技术

根是植物在长期适应陆地生活过程中发展起来的器官，担负着吸收水分和溶质以及使植物固着在基质上的作用。空气中存在着大量的分子态的氮气，它们约占空气成分的80%。据估计，在整个大气层中，约有4×10¹⁵t的分子态氮。然而，绝大多数的植物只能从土壤中吸收结合态氮，用来合成自身的含氮化合物(如蛋白质等)。土壤中的含氮化合物，不是土壤本身固有的，而是在生物生命活动过程中逐渐积累起来的，其中很大一部分来自微生物的生物固氮。据估计，地球表面上每年生物固氮的总量约为10t，其中豆科植物体内根瘤菌的固氮量约为55t，占生物固氮总量的55%左右。根瘤是在植物根系上生长的一种特殊的瘤，是寄生组织中建成共生的固氮细菌形成的，植物的根瘤可以合成自身的含氮化合物，如蛋白质等。

根瘤的形成过程大致为：聚集在根毛顶端的根瘤菌分泌一种纤维素酶，这种酶将根毛细胞壁溶解掉，根瘤菌从根毛尖端侵入根的内部，产生感染丝，根瘤菌不断地进入根毛，并且大量繁殖，在根瘤菌侵入的刺激下，根细胞分泌一种纤维素，将感染丝包围起来，形成一条分枝或不分枝的纤维素鞘，叫做侵入线，侵入线不断地延伸，直到根的内皮层，根的内皮层处的薄壁细胞，受到根瘤菌分泌物的刺激，产生大量的皮层细胞，从而使该处的组织膨大，最后形成根瘤。

根瘤菌的固氮作用是在常温、常压下进行的。根瘤固氮具有固氮效率高、无污染、成本低、收益高等优点。根瘤菌的固氮能力，不仅取决于土壤条件和农业措施，也取决于植物品种，人工培养的一些根瘤菌品系的固氮能力往往比野生品系的固氮能力高几倍。

本领域目前还没有找到一种可以直接应用的影响植物根部发育特别是影响植物根瘤形成的基因或活性物质。因此迫切需要进行影响农业植物尤其是豆科植物的根部发育的研究及开发。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的植物磺酸化肽及其在植物根部发育中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的活性多肽，所述的活性多肽任选自下组：

(1)从N’端到C’端依次为Y、I、Y、T、N的多肽；

(2)上述(1)中多肽的衍生物；

(3)上述(1)中多肽或(2)中多肽的衍生物的前体。

在另一优选例中，所述的活性多肽来源于植物，较佳地来源于豆科植物。

在另一优选例中，(2)中所述的衍生物为磺酸化衍生物。

在另一优选例中，所述多肽的磺酸化位点为酪氨酸残基（Y）；较佳地，所述多肽的2个酪氨酸残基都被磺酸化。

在本发明的第二方面，提供了编码第一方面所述活性多肽的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸为如SEQ ID NO.:11-20任一所示的多核苷酸。

在本发明的第三方面，提供了一种含有本发明第二方面所述多核苷酸的载体。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明的第二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供了第一方面所述活性多肽，或第二方面所述多核苷酸的用途，所述用途选自下组的一种或多种：

(a)用于调节植物侧根数目；

(b)用于调节植物根的长度；

(c)用于调节豆科植物根瘤的形成。

在本发明的第六方面，提供了一种制备转基因植物的方法，包括步骤：

将编码第一方面所述活性多肽的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物。

在另一优选例中，所述的多核苷酸为序列如SEQ ID NO.:11-20任一所示的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的植物为豆科植物，较佳地任选自：大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脉根、木豆、豌豆、蚕豆、红豆、绿豆、田菁等。

在本发明的第七方面，提供了一种制备第一方面所述活性多肽的方法，所述方法任选任自下组：

(1)培养第四方面所述的宿主细胞，收集获得第一方面所述的活性多肽；

(2)人工化学合成第一方面所述的活性多肽；

(3)从含有第一方面所述活性多肽的植物组织或器官中提取所述的活性多肽。

在另一优选例中，(3)中所述的植物为豆科植物，较佳地任选自：大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脉根、木豆、豌豆、蚕豆、红豆、绿豆、田菁等。

