CN112521430B - 一种适用于化妆品的硫酸化海带寡糖的规模化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适用于化妆品的硫酸化海带寡糖的规模化制备方法。以海带为原料，预处理采用碱溶液快速漂洗脱脂，高速匀浆粉碎与蛋白酶酶解快速去除全部的粗蛋白以及部分的甘露醇和灰分，而后，经过高温氧化水解将预处理得到的海带残渣快速制备成硫酸化海带寡糖初提液，再利用连续流离心协同膜分离技术在常温下对硫酸化海带寡糖提取液进行分离纯化，得到硫酸化海带寡糖溶液，最后利用喷雾干燥技术快速干燥形成硫酸化海带寡糖粉状物。本发明的方法流程整体简单可行，高效节能，更为适合大规模生产；制备的硫酸化海带寡糖的分子量集中度较高，甚至可以媲美右旋糖苷标准品；且制备的分子量小于1000的硫酸化海带寡糖，特别适合在各种化妆品中使用。

Description

一种适用于化妆品的硫酸化海带寡糖的规模化制备方法

技术领域

本发明涉及到一种适用于化妆品的硫酸化海带寡糖的规模化制备方法，属于化学提取技术与化妆品领域。

背景技术

海带多糖作为海带等褐藻所固有的细胞间多糖，存在于褐藻细胞壁基质中，是褐藻所特有的活性物质。海带多糖是一类多组分混合物，不同提取方法从海带中得到的多糖组成和活性差异较大；此外，海带多糖还存在分子结构复杂，吸收性差，质量不易控制等缺陷，亟需解决。海带寡糖是海带多糖的水解产物，有很多报道称低分子量的海带寡糖还具有如抗肿瘤、抗氧化、抑菌、促生长等生物活性。由于其分子量低，具有水溶性强、稳定性高、安全无毒等优势，海带寡糖在药物研制、功效食品和新型化妆品开发、农业等领域具有广阔的开发前景。因此，海带寡糖既可以作为增强人体免疫力的保健品，又可以成为具有高附加值的新型清除自由基的高端化妆品的核心原料。

目前，海带寡糖的制备方法主要有以海带多糖为原料，经自由基降解、酸解法、碱解法、盐解法、酶解法、超声波降解法或γ-射线降解法降解而得到的多种寡糖的混合物，所得的海带寡糖聚合度为2～30，分子量为342Da～8000Da(一种海带寡糖及其制备方法和它的应用，CN201010213491.X)；或是以海带为原料，经过微生物发酵粗酶液，使用酶解技术制备平均聚合度为7，平均分子量为2846的海带寡糖(具有促进海参生长和抗逆作用的海带寡糖及其制法和应用，CN201510259443.7)；以及以海带为原料，采用特殊微生物接种于海带浆液中，筛选产出寡糖的菌种，经分离纯化得到聚合度为2～20、分子量376～6500Da的海带寡糖混合物(海带寡糖及其制备方法和应用，CN201710930007.7)。以上方法制备的海带寡糖的聚合度分布较广和分子量分布较为分散，且损失了海带多糖特有的天然硫酸根，不利于海带寡糖更快地被人体吸收。目前，尚未发现特别适用于化妆品的硫酸化海带寡糖的制备技术和工艺的专利文献报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的技术解决方案是：

一种适用于化妆品的硫酸化海带寡糖的规模化制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理

将海带原料投入反应釜中，加入海带重量2～10倍的碱溶液或强碱弱酸盐溶液，搅拌15～60分钟，洗去泥沙、海带表面的杂物及粘液，并除掉海带的脂肪，用清水漂洗干净，其中碱溶液的质量体积浓度为1～4％；将洗净后的海带投入反应釜中，加入海带重量3～15倍的去离子水，高速匀浆15～60分钟，匀浆速度为10000～28000转/分，匀浆结束后升温至50～60℃，调节pH为6.0～7.0，加入海带投料重量0.1％～2％的蛋白酶，反应30～60分钟；酶解结束后用连续流离心机高速离心，离心后的海带残渣收集起来再次放入反应釜内，加入海带重量8～15倍的去离子水，搅拌15～45分钟，再用连续流离心机高速离心，去除海带中的粗蛋白、部分甘露醇和灰分，离心后的海带残渣收集待用。

