CN110922504A - 一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其解决现有透明质酸制备工艺复杂、成本高、提取纯度低的问题。其经过以下步骤：1）原料预处理；2）透明质酸提取；3）除杂；4）透析、干燥。本发明采用丙酮预处理鱿鱼眼，使蛋白质变性聚集，再通过浮选技术提取透明质酸，经超临界二氧化碳流体和酶解脱除脂肪和蛋白等杂质，最后通过透析制备一定分子量范围的透明质酸。本发明操作工艺简单，成本低，安全性高，且产品纯度高，分子结构稳定，保证产品的生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及透明质酸的制备，尤其是一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸(HA)又名玻尿酸，是一种不含硫的天然大型多糖类，由双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的一种阴离子酸性粘多糖。因其超强的持水性、黏弹性和渗透性以及生物学功能，被广泛应用于保健品、化妆品和医药领域。
目前，HA的制备主要有动物组织提取法和细菌发酵法，但是HA提纯过程中，脂肪、蛋白质和发酵菌等杂质降低了HA的纯度，限制了其应用。现有报道的纯化方法有季铵盐法、氯仿沉淀法、层析法、醇沉法、膜滤法、离心法和絮凝法。然而，季铵盐法制备HA含有蛋白质，HA纯度低，且季铵盐用量较大；氯仿沉淀法工艺复杂，且造成人体和环境危害；多糖的高粘性致使离心法难以除去杂质；层析法、醇沉法、膜滤法和絮凝法生产成本高、杂质去除不彻底。开发获得高纯度的透明质酸的方法意义重大。
HA的生物活性和使用效果与其相对分子量直接相关，研究发现，具有较好的粘弹性、保湿性、润滑性、抑菌性等功能的HA分子量大于2000KDa；具有良好的润滑性、保湿性和药物缓释等作用的HA分子量在1000～2000KDa范围；具有抗肿瘤、免疫调节、促创伤愈合、血管和骨生成等功能的HA分子量小于1000KD。因此，根据需要制备不同分子量的HA变得至关重要。现有技术通过酶降解、酸碱处理、物理处理等直接降解HA，如专利CN102876748A、CN102648214A、CN104059166A、CN105777937A等制备的HA，但这些研究工艺复杂、成本高。
鱿鱼是我国重要的水产加工原料，产生30%的加工副产物，缺乏有效的利用途径，通常用于加工鱼粉的原料。加工下脚料中鱿鱼眼约占5％，鱿鱼眼含玻璃体，可以用作HA提取的资源，目前尚未得到充分利用。
发明内容
为了克服现有透明质酸制备工艺复杂、成本高、提取纯度低的不足，本发明的目的在于提供一种鱿鱼眼提取透明质酸的方法。该方法将粉碎的鱿鱼眼用丙酮处理，使其变性，通过离子浮选技术提取HA，经超临界二氧化碳流体和酶解脱除脂肪和蛋白等杂质，最后利用透析结合醇沉法制备一定分子量范围的高纯度HA。本发明方法操作工艺简单，成本低，安全性高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其特征在于：其经过以下步骤：
（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其2-5倍重量的丙酮，静置10-15min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；
（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其5-10倍重量、质量分数为1-15%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡；在收集的气泡中加入气泡重量2-5倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用酸溶液调节pH值为5-6，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；
（3）除杂：将步骤（2）中得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量2-6%的蛋白酶，酶解并在结束后灭活，离心，取上清液；
（4）透析、干燥：将步骤（3）得到的上清液转移至透析袋中，经过两步透析，在室温下共透析20-24h，取第二步透析的去离子水，加入其1-3倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。
本发明的优选方面，在步骤（2）中，所述的酸溶液为盐酸溶液、柠檬酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液中的一种或两种以上。
本发明的优选方面，在步骤（3）中，所述的超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为20-25MPa、温度控制为20-30℃，二氧化碳流速15-20 kg·h-1，处理时间20-25min。
本发明的优选方面，在步骤（3）中，所述的蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的两种酶组成，两种酶的添加比例为1:1。
本发明的优选方面，在步骤（3）中，所述的酶解的条件为：酶解温度40-50℃，酶解时间60-180min，pH值6-8。
本发明的优选方面，在步骤（4）中，所述的两步透析，其第一步透析用透析袋截留分子量为400000Da的透明质酸，透析时间10-12h；其第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为2200000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间10-12h，最后收集去离子水。
本发明方法中采用丙酮预处理鱿鱼眼，使蛋白质变性聚集，为后续处理减少蛋白质等杂质，有利于HA的纯化；再采用浮选技术处理鱿鱼眼，最大限度减少了杂质，提高初HA纯度，且最大限度的将HA提取出来，形成最少量的提取液，减少了后续处理乙醇的使用量；再采用超临界二氧化碳联合酶解除杂的方法，彻底去除了脂肪和蛋白质；最后采用透析联合有机试剂法，在脱除盐等杂质同时获得不同分子量范围的HA。本发明操作工艺简单，成本低，安全性高，且产品纯度高，分子结构稳定，保证了产品的生物活性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述，所述的实施案例有助于对本发明的理解和实施，并非构成对本发明的限制。
实施例1
一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其经过以下步骤：
（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其3倍重量的丙酮，静置15min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；
（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其7倍重量、质量分数为5%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡；在收集的气泡中加入气泡重量3倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用盐酸溶液调节pH值为6，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；