在另一优选例中，(3)中所述的植物器官为根或根瘤。

在本发明的第八方面，提供了一种改良植物性状的方法，所述的植物性状选自下组：

(a)增加植物侧根数目；

(b)增加植物根的长度；

(c)促进豆科植物根瘤的形成，

包括步骤：提高所述植物中第一方面所述活性多肽或其或其编码基因的表达水平。

在另一优选例中，所述植物中第一方面所述活性多肽的表达水平提高10%以上，较佳地提高30%以上，更佳地提高50%以上，更佳地提高70%以上，更佳地提高90%以上，最佳地提高100%以上。

在本发明的第九方面，提供了一种方法，所述的方法任选自下组：

(a)增加植物侧根数目的方法；

(b)增加植物根的长度的方法；

(c)促进豆科植物根瘤的形成的方法，

包括步骤：向所述的植物施用本发明第一方面所述的活性多肽。

在另一优选例中，所述活性多肽的施用浓度为0.1-1000μM，较佳地10μM。

在另一优选例中，将第一方面所述的活性多肽与所述的植物（优选植物根部）接触。

在另一优选例中，(a)或(b)中所述的植物为：拟南芥、水稻、或烟草。

在另一优选例中，(c)中所述的豆科植物为大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脉根、木豆、豌豆、蚕豆、红豆、绿豆、田菁等。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）编码基因的组成和结构。

图2显示大豆、蒺藜苜蓿和百脉根中NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）编码基因的表达结果；其中，图2A显示大豆中NGF编码基因在根毛、根系和根瘤中表达，其中在根瘤中表达量最高；图2B显示在蒺藜苜蓿中，NGF编码基因在根瘤中特异表达；图2C显示百脉根中NGF编码基因在根系、叶和根瘤中表达，其中在根瘤中表达量最高；图2D显示，百脉根中NGF编码基因在根系中的表达受根瘤菌诱导。

图3显示蒺藜苜蓿中NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）编码基因扰乱后的结瘤测试结果。

图4显示NG F小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）的质谱鉴定结果。

图5显示了在拟南芥（A）、大豆根瘤（B）、百脉根根瘤（C）、紫花苜蓿根瘤（D）、烟草（E）、水稻（F）中NGF的含量，G为化学合成的NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）。

图6显示苜蓿不同组织（A，蒺藜苜蓿的花器官；B，蒺藜苜蓿的叶子；C，紫花苜蓿的叶子；D，紫花苜蓿根瘤；E，蒺藜苜蓿的果荚；F，紫花苜蓿的根系；G，紫花苜蓿的茎）的NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）含量的分析结果。

图7显示NG小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）F对拟南芥根系生长的影响结果。

图8显示NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）对百脉根和蒺藜苜蓿结瘤的影响。

图9显示NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）对拟南芥侧根数目的影响。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，具体地，发明人意外发现一种新的活性多肽，所述多肽从N’端到C’端依次为Y（Tyr）、I（Ile）、Y（Tyr）、T（Thr）、N（Gln）；本发明还包括所述多肽的衍生物及其前体；所述的活性多肽具有种属特异性，并参与植物根部的发育，能促进拟南芥根部的增长，增加侧根的形成，对豆科植物根瘤的形成具有促进作用。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，术语“本发明的小肽”，“本发明的活性多肽”，或“本发明的多肽”可以互换使用，都是指N’端到C’端依次为Y、I、Y、T、N的小肽，其中，所述的Y为Tyr，I为Ile，T为Thr，N为Gln。

如本文所用，术语“本发明的多肽衍生物”或“本发明的小肽衍生物”可以互换使用，都是指本发明的具有YIYTN结构的多肽的衍生物；较佳地为磺酸化衍生物；磺酸化位点优选酪氨酸残基；更优选地，小肽中的所有酪氨酸残基都被磺酸化。