(2)高温氧化水解

将经过预处理并洗净离心后的海带残渣置于反应釜中，加入海带残渣重量的5～10倍的去离子水，加入稀碱液或稀酸液调节pH为5.0～7.0，加入海带残渣重量0.2％～2％的双氧水，反应温度为80～100℃，反应6～8小时；水解结束后得到硫酸化海带寡糖初提液。

(3)分离纯化

连续流离心结合相对分子质量为10kD～5kD的纳滤膜去除硫酸化海带寡糖初提液中的大分子杂质和固体纤维残渣，所得清液再用相对分子质量为500DA～200DA的纳滤膜去除小分子杂质和部分无机盐，并进一步浓缩得到含量≥95％，分子量低于1000的硫酸化海带寡糖溶液。

优选地，本发明的规模化制备方法还包括：

(4)快速干燥与灭菌封装

利用喷雾干燥快速干燥硫酸化海带寡糖溶液，得到硫酸化海带寡糖粉状物；再通过光辐射进行快速灭菌，最后进行无菌分装。

所述步骤(1)所使用的海带原料拉丁学名为Laminaria japonica Aresch。

所述步骤(1)和所述步骤(2)加入碱液或强碱弱酸盐溶液调节pH值所使用的碱或强碱弱酸盐为碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾中的至少一种；酸为盐酸或硝酸。

所述步骤(2)中所使用的蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶和风味蛋白酶中的一种或两种组合。

所述步骤(3)中所使用的相对分子质量为10kD～5kD的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.552-0.931Mpa，温度为20～50℃；所使用的相对分子质量为500DA～200DA的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.483～2.758Mpa，温度为20～50℃。

所述步骤(1)和步骤(3)中所使用的连续流离心机，离心速率为10000～15000rpm。

所述步骤(4)中所使用的喷雾干燥的进风温度为120～180℃、出风温度为70～95℃；所使用的光辐射可使用紫外光辐射、γ-射线或电子束辐射，辐射剂量为0.01～40kGy，辐射时间为1～60分钟。

本发明以来源丰富的海带作为硫酸化海带寡糖的原料，预处理采用高速匀浆结合生物酶解技术，快速去除海带中全部的粗蛋白以及部分的甘露醇和灰分，而后开发一步到位快速制备化妆品用硫酸化海带寡糖的高温氧化水解工艺，制备的硫酸化海带寡糖分子量分布集中度高，且分子量低于1000，更有利于人体皮肤吸收。

经试验表明：添加本发明的硫酸化海带寡糖(2％)的化妆霜、化妆乳液和化妆水，其吸湿保湿性能都优于同含量的甘油化妆品(2％)，其不同机理的抗氧化活性都优于同含量的维生素E化妆品(2％)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.基于海带的主要成分分析结果，本发明利用蛋白、脂肪与碳水化合物之间不同的化学性质，通过碱液快速漂洗脱脂，高速匀浆粉碎与蛋白酶酶解快速去除粗蛋白和部分甘露醇，以及部分的灰分(碘化钾和碘化钠等)，使得预处理后的海带残渣几乎都是硫酸化的海带多糖固体。

2.基于海带多糖的糖苷键较为稳定的特点，本发明选择高温氧化水解法作为海带寡糖的提取方法，既避免了过去专利和文献推崇的复合酶解法带来的冗长的时间成本和昂贵的耗材成本，又能实现提取率有效提升与提取时间的大幅缩短；另一方面，从海带多糖降解到海带寡糖的过程本质上是对海带多糖糖苷键的破坏过程，所以，尽管本发明采用的高温氧化水解法属于化学水解法，却能有效杜绝一般化学法中强酸、强碱所带来的环境污染问题，同时也不产生任何有毒有害物质。

3.本发明生产出来的硫酸化海带寡糖含量(糖含量与硫酸根含量)高(≥95％)，分子量集中度较高，甚至可以媲美右旋糖苷标准品。

4.本发明生产出来的硫酸化海带寡糖的分子量小于1000(平均分子量618，聚合度：4)，经过检测，其吸湿保湿性能强于甘油，抗氧化活性优于维生素E，能够更有效地透过皮肤，更好地补充皮肤水分，特别适合在各种化妆品中使用。