（3）除杂：将步骤（2）得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理，其中，超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为20MPa、温度控制为25℃，二氧化碳流速18kg·h-1，处理时间20min；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量5%的蛋白酶酶解，其中，蛋白酶由胰蛋白酶和中性蛋白酶组成，其添加比例为1:1；酶解的条件为：酶解温度45℃，酶解时间90min，pH值7；酶解结束后灭活，离心，取上清液；
（4）透析、干燥：将步骤（3）得到的上清液转移至透析袋中，经过两步透析，在室温下共透析22h，其中，第一步透析用透析袋截留分子量为400000Da的透明质酸，透析时间10h；其第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为2200000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间12h，最后收集去离子水；取去离子水，加入其3倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。
实施例2
一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其经过以下步骤：
（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其2倍重量的丙酮，静置15min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；
（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其5倍重量、质量分数为2%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡；在收集的气泡中加入气泡重量5倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用柠檬酸溶液调节pH值为5，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；
（3）除杂：将步骤（2）得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理，其中，超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为25MPa、温度控制为20℃，二氧化碳流速15kg·h-1，处理时间25min；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量2%的蛋白酶酶解，其中，蛋白酶由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其添加比例为1:1；酶解的条件为：酶解温度50℃，酶解时间60min，pH值6；酶解结束后灭活，离心，取上清液；
（4）透析、干燥：将步骤（3）得到的上清液转移至透析袋中，经过两步透析，在室温下共透析20h，其中，第一步透析用透析袋截留分子量为400000Da的透明质酸，透析时间10h；其第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为2200000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间10h，最后收集去离子水；取去离子水，加入其1倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。
实施例3
一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其经过以下步骤：
（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其5倍重量的丙酮，静置12min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；
（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其10倍重量、质量分数为10%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡；在收集的气泡中加入气泡重量5倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用硫酸溶液调节pH值为6，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；
（3）除杂：将步骤（2）得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理，其中，超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为25MPa、温度控制为30℃，二氧化碳流速20kg·h-1，处理时间25min；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量6%的蛋白酶酶解，其中，蛋白酶由胰蛋白酶和胃蛋白酶组成，其添加比例为1:1；酶解的条件为：酶解温度45℃，酶解时间180min，pH值8；酶解结束后灭活，离心，取上清液；
（4）透析、干燥：将步骤（3）得到的上清液转移至透析袋中，经过两步透析，在室温下共透析24h，其中，第一步透析用透析袋截留分子量为400000Da的透明质酸，透析时间12h；其第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为2200000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间12h，最后收集去离子水；取去离子水，加入其3倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。
实施例4
一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其经过以下步骤：
（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其3倍重量的丙酮，静置10min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；
（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其8倍重量、质量分数为15%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡；在收集的气泡中加入气泡重量2倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用醋酸溶液调节pH值为6，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；