如本文所用，术语“NGF小肽”是指结构为（Y(SO3)IY(SO3)TN）的磺酸化小肽。

本发明还包括上述多肽（或其衍生物）的前体。

例如：在部分种属中，NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）前体的氨基酸序列见下：

>GmNGF1ab

MRLSKPTLLL FLVFIFTTVQ GQAVTNERVV GSESVVSFEL RRSGGCEKQG FEYREGNGGL    60

EDTVLENEDY IYTNSLP                                                   77

（SEQ ID NO.：1）

>GmNGF2

MRLSKPALLL FLVFIFTVVQ GQAVTNERVV CSKSSTTVRR SGGCEKQGFE YKEGNGGLED    60

TVLENEDYIY TNFLP                                                     75

（SEQ ID NO.：2）

>LjNGF

MKLLKPALFL CLVSIFIVVY VVQREAVTNE QVAGGASQSS VTVKRSGCEK QGFECKEGSG    60

GSQDTVLENE DYIYTNSLP                                                 79

（SEQ ID NO.：3）

>MtNGF1

MRLSKPTLIL FVFFIFTVTC VVQMEAVINE RVVDAGSGSS SVNVVRRGEC EKQGVECKQV    60

NGGNEDNDLE SEDYIYTNSV LP                                             82

（SEQ ID NO.：4）

>PsNGF

RVVKGGGSGS NSTTVVVRRG ECEKQGVECE KENGENEETD LENEDYIYTN SVLP          54

（SEQ ID NO.：5）

>CcNGF1

MRLSKPALLL FRRGGCEKQG VECKEGNGGL EDTVLENEDY IYTNSLP                  47

（SEQ ID NO.：6）

>CgNGF

GRAQSKYHEV FETRFFLFLV FCYLTFVSEG KSDTTESFVG SGGASANEGR AECGQGDVEC    60

KEGSRGSADN LFENEDYIYT NSLP    84

（SEQ ID NO.：7）

>QpNGF

NEFSRLAFLL TLAFIYYLIF VAQGKADTNE LLVGSAGTSV NEGRAECSKD AVECKEGNGG    60

SEENAYENED YIYTNSLP    78

（SEQ ID NO.：8）

>VvNGF

MRFSGPYMFL FLAFFFYLVF AIQGKEDTNG VTRRKVLSAE KEMEEQKSVF ESEDYIYTNS    60

LP                                                                   62

（SEQ ID NO.：9）

>CsNGF

MQGRAECGKE QNVECKKRSD QEDDVFEDED YIYTNSLP                            38

（SEQ ID NO.：10）

其中，Gm表示Glycine max（大豆），Lj表示Lotus japonicus（百脉根），Mt表示Medicago truncatula（蒺藜苜蓿），Ps表示Pisum sativum（豌豆），Cc表示Cajanus cajan（木豆），Cg表示Casuarina glauca（木麻黄），Qp表示Quercuspetraea（无梗花栎），Vv表示Vitis vinifera（葡萄），Cs表示Cannabis sativa（***）。

如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。“分离的多肽”是指所述的小肽基本上不含天然与其相关的其它肽、脂类、糖类或其它物质。

本领域的技术人员能用常规方法，如标准的小肽纯化技术纯化。基本上纯的小肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带，其纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的活性多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主。

修饰(通常不改变一级结构)的形式包括：体内或体外的化学衍生形式如乙酰化、羧基化、糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

活性多肽的编码序列

本发明还提供了编码本发明活性多肽的多核苷酸，所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

术语“编码本发明活性多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽或其衍生物的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列（如信号肽序列）的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

本发明的核苷酸序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。可以完全通过化学合成来得到编码本发明的小肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的小肽序列中。用于PCR的引物可根据本文所公开的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。