5.本发明在生产出来的硫酸化海带寡糖的基础上，研制海带寡糖系列化妆品(化妆液、化妆乳液和化妆霜)；经过检测，海带寡糖系列化妆品的吸湿保湿性能强于同类型的甘油化妆品，海带寡糖系列化妆品的抗氧化活性优于同类型的维生素E化妆品，这也证明本发明生产出来的海带寡糖的确特别适合在各种化妆品中使用。

6.本发明生产出来的硫酸化海带寡糖特别适合作为化妆品的功能原料，但也可以作为临床营养品、保健食品、运动食品以及碳水化合物营养补充剂直接食用。

并且，目前很多海带来源的酶解制备方法，采用褐藻胶裂解酶酶解(CN201811137102.2、CN201810566502.9等)，其使用的褐藻胶裂解酶价格高昂，不利于规模化制备。本发明所使用的酶为蛋白酶，酶的成本远低于褐藻胶裂解酶。

附图说明

表1是本发明的海带原料主要成分。

图1是本发明方法：硫酸化海带寡糖的规模化制备方法的工艺流程图。

图2是四个标准品的色谱图：1.右旋糖苷(Mw 405700)；2.右旋糖苷(Mw 45800)；3.右旋糖苷(Mw 1200)；4.右旋糖苷(Mw 342)。色谱条件：色谱柱：TSKgel GMPWXL柱；流动相：去离子水；20分钟等度洗脱；示差检测器。这也是以下图4、图5、图6和图10的色谱条件。

图3是四种标准品的标准曲线。

图4是本发明方法：高温氧化水解法提取的海带寡糖初提物的色谱图。

图5是复合酶水解法提取的海带寡糖初提物的色谱图。

图6是高温强酸水解法提取的海带寡糖初提物的色谱图。

表2是不同海带寡糖提取方法的提取时间和提取率对比。

图7是本发明方法：高温氧化水解法的提取时间对硫酸化海带寡糖提取率的影响，其他提取条件：料液比：1:10，过氧化氢含量：1％，pH＝7，温度：80℃。

图8是本发明方法：高温氧化水解法的提取温度对硫酸化海带寡糖提取率的影响，其他提取条件：料液比：1:10，过氧化氢含量：1％，pH＝7，时间：6小时。

图9是本发明方法：高温氧化水解法的提取pH对硫酸化海带寡糖提取率的影响，其他提取条件：料液比：1:10，过氧化氢含量：1％，温度：80℃，时间：6小时。

图10是本发明方法：高温氧化水解法制备的硫酸化海带寡糖的色谱图。

图11是本发明方法：硫酸化海带寡糖(简称：海带寡糖)及其系列化妆品的研究流程图。

图12是海带寡糖和海带多糖的分子量对其吸湿性能的影响(1——1千以下海带寡糖；2——甘油；3——1万～2万海带多糖；4——20万海带多糖)。

图13是海带寡糖和海带多糖的分子量对其保湿性能的影响(1——1千以下海带寡糖；2——甘油；3——1万～2万海带多糖；4——20万海带多糖)。

图14是海带寡糖和海带多糖的分子量对其抗氧化活性的影响(a——FRAP法测定海带寡糖和海带多糖的铁离子还原/抗氧化能力；b——ABTS法测定海带寡糖和海带多糖的抗氧化能力；c——T-AOC法测定海带寡糖和海带多糖的总抗氧化能力；d——Fenton法测定海带寡糖和海带多糖的抑制羟自由基能力)。

图15是海带寡糖化妆液的吸湿性能(1——1千以下海带寡糖(2％)化妆液；2——甘油(2％)化妆液)。

图16是海带寡糖化妆液的保湿性能(1——1千以下海带寡糖(2％)化妆液；2——甘油(2％)化妆液)。

图17是海带寡糖化妆乳液的吸湿性能(1——1千以下海带寡糖(2％)化妆乳液；2——甘油(2％)化妆乳液)。

图18是海带寡糖化妆乳液的保湿性能(1——1千以下海带寡糖(2％)化妆乳液；2——甘油(2％)化妆乳液)。

图19是海带寡糖化妆霜的吸湿性能(1——1千以下海带寡糖(2％)化妆霜；2——甘油(2％)化妆霜)。

图20是海带寡糖化妆霜的保湿性能(1——1千以下海带寡糖(2％)化妆霜；2——甘油(2％)化妆霜)。

图21是海带寡糖化妆液的抗氧化活性(a——FRAP法测定海带寡糖化妆液的铁离子还原/抗氧化能力；b——ABTS法测定海带寡糖化妆液的抗氧化能力；c——T-AOC法测定海带寡糖化妆液的总抗氧化能力；d——Fenton法测定海带寡糖化妆液的抑制羟自由基能力)。