（3）除杂：将步骤（2）得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理，其中，超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为22MPa、温度控制为25℃，二氧化碳流速18kg·h-1，处理时间20min；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量5%的蛋白酶酶解，其中，蛋白酶由中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其添加比例为1:1；酶解的条件为：酶解温度40℃，酶解时间90min，pH值7；酶解结束后灭活，离心，取上清液；
（4）透析、干燥：将步骤（3）得到的上清液转移至透析袋中，经过两步透析，在室温下共透析22h，其中，第一步透析用透析袋截留分子量为400000Da的透明质酸，透析时间12h；其第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为2200000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间10h，最后收集去离子水；取去离子水，加入其2倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。
对比例1
在本对比例中，其方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤1）鱿鱼眼原料的处理不用丙酮。
对比例2
在本对比例中，其方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤2）将月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液更换为去离子水。
对比例3
在本对比例中，其方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤1）不使用丙酮处理鱿鱼眼，步骤2）将月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液更换为去离子水。
对比例4
在本对比例中，其方法和对比例3基本相同，其区别在于：不进行步骤3）的超临界二氧化碳除杂处理。
对比例5
在本对比例中，其方法和对比例3基本相同，其区别在于：不进行步骤3）的酶解除杂处理。
对比例6
在本对比例中，其方法和对比例5基本相同，其区别在于：不进行步骤3）的超临界二氧化碳除杂处理。
对比例7
在本对比例中，其方法和对比例6基本相同，其区别在于：不进行步骤4）的透析处理。
透明质酸提取物质量评价：将上述实施例和对比例提取的透明质酸以葡萄糖醛酸含量、蛋白质含量、脂肪含量、灰分含量、透明质酸提取率为指标进行质量比较，结果见表1所示。
表1不同实施例和对比例提取的透明质酸质量指标比较
由表1可知，本发明获得的透明质酸纯度和提取率均取得良好效果，通过改变本发明中丙酮处理、表面活性剂提取、超临界二氧化碳处理、酶解和透析等操作，对比例1-7结果显示，透明质酸纯度和提取率受上述提取操作影响显著，仅在上述操作协同作用，才能获得良好的透明质酸提取效果，对比例1-4也已证明这一结果。实施例4结果表明，本发明可根据需要，获得一定分子量范围的透明质酸，且透明质酸质量不受影响。
透明质酸提取物持水性评价：取各实施例和对比例制备的透明质酸0.5g，在恒湿环境下，通过喷洒水，观察透明质酸的持水性能，以不出现明显的水渗出为终点，称量确定透明质酸含水量，结果见表2。
表2 不同实施例和对比例提取的透明质酸持水性比较
由表2可知，本发明获得的透明质酸持水性良好，可携带486倍的水分，表明提取过程未破坏透明质酸的分子结构，确保了提取的透明质酸的生物学活性。
Claims (6)
1.一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其特征在于：其经过以下步骤：
（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其2-5倍重量的丙酮，静置10-15min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；
（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其5-10倍重量、质量分数为1-15%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡；在收集的气泡中加入气泡重量2-5倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用酸溶液调节pH值为5-6，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；
（3）除杂：将步骤（2）得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量2-6%的蛋白酶，酶解并在结束后灭活，离心，取上清液；
（4）透析、干燥：将步骤（3）得到的上清液转移至透析袋中，经过两步透析，在室温下共透析20-24h，取第二步透析的去离子水，加入其1-3倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。
2.根据权利要求1所述的一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述的酸溶液为盐酸溶液、柠檬酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述的超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为20-25MPa、温度控制为20-30℃，二氧化碳流速15-20 kg·h-1，处理时间20-25min。
4.根据权利要求1所述的一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述的蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的两种酶组成，两种酶的添加比例为1:1。
5.根据权利要求1或4所述的一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述的酶解的条件为：酶解温度40-50℃，酶解时间60-180min，pH值6-8。
6.根据权利要求1所述的一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（4）中，所述的两步透析，其第一步透析用透析袋截留分子量为400000Da的透明质酸，透析时间10-12h；其第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为2200000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间10-12h，最后收集去离子水。
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