在部分种属中，编码NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）的CDS序列如下：

>GmNGF1ab

atgagactct ccaaaccaac attgcttctc ttcctggttt tcatcttcac tactgttcaa      60

gggcaagcag ttaccaacga acgagttgtt ggttctgaga gtgtcgtgag ttttgaattg     120

agaagatcag gtggctgtga aaaacaaggc tttgagtaca gggaaggaaa tggtgggttg     180

gaagatacag ttttggagaa tgaagactac atctacacca actctttgcc ttag           234

（SEQ ID NO.：11）

>GmNGF2

atgagactct ccaagccagc attgcttctc ttcctggttt tcatcttcac tgttgttcaa      60

gggcaagcag ttaccaacga acgagttgtg tgttctaaga gttctaccac tgtcagaaga     120

tcaggtggct gtgaaaaaca aggctttgaa tacaaggaag gaaatggtgg gttggaagac     180

acagttttgg agaatgaaga ctacatctac accaacttct tgccttag                  228

（SEQ ID NO.：12）

>LjNGF

atgaaactct tgaaaccagc actgtttctc tgtctagttt ccatcttcat tgtggtatat      60

gttgttcaaa gggaagcagt taccaatgaa caagttgccg gtggtgcttc tcagagttct     120

gttactgtta aaagaagtgg ctgtgaaaaa cagggttttg agtgcaagga aggaagtggt     180

ggatcacagg acacagtttt ggagaatgaa gattacatct acaccaactc tttaccttag     240

（SEQ ID NO.：13）

>MtNGF1

atggaagcag tgatcaacga acgagttgtt gatgctggct ctggaagtag ttctgtcaat     60

gttgttagaa gaggtgaatg tgaaaaacaa ggcgttgagt gcaagcaagt aaatggtggt    120

aatgaagata acgatttgga gagtgaagac tatatctaca ccaactcagt gttaccctag    180

（SEQ ID NO.：14）

>PsNGF

atgagactct caaaggcaac attgtttctc ttcgtttttt tcatcttcat tgttacatgt     60

gttgttgaaa gagaagyrgt rgtcaacgsa cgagttgtga aaggtggtgg ctctggaagt    120

aattctacca ctgttgttgt tagaagaggt gagtgtgaaa aacaaggagt tgagtgcgag    180

aaagaaaatg gtgagaatga agaaactgat ttggaaaatg aagattacat ctacaccaac    240

tctgtgttac cttag                                                     255

（SEQ ID NO.：15）

>CgNGF

gggagggctc agagcaagta ccatgaggtt ttcgaaactc gcttctttct ctttctggtt     60

ttctgctatt tgacatttgt atctgagggg aaatcagata ccactgaatc gttcgtgggc    120

tctggagggg cttcagcaaa tgagggaaga gctgagtgtg gccaggggga tgtcgagtgc    180

aaagaaggaa gtcgtgggtc ggcagataat cttttcgaga atgaagatta catctacacc    240

aactctcttc cttga                                                     255

（SEQ ID NO.：16）

>QpNGF

aatgaatttt caagactggc tttcttactc actttggctt tcatttacta tttgatattt     60

gttgctcaag ggaaagcaga caccaatgaa ttgctggtgg gttctgcagg gacttctgtc    120

aatgagggaa gagctgagtg tagcaaggat gcggttgagt gcaaagaagg aaatggtggg    180

tcagaagaga atgcttatga gaatgaggat tatatctaca ccaactctct tccttag       237

（SEQ ID NO.：17）

>CsNGF

atgcagggta gagcagagtg tgggaaggaa caaaatgttg agtgcaaaaa aaggtcagat     60

caagaagatg atgtgtttga ggatgaagat tacatctaca ccaactcact cccttaa       117

（SEQ ID NO.：18）

>VvNGF

atgagatttt caggccccta tatgtttctc ttcctggctt tcttcttcta tttggtgttt     60

gctattcaag ggaaagagga taccaatggt gtgacaagaa ggaaagtgtt gagtgcagag    120

aaggaaatgg aggagcagaa gagtgttttt gagagcgagg actacatcta caccaactcc    180

ctaccttag                                                            189

（SEQ ID NO.：19）

>CcNGF

atgagactct ccaaaccagc attgcttctc ttcagaagag gtggctgtga aaagcaaggt     60

gttgagtgca aggaaggaaa tggtgggttg gaagacacag ttttggagaa tgaggattac    120

atctacacca actctttgcc ttag                                           144

（SEQ ID NO.：20）

其中，Gm表示Glycine max（大豆），Lj表示Lotus japonicus（百脉根），Mt表示Medicago truncatula（蒺藜苜蓿），Ps表示Pisum sativum（豌豆），Cc表示Cajanus cajan（木豆），Cg表示Casuarina glauca（木麻黄），Qp表示Quercuspetraea（无梗花栎），Vv表示Vitis vinifera（葡萄），Cs表示Cannabis sativa（***）。

本发明活性多肽的制备方法

本领域的普通技术人员可以使用常规方法制备本发明的活性多肽如生物合成，全化学合成，或植物体中提取等方法。

在一个优选的实施例中，生物合成法有以下步骤：

(1).用编码本发明活性多肽或其衍生物的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化本发明的活性多肽。

本发明中，多核苷酸序列可***到重组表达载体中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含所述多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。包含上述适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达本发明的活性多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的活性多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明的活性多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化所述的活性多肽。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明活性多肽的功能及应用