图22是海带寡糖化妆乳液的抗氧化活性(a——FRAP法测定海带寡糖化妆乳液的铁离子还原/抗氧化能力；b——ABTS法测定海带寡糖化妆乳液的抗氧化能力；c——T-AOC法测定海带寡糖化妆乳液的总抗氧化能力；d——Fenton法测定海带寡糖化妆乳液的抑制羟自由基能力)。

图23是海带寡糖化妆霜的抗氧化活性(a——FRAP法测定海带寡糖化妆霜的铁离子还原/抗氧化能力；b——ABTS法测定海带寡糖化妆霜的抗氧化能力；c——T-AOC法测定海带寡糖化妆霜的总抗氧化能力；d——Fenton法测定海带寡糖化妆霜的抑制羟自由基能力)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详述。

实施例1：

一种适用于化妆品的硫酸化海带寡糖的规模化制备方法，步骤如下：

(1)预处理

将海带原料投入反应釜中，加入海带重量10倍的碳酸氢钠溶液，搅拌30分钟，用清水漂洗干净，其中碳酸氢钠溶液的质量体积浓度为1％；将洗净后的海带投入反应釜中，加入海带重量10倍的去离子水，高速匀浆30分钟，匀浆速度为16000转/分，匀浆结束后升温至55℃，调节pH为6.5，加入海带投料重量0.5％的木瓜蛋白酶，反应60分钟；酶解结束后用连续流离心机在14000rpm下高速离心，离心后的海带残渣收集起来再次放入反应釜内，加入海带重量10倍的去离子水，搅拌25分钟，再用连续流离心机在14000rpm下高速离心，离心后的海带残渣收集待用。

(2)高温氧化水解

将经过预处理并洗净离心后的海带残渣置于反应釜中，加入海带残渣重量的10倍的去离子水，加入稀碱液(NaOH)调节pH为7.0，加入海带残渣重量1％的双氧水，反应温度为80℃，反应6小时；水解结束后得到硫酸化海带寡糖初提液。

(3)分离纯化

硫酸化海带寡糖初提液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相对分子质量为5kD的纳滤膜去除大分子杂质，流速为8立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为30℃；再用相对分子质量为200DA的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为5立方米/小时，膜压力为2.758Mpa，温度为30℃，浓缩得到含量为96％的硫酸化海带寡糖溶液。

(4)快速干燥与灭菌封装

喷雾干燥快速干燥寡糖溶液，设定进风温度为160℃，出风温度为90℃，得到硫酸化海带寡糖粉状物；再通过γ-射线辐射进行快速灭菌，辐射剂量为10kGy，辐射时间为30分钟，最后进行无菌分装。

实施例2：

一种适用于化妆品的硫酸化海带寡糖的规模化制备方法，步骤如下：

(1)预处理

将海带原料投入反应釜中，加入海带重量5倍的碳酸氢钾溶液，搅拌45分钟，用清水漂洗干净，其中碳酸氢钾溶液的质量体积浓度为1％；将洗净后的海带投入反应釜中，加入海带重量5倍的去离子水，高速匀浆60分钟，匀浆速度为12000转/分，匀浆结束后升温至60℃，调节pH为7.0，加入海带投料重量0.5％的木瓜蛋白酶和0.5％的中性蛋白酶，反应45分钟；酶解结束后用连续流离心机在14000rpm下高速离心，离心后的海带残渣收集起来再次放入反应釜内，加入海带重量15倍的去离子水，搅拌15分钟，再用连续流离心机在14000rpm下高速离心，离心后的海带残渣收集待用。

(2)高温氧化水解

将经过预处理并洗净离心后的海带残渣置于反应釜中，加入海带残渣重量的5倍的去离子水，加入稀酸液(HCl)调节pH为5.5，加入海带残渣重量1％的双氧水，反应温度为85℃，反应8小时；水解结束后得到硫酸化海带寡糖初提液。

