CN110863024A - 一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法 - Google Patents

一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其解决现有透明质酸制备工艺繁琐、成本较高、产品纯度低的问题。包括以下步骤：1）原料预处理；2）透明质酸提取；3）除杂；4）透明质酸小分子化；5）透析、干燥。本发明利用丙酮处理鱿鱼眼使其变性，通过浮选技术提取透明质酸，再经超临界二氧化碳流体和酶解脱除脂肪和蛋白等杂质，再使用透明质酸酶对透明质酸进行剪切，最后通过透析制备小分子量介于1000‑40000Da的透明质酸。本发明操作工艺简单，成本低，安全性高，且产品纯度高，分子结构稳定，产品的生物活性高，具有广阔的应用前景。

Description

一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法
技术领域
本发明涉及透明质酸的制备，尤其是一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸(HA)又名玻尿酸，是一种不含硫的天然大型多糖类，由双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的一种阴离子酸性粘多糖。因其超强的持水性、黏弹性和渗透性以及生物学功能，被广泛应用于保健品、化妆品和医药领域。
近年来，随着透明质酸研究的深入，小分子透明质酸因其良好的生物渗透、吸收的特性， 小分子透明质酸制备研究成为国内外研究热点。目前，小分子透明质酸制备的方法主要有物理、化学、生物降解法。然而，物理方法制备的产物分子量难以按照需要生产；化学降解方法需要较剧烈的反应条件（如强酸、碱等），才能达到高的降解程度，导致功能键断裂，有效结构被破坏，显著影响小分子透明质酸的质量和生物活性。酶解法是反应温和，是降解透明质酸的有效方法，但现有酶解方法均针对成品透明质酸进行降解，工艺较为繁琐，制备成本较高，并且现有技术仍无好的方法制备不同特定分子量的透明质酸。
鱿鱼是我国重要的水产加工原料，产生30%的加工副产物，缺乏有效的利用途径，通常用于加工鱼粉的原料。加工下脚料中鱿鱼眼约占5％，鱿鱼眼含玻璃体，可以用作小分子HA提取的资源。
发明内容
为了克服现有透明质酸制备工艺繁琐、成本较高、产品纯度低的不足，本发明的目的在于提供一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法。该制备方法利用丙酮使鱿鱼眼变性，再通过浮选技术提取透明质酸，经超临界二氧化碳流体和酶解脱除脂肪和蛋白等杂质，使用透明质酸酶对透明质酸进行剪切，最后通过透析制备小分子量的透明质酸，制得的小分子透明质酸分子量介于1000－40000Da。本发明方法的操作工艺简单，制备成本低，安全性高，产品纯度高，分子结构稳定，生物活性高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：其经过以下步骤：
（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其2-5倍重量的丙酮，静置10-15min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；
（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其5-10倍重量、质量分数为1-15%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡，在收集的气泡中加入气泡重量2-5倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用酸溶液调节pH值为5-6，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；
（3）除杂：将步骤（2）中得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量2-6%的蛋白酶，酶解并在结束后灭活，离心，取上清液；
（4）透明质酸小分子化：将步骤（3）中得到的上清液中加入质量分数为3-5%的透明质酸酶，搅拌，酶解条件为：pH值6-8，酶解温度30-40℃，酶解时间30-90min，酶解结束后离心，取上清液；
（5）透析、干燥：将步骤（4）中得到的上清液转移至透析袋中，经过两步透析，在室温下共透析20-24h，取第二步透析的去离子水，加入其1-3倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。
本发明的优选方面，在步骤（2）中，所述的酸溶液为盐酸溶液、柠檬酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液中的一种或两种以上。
本发明的优选方面，在步骤（3）中，所述的超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为20-25MPa，温度控制为20-30℃，二氧化碳流速15-20 kg·h-1，处理时间20-25min。
本发明的优选方面，在步骤（3）中，所述的蛋白酶由胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的两种酶组成，两种酶添加比例为1:1。
本发明的优选方面，在步骤（3）中，所述的酶解的条件为：酶解温度40-50℃，酶解时间60-180min，pH值6-8。
本发明的优选方面，在步骤（4）中，所述的透明质酸酶的制备方法为：
（s1）选取新鲜鱿鱼眼，粉碎后放入25-35℃培养箱中，自然发酵10-24h；
（s2）过滤取滤液；
（s3）滤液中加入95%乙醇，离心取沉淀，沉淀用去离子水复溶、离心，并重复3遍，得沉淀；
（s4）取含10-30%透明质酸的液体培养基，按培养基重量接种5-10%的、步骤s3）中得到的沉淀，在温度25-35℃，培养10-24h，离心，取上清液，即获得透明质酸酶。
本发明的优选方面，在步骤（5）中，所述的两步透析，选择不同截留分子量的透析袋，其第一步用透析袋截留分子量为1000Da的透明质酸，透析时间10-12h；其第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为40000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间10-12h，最后收集去离子水。
本发明是采用丙酮预处理鱿鱼眼，使蛋白质变性聚集，为后续处理减少蛋白质等杂质，有利于HA的纯化；再采用浮选技术处理鱿鱼眼，最大限度减少了杂质，提高初HA纯度，且最大限度的将HA提取出来，形成最少量的提取液，减少了后续处理乙醇的使用量；再采用超临界二氧化碳联合酶解除杂的方法，彻底去除了脂肪和蛋白质；再使用透明质酸酶对透明质酸进行剪切；最后通过透析制备小分子量介于1000-40000Da的透明质酸。本发明操作工艺简单，成本低，安全性高，且产品纯度高，分子结构稳定，保证了产品的生物活性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述，所述的实施案例有助于对本发明的理解和实施，并非构成对本发明的限制。
本实施例中除非另有说明，其透明质酸酶的制备方法为：
（s1）选取新鲜鱿鱼眼，粉碎后放入30℃培养箱中，自然发酵24h；
（s2）过滤取滤液；
（s3）滤液中加入95%乙醇，离心取沉淀，沉淀用去离子水复溶、离心，并重复3遍，得沉淀；
（s4）取含30%透明质酸的液体培养基，按培养基重量接种10%的、步骤s3）中得到的沉淀，在温度30℃，培养24h，离心，取上清液，即获得透明质酸酶。
实施例1
一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其经过以下步骤：