本发明还提供了本发明活性多肽的功能及其应用。所述多肽可以用于：(a)调节植物侧根数目；(b)调节植物根的长度；(c)调节豆科植物根瘤的形成。

本发明还提供了一种制备转基因植物的方法，包括步骤：

将编码本发明所述活性多肽的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物。较佳地，所述的多核苷酸为序列如SEQ ID NO.:11-18任一所示的多核苷酸。

本发明还提供了一种改良植物性状的方法，所述的植物性状选自下组：

(a)增加植物侧根数目；(b)增加植物根的长度；(c)促进豆科植物根瘤的形成，

包括步骤：提高所述作物中本发明所述活性多肽或其衍生物的表达。

在另一优选例中，所述多肽或其衍生物的表达量提高10%以上，较佳地提高30%以上，更佳地提高50%以上，更佳地提高70%以上，更佳地提高90%以上，最佳地提高100%以上。

本发明还提供了一种增加植物侧根数目的方法；或增加植物根的长度的方法；或促进豆科植物根瘤的形成的方法，包括步骤：将本发明所述的多肽或其衍生物与所述的植物接触。较佳地，将本发明所述的多肽或其衍生物与所述植物的根部接触。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）与PSK的同源关系

本实施例比较了NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）与PSK的同源关系，植物磺肽素（Phytosulfokine，PSK）是一种普遍存于植物中的肽类激素，它是由5个氨基酸组成的小肽分子，其结构为：Y(SO3)IY(SO3)TQ。

在本实施例中，所有的基因组、基因以及表达序列均来源于NCBI网站，利用ORF finder进行编码序列预测；利用Bioedit进行多序列比对；利用NetPlantGene Server预测基因的内含子和外显子；利用Mega 3.1重建分子***树。

分析结果表明，虽然NGF和PSK在氨基酸序列存在较高的同源性（5个氨基酸中有四个是一致的），但是二者的前体却明显不同，比如：NGF不具有保守的双碱性氨基酸（RR和KH）以及疏水氨基酸区域（LM/IRRT/LAA）等。

重建分子***树发现NGF和PSK的前***于进化树的不同分支上，属于不同的分子类群。因此，NGF和PSK是由不同的基因编码的。

分析NGF和PSK编码基因的组成和结构的结果表明，大豆、蒺藜苜蓿和百脉根的NGF编码基因均由两个外显子和一个内含子组成（图1），该特征与PSK编码基因相似。

实施例2

大豆、蒺藜苜蓿和百脉根中NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）编码基因的表达

采用常规方法提取百脉根（Gifu-B129）根、茎、叶、花、果荚、瘤等各组织的总RNA，通过紫外分光光度计测定总RNA的纯度和浓度。

用PrimeScript RT reagent Kit With a DNA eraser(TaKaRa，DRR047A)反转录合成cDNA。以UBQUITIN为内参通过RT-PCR或者qRT-PCR检测各组织中基因的相对表达。PCR条件如下：94℃3min，94℃30s，60℃20s，72℃30s，72℃7min。

所用引物如下：

LjNGF-F:GGACTAGTCCATGGTACCAATGAACAAGTTGCCGGTGG（SEQ ID NO.:21）

LjNGF-R:CGGGATCCGGCGCGCCTGTTAGTTATCCCTCACTACACCC（SEQ ID NO.:22）

UBQUITIN-F：TTCACCTTGTGCTCCGTCTTC（SEQ ID NO.:23）

UBQUITIN-R：AACAACAGCACACACAGCCAATCC（SEQ ID NO.:24）

检测结果表明，

大豆中NGF编码基因在根毛、根系和根瘤中表达，其中在根瘤中表达量最高（12HA1_IN_RH为接种根瘤菌12个小时的根毛样品；12HA1_UN_RH为未接种根瘤菌12个小时的根毛样品；Apical Meristem为顶端分生组织；flower为花；green pods为绿色果荚；leaves为叶；roots为根；nodule为根瘤）。原始数据来源于大豆转录组数据库（http://www.soybase.org/）（图2A）。

在蒺藜苜蓿中，NGF编码基因在根瘤中特异表达（petiole为叶柄；vegetativebud为叶芽；stem为茎；seed(36dap)为受精36天后的种子；seed coat(16-24dap)为受精16-24天后的种壳；root-0dpi为未接种根瘤菌的根；nodule-4dpi为接种根瘤菌4天的根瘤；root-denodulated为去除根瘤的根系）。原始数据来源于蒺藜苜蓿转录组数据库（http://bioinfo.noble.org/gene-atlas/v2/）（图2B）。