(3)分离纯化

硫酸化海带寡糖初提液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相对分子质量为5kD的纳滤膜去除大分子杂质，流速为6立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为35℃；再用相对分子质量为200DA的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为5立方米/小时，膜压力为2.758Mpa，温度为35℃，浓缩得到含量为97.8％的硫酸化海带寡糖溶液。

(4)快速干燥与灭菌封装

喷雾干燥快速干燥寡糖溶液，设定进风温度为150℃，出风温度为85℃，得到硫酸化海带寡糖粉状物；再通过紫外光辐射进行快速灭菌，辐射剂量为5kGy，辐射时间为60分钟，最后进行无菌分装。

实施例3：

一种适用于化妆品的硫酸化海带寡糖的规模化制备方法，步骤如下：

(1)预处理

将海带原料投入反应釜中，加入海带重量10倍的氢氧化钠溶液，搅拌15分钟，用清水漂洗干净，其中氢氧化钠溶液的质量体积浓度为4％；将洗净后的海带投入反应釜中，加入海带重量3倍的去离子水，高速匀浆60分钟，匀浆速度为10000转/分，匀浆结束后升温至53℃，调节pH为6.5，加入海带投料重量1.0％的木瓜蛋白酶和1.0％的风味蛋白酶，反应30分钟；酶解结束后用连续流离心机在14000rpm下高速离心，离心后的海带残渣收集起来再次放入反应釜内，加入海带重量15倍的去离子水，搅拌15分钟，再用连续流离心机在14000rpm下高速离心，离心后的海带残渣收集待用。

(2)高温氧化水解

将经过预处理并洗净离心后的海带残渣置于反应釜中，加入海带残渣重量的5倍的去离子水，加入稀盐酸调节pH为5.0，加入海带残渣重量1％的双氧水，反应温度为100℃，反应6小时；水解结束后得到硫酸化海带寡糖初提液。

(3)分离纯化

硫酸化海带寡糖初提液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相对分子质量为5kD的纳滤膜去除大分子杂质，流速为6立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为35℃；再用相对分子质量为500DA的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为8立方米/小时，膜压力为2.5Mpa，温度为35℃，浓缩得到含量为96.8％的硫酸化海带寡糖溶液。

(4)快速干燥与灭菌封装

喷雾干燥快速干燥寡糖溶液，设定进风温度为165℃，出风温度为88℃，得到硫酸化海带寡糖粉状物；再通过γ-射线辐射进行快速灭菌，辐射剂量为15kGy，辐射时间为15分钟，最后进行无菌分装。

实施例4：

一种适用于化妆品的硫酸化海带寡糖的规模化制备方法，步骤如下：

(1)预处理

将海带原料投入反应釜中，加入海带重量5倍的氢氧化钾溶液，搅拌20分钟，用清水漂洗干净，其中氢氧化钾溶液的质量体积浓度为3％；将洗净后的海带投入反应釜中，加入海带重量15倍的去离子水，高速匀浆45分钟，匀浆速度为15000转/分，匀浆结束后升温至50℃，调节pH为6.0，加入海带投料重量1.0％的木瓜蛋白酶和1.0％的菠萝蛋白酶，反应60分钟；酶解结束后用连续流离心机在14000rpm下高速离心，离心后的海带残渣收集起来再次放入反应釜内，加入海带重量8倍的去离子水，搅拌45分钟，再用连续流离心机在14000rpm下高速离心，离心后的海带残渣收集待用。

(2)高温氧化水解

将经过预处理并洗净离心后的海带残渣置于反应釜中，加入海带残渣重量的5倍的去离子水，加入稀盐酸调节pH为6.0，加入海带残渣重量1.5％的双氧水，反应温度为80℃，反应7小时；水解结束后得到硫酸化海带寡糖初提液。

(3)分离纯化

硫酸化海带寡糖初提液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相对分子质量为10kD的纳滤膜去除大分子杂质，流速为8立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为25℃；再用相对分子质量为500DA的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为5立方米/小时，膜压力为2.75Mpa，温度为45℃，浓缩得到含量为95.6％的硫酸化海带寡糖溶液。

(4)快速干燥与灭菌封装

喷雾干燥快速干燥寡糖溶液，设定进风温度为165℃，出风温度为92℃，得到硫酸化海带寡糖粉状物；再通过电子束辐射进行快速灭菌，辐射剂量为10kGy，辐射时间为15分钟，最后进行无菌分装。