（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其3倍重量的丙酮，静置10min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；
（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其7倍重量、质量分数为10%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡，在收集的气泡中加入气泡重量3倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用盐酸溶液调节pH值为6，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；
（3）除杂：将步骤（2）中得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理，其中，超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为20MPa，温度控制为25℃，二氧化碳流速18kg·h-1，处理时间20min；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量5%的蛋白酶酶解，其中，蛋白酶由胰蛋白酶和中性蛋白酶组成，其添加比例为1:1；酶解的条件为：酶解温度45℃，酶解时间90min，pH值7；酶解结束后灭活，离心，取上清液；
（4）透明质酸小分子化：将步骤（3）中得到的上清液中加入质量分数为4%的透明质酸酶，搅拌，酶解条件为：pH值7，酶解温度30℃，酶解时间45min，酶解结束后离心，取上清液；
（5）透析、干燥：将步骤（4）中得到的上清液转移至透析袋中，选择不同截留分子量的透析袋而经过两步透析，在室温下共透析22h，其中，第一步用透析袋截留分子量为1000Da的透明质酸，透析时间10h；第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为40000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间12h，最后收集去离子水，取去离子水加入其3倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。
实施例2
一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其经过以下步骤：
（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其2倍重量的丙酮，静置15min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；
（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其5倍重量、质量分数为15%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡，在收集的气泡中加入气泡重量5倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用柠檬酸溶液调节pH值为5，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；
（3）除杂：将步骤（2）中得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理，其中，超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为25MPa，温度控制为20℃，二氧化碳流速15kg·h-1，处理时间25min；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量2%的蛋白酶酶解，其中，蛋白酶由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其添加比例为1:1；酶解的条件为：酶解温度50℃，酶解时间60min，pH值6；酶解结束后灭活，离心，取上清液；
（4）透明质酸小分子化：将步骤（3）中得到的上清液中加入质量分数为3%的透明质酸酶，搅拌，酶解条件为：pH值6，酶解温度35℃，酶解时间30min，酶解结束后离心，取上清液；
（5）透析、干燥：将步骤（4）中得到的上清液转移至透析袋中，选择不同截留分子量的透析袋而经过两步透析，在室温下共透析20h，其中，第一步用透析袋截留分子量为1000Da的透明质酸，透析时间10h；第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为40000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间10h，最后收集去离子水，取去离子水加入其1倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。
实施例3
一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其经过以下步骤：
（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其5倍重量的丙酮，静置12min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；
（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其10倍重量、质量分数为2%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡，在收集的气泡中加入气泡重量2倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用醋酸溶液调节pH值为6，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；
（3）除杂：将步骤（2）中得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理，其中，超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为25MPa，温度控制为30℃，二氧化碳流速20kg·h-1，处理时间25min；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量6%的蛋白酶酶解，其中，蛋白酶由胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其添加比例为1:1；酶解的条件为：酶解温度50℃，酶解时间180min，pH值8；酶解结束后灭活，离心，取上清液；
（4）透明质酸小分子化：将步骤（3）中得到的上清液中加入质量分数为5%的透明质酸酶，搅拌，酶解条件为：pH值8，酶解温度40℃，酶解时间90min，酶解结束后离心，取上清液；
（5）透析、干燥：将步骤（4）中得到的上清液转移至透析袋中，选择不同截留分子量的透析袋而经过两步透析，在室温下共透析24h，其中，第一步用透析袋截留分子量为1000Da的透明质酸，透析时间12h；第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为40000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间12h，最后收集去离子水，取去离子水加入其2倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。
对比例1
在本对比例中，其方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤1）