图2C显示百脉根中NGF编码基因在根系、叶和根瘤中表达，其中在根瘤中表达量最高。图2D显示，百脉根中NGF编码基因在根系中的表达受根瘤菌诱导。

以上结果表明，NGF编码基因主要根和根瘤中表达，其中根瘤中的表达量最高。

实施例3

NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）编码基因参与了固氮根瘤的形成

实验方法：构建RNAi株系，首先以Medicago truncatula根瘤cDNA模板，NGFRi-FF，NGFRi-FR为引物扩增463bp片段，将片段和市售的载体pRNAi同时用Nco1，Asc1双酶切，连接，转化DH5a，提取质粒并且酶切，测序鉴定正确并命名为NGFRi-F；然后以Medicago truncatula根瘤cDNA为模板，NGFRi-RF，NGFRi-RR为引物，扩增463bp片段，回收后将片段和NGFRi-F用Spe，BamH1同时双酶切，连接，转化DH5a，酶切测序鉴定正确后命名为NGF-pRNAi，然后用Sac1，Kpn1将NGF-pRNAi，破Cam表2301同时双酶切，连接，转化DH5a，酶切，测序鉴定正确的载体即为NGF-RNAi表达载体。

各个引物序序列如下：

NGFRi-FF    5'-CATGCCATGGCATTTTGAGTGTCGAGCTTTCTGCT-3'（SEQ ID NO.:25）

NGFRi-FR 5'-GGCGCGCCAACATCTATCCATTCCTTTGCAATT-3'（SEQID NO.:26）

NGFRi-RF 5'-GGACTAGTCATTTTGAGTGTCGAGCTTTCTGCT-3'（SEQID NO.:27）

NGFRi-RR 5'CGGGATCCAACATCTATCCATTCCTTTGCAATT3'（SEQID NO.28）

结果表明，在蒺藜苜蓿中，RNAi干扰NGF1编码基因的表达，导致结瘤数目减少。转化空载体的株系，平均每棵植物形成4.7个根瘤，而NGF1 RNAi株系则只有2.6个（图3）。

构建过表达株系的方法：应用NGF-OX-F和NGF-OX-R为引物，以Medicagotruncatula根瘤cDNA为模板，PCR扩增到目标片段（177bp），PCR产物胶回收后经AscI和SpeI酶切。同时，将载体pRNAi经AscI和SpeI酶切回收4373bp的大片段，将两片段连接，得到pRNAi-NGF-OX，将pRNAi-NGF-OX用KpnI和SacI双切后，回收1691bp的小片段，连接到pCAMBIA2301的KpnI和SacI位点之间，构建成NGF-OX载体。

引物序列如下：

NGF-OX-F：GGCGCGCCATGGAAGCAGTGATCAACGAACG（SEQ IDNO.:29）;

NGF-OX-R：GGACTAGTGGGTAACACTGAGTTGGTGTAG（SEQ IDNO.:30。

将重组载体导入发根农杆菌MSU440，转化蒺藜苜蓿一周幼苗。三周后，鉴定转化根系，移栽幼苗，接种根瘤菌。温室培养一个月左右，统计根瘤数目。

结果表明，过量表达NGF1编码基因则导致结瘤数目增加，平均每株达到5.8个（图3）。

实施例4

NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）的化学合成与鉴定

同源序列分析表明NGF做为一个酪氨酸磺酸化修饰的五肽，分子量为832.8289。通过全人工化学法合成了NGF肽，经过HPLC纯化后，纯度达到97%，质谱鉴定分子结构正确无误（图4）。

实施例5

NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）的分布

取新鲜的植物材料约200mg，研磨至粉末状，加入400μl的去离子水，充分混匀后12000×rpm离心10分钟。取上清，用0.22μm的滤器过滤后，取5-10μl进行LC/MS分析，以人工合成的NGF为标准样品，确定该类分子是否存在于植物体内。

结果表明，以人工合成的NGF为标样，提取非豆科植物水稻、拟南芥和烟草幼苗中水溶性分子，进行Q-TOF LC/MS分析，没检测到NGF分子，而该类分子在大豆、蒺藜苜蓿和百脉根根瘤中大量积累。图5显示了在拟南芥（A）、大豆根瘤（B）、百脉根根瘤（C）、紫花苜蓿根瘤（D）、烟草（E）、水稻（F）中NGF的含量，G为化学合成的NGF。