如表1所示，海带中超过三分之二的成分是包括褐藻酸、褐藻糖胶、海带纤维、甘露醇等在内的碳水化合物，粗蛋白和灰分分别占有约10％和15％的成分，而脂肪含量很少，所以，本发明设计一套可以规模化制备硫酸化海带寡糖的工艺流程。

表1

如图1所示，本发明首先用稀碱液洗去泥沙、海带表面的杂物及粘液，并除掉海带中微量脂肪，然后利用高速匀浆粉碎与蛋白酶酶解快速去除海带中不可忽视的粗蛋白成分以及部分的甘露醇和可溶于水的灰分(碘化钾和碘化钠等)，而后将离心后的海带残渣通过高温氧化水解快速制备成硫酸化海带寡糖初提液，再利用连续流离心协同膜分离技术在常温下对硫酸化海带寡糖提取液进行分离、纯化和除盐，得到含量≥95％，分子量小于1000的硫酸化海带寡糖溶液，最后利用喷雾干燥技术快速干燥形成硫酸化海带寡糖粉状物，并利用光辐射技术快速灭菌密封保存。

如图2所示，四个不同分子量的右旋糖苷标准品在TSKgel GMPWXL柱上间隔出峰，未重合。

如图3所示，标准曲线的回归方程为：y＝-1.0306x+13.973(R²＝0.998)，显示分子量在405700～342的范围内，测定结果的准确性较高。

如图4、图5和图6所示，通过比较不同提取方法制备的海带寡糖的分子量分布情况，高温氧化水解法(本发明方法)、复合酶解法和高温强酸水解法制备的海带寡糖的主峰位置(图中打钩处)都是一致的，而高温氧化水解法制备的海带寡糖的色谱效果明显好于复合酶解法和高温强酸水解法制备的海带寡糖的色谱效果。另，如表2所示，高温氧化水解法提取海带寡糖的时间最短，且提取率最高；所以，本发明选择高温氧化水解法作为硫酸化海带寡糖的提取方法。

表2

如图7所示，提取时间从1小时延长到6小时，硫酸化海带寡糖的提取率从10.97％±1.04％上升到61.25％±1.11％，在这一过程中，提取率随提取时间延长而快速增长。而提取时间从6小时延长到8小时，硫酸化海带寡糖的提取率基本保持不变。

如图8所示，提取温度从30℃增加到80℃，硫酸化海带寡糖的提取率从1.92％±0.09％上升到61.25％±1.11％，在这一过程中，提取率随提取温度增加而快速增长。而提取温度从80℃增加到100℃，硫酸化海带寡糖的提取率增长缓慢。

如图9所示，提取pH从1增加到7，硫酸化海带寡糖的提取率基本保持不变；而pH从7进一步增加到14，硫酸化海带寡糖的提取率从61.25％±1.11％下降到19.11％±2.06％，这是因为过氧化氢在碱性高温条件下易于分解，导致提取率急剧下降。

如图10所示，在波长280nm，220nm和214nm条件下，海带寡糖没有任何峰型，这说明：制备的硫酸化海带寡糖没有蛋白或肽的存在，且硫酸化海带寡糖在TSKgel GMPWXL柱只出一个很窄的单峰，说明制备的硫酸化海带寡糖的分子量集中度很高，甚至可以媲美右旋糖苷标准品；根据图3的标准曲线计算可得：硫酸化海带寡糖的平均分子量为618。

如图11所示，本发明在硫酸化海带寡糖(以下简称：海带寡糖)的基础上，制备了海带寡糖化妆液、海带寡糖化妆乳液和海带寡糖化妆霜，并进行吸湿保湿性能与抗氧化活性研究。

如图12和图13所示，不同分子量的海带寡糖和海带多糖的吸湿保湿性能由强到弱依次为：1千以下海带寡糖(本发明方法制备)>甘油>1万～2万海带多糖>20万海带多糖。

如图14所示，通过四种不同机理的抗氧化活性测定方法(FRAP法、ABTS法、T-AOC法和Fenton法)，海带寡糖和海带多糖的分子量对其抗氧化活性的影响结果一致；其抗氧化活性由强到弱依次是：1千以下海带寡糖(本发明方法制备)>维生素E>1万～2万海带多糖>20万海带多糖。

如图15、图16、图17、图18、图19和图20所示，所有的化妆品(化妆液、化妆乳液和化妆霜)添加了海带寡糖(2％)后，吸湿保湿性能都优于同含量的甘油化妆品(2％)。

如图21、图22和图23所示，采用四种不同机理的抗氧化活性检测方法(FRAP法、ABTS法、T-AOC法和Fenton法)，测定三种海带寡糖化妆品(化妆液、化妆乳液和化妆霜)的抗氧化活性结果一致，抗氧化活性由强到弱依次是：1千以下海带寡糖化妆品(本发明方法制备)>维生素E化妆品>1万～2万海带多糖化妆品>20万海带多糖化妆品。

Claims (10)

1.一种硫酸化海带寡糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)预处理

将海带原料投入反应釜中，加入海带重量2～10倍的碱溶液或强碱弱酸盐溶液，搅拌15～60分钟，洗去泥沙、海带表面的杂物及粘液，并除掉海带的脂肪，用清水漂洗干净，其中碱溶液或强碱弱酸盐溶液的质量体积浓度为1～4％；将洗净后的海带投入反应釜中，加入海带重量3～15倍的去离子水，高速匀浆15～60分钟，匀浆速度为10000～28000转/分，匀浆结束后升温至50～60℃，调节pH为6.0～7.0，加入海带投料重量0.1％～2％的蛋白酶，反应30～60分钟；酶解结束后用连续流离心机高速离心，离心后的海带残渣收集起来再次放入反应釜内，加入海带重量8～15倍的去离子水，搅拌15～45分钟，再用连续流离心机高速离心，离心后的海带残渣收集待用；

(2)高温氧化水解

将经过预处理并洗净离心后的海带残渣置于反应釜中，加入海带残渣重量的5～10倍的去离子水，加入稀碱液或稀酸液调节pH为4.0～7.0，加入海带残渣重量0.2％～2％的双氧水，反应温度为80～100℃，反应6～8小时；水解结束后得到硫酸化海带寡糖初提液；

(3)分离纯化

连续流离心结合相对分子质量为10kD～5kD的纳滤膜去除硫酸化海带寡糖初提液中的大分子杂质和固体纤维残渣，所得清液再用相对分子质量为500DA～200DA的纳滤膜去除小分子杂质和部分无机盐，并进一步浓缩得到含量≥95％，分子量低于1000的硫酸化海带寡糖溶液。

2.根据权利要求1所述一种硫酸化海带寡糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)加入碱液调节pH值所使用的碱或强碱弱酸盐为碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾；酸为盐酸或硝酸。

3.根据权利要求1所述一种硫酸化海带寡糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所使用的蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶和风味蛋白酶中的一种或两种组合。

4.根据权利要求1所述一种硫酸化海带寡糖的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所使用的相对分子质量为10kD～5kD的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.552-0.931Mpa，温度为20～50℃；所使用的相对分子质量为500DA～200DA的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.483～2.758Mpa，温度为20～50℃。

5.根据权利要求1所述一种硫酸化海带寡糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(3)中连续流离心机的高速离心速度为10000～15000rpm。

6.根据权利要求1～5之一所述一种硫酸化海带寡糖的制备方法，其特征在于：还包括步骤(4)快速干燥与灭菌封装：利用喷雾干燥快速干燥硫酸化海带寡糖溶液，得到硫酸化海带寡糖粉状物；再通过光辐射进行快速灭菌，最后进行无菌分装。

7.根据权利要求6所述一种硫酸化海带寡糖的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所使用的喷雾干燥的进风温度为120～180℃、出风温度为70～95℃；所使用的光辐射使用紫外光辐射、γ-射线或电子束辐射，辐射剂量为0.01～40kGy，辐射时间为1～60分钟。

8.一种适用于化妆品的硫酸化海带寡糖，其特征在于根据权利要求1至5任一项所述一种硫酸化海带寡糖的制备方法制备得到。

9.一种化妆品组合物，其特征在于，其含有重量比0.01％～99％权利要求8所述的硫酸化海带寡糖。

10.如权利要求9所述的一种化妆品组合物，所述的化妆品包括化妆水、化妆霜和化妆乳液中的至少一种。

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