图6显示苜蓿不同组织的NGF含量的分析结果，A为蒺藜苜蓿的花器官；B为蒺藜苜蓿的叶子；C为紫花苜蓿的叶子；D为紫花苜蓿根瘤；E为蒺藜苜蓿的果荚；F为紫花苜蓿的根系；G为紫花苜蓿的茎)。结果表明，NGF分布在苜蓿的叶、根和根瘤中，根瘤中的含量最高。

实施例6

NGF小肽（Y(SO3)IY(SO3)TN）的生物学效应

将人工合成的NGF溶解于一定量的无菌重蒸水中，分别以浓度为0.01、0.1、1、10、100μM的小肽处理发芽一周的拟南芥幼苗。培养两周以后，测量拟南芥的根长，进行统计学分析。

取蒺藜苜蓿和百脉根种子灭菌处理后，于28℃倒置培养过夜萌发。将萌发的种子移到相应的培养基的平皿中（蒺藜苜蓿用无氮的FM，百脉根用B&D培养基）。将平皿垂直于光照培养箱中培养一周至根长约2cm左右。接种含有不同浓度梯度人工合成NGF的根瘤菌。根瘤菌的培养，挑取根瘤菌于5mL培养液中28℃过夜，按1%转接到适量培养基28℃培养至OD值在0.8到1.0。4℃，4500转离心收集菌体，生理盐水重悬后4℃，4500转离心收集菌体，然后用生理盐水悬浮至OD至在0.01到0.03之间。光照培养箱中，16小时光照，8小时黑暗，培养4周，计算根瘤的数目，进行统计学分析。

图7显示NGF对拟南芥根系生长的影响结果，应用NGF处理非豆科植物拟南芥的幼苗，发现高于0.1μM浓度的小肽就可以促进根的伸长，与PSK类似，**表示T检验差异极显著。

图8显示NGF对百脉根和蒺藜苜蓿结瘤的影响，应用NGF和根瘤菌共接种百脉根和蒺藜苜蓿幼苗，发现对根瘤的形成有不同程度的促进作用。其中10μM以上浓度的NGF可以显著促进百脉根根瘤的形成；在蒺藜苜蓿上，NGF也可以促进固氮根瘤的形成（提高10%左右），而10μM的小肽分子却对根瘤的形成具有明显的抑制作用，**表示T检验差异极显著。

图9显示了NGF对拟南芥侧根数目的影响，表明NGF影响拟南芥侧根形成。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种分离的活性多肽，其特征在于，所述的活性多肽任选自下组：

(1)从N’端到C’端依次为Y（Tyr）、I（Ile）、Y（Tyr）、T（Thr）、N（Gln）的多肽；

(2)上述(1)中多肽的衍生物；

(3)上述(1)中多肽或(2)中多肽的衍生物的前体。

2.如权利要求1所述的活性多肽，其特征在于，(2)中所述的衍生物为磺酸化衍生物。

3.编码权利要求1所述活性多肽的多核苷酸。

4.一种含有权利要求3所述多核苷酸的载体。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

6.权利要求1所述活性多肽，或权利要求3所述多核苷酸的用途，其特征在于，所述用途选自下组的一种或多种：

(a)用于调节植物侧根数目；

(b)用于调节植物根的长度；

(c)用于调节豆科植物根瘤的形成。

7.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，包括步骤：

将编码权利要求1所述活性多肽的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物。

8.一种制备权利要求1所述活性多肽的方法，其特征在于，所述方法任选任自下组：

(1)培养权利要求5所述的宿主细胞，收集获得权利要求1所述的活性多肽；

(2)人工化学合成权利要求1所述的活性多肽；

(3)从含有权利要求1所述活性多肽的植物组织或器官中提取所述的活性多肽。

9.一种改良植物性状的方法，所述的植物性状选自下组：

(a)增加植物侧根数目；

(b)增加植物根的长度；

(c)促进豆科植物根瘤的形成，

其特征在于，包括步骤：提高所述植物中权利要求1所述活性多肽或其或其编码基因的表达水平。

10.一种方法，所述的方法任选自下组：

(a)增加植物侧根数目的方法；

(b)增加植物根的长度的方法；

(c)促进豆科植物根瘤的形成的方法，

其特征在于，包括步骤：向所述的植物施用权利要求1所述的活性多肽。

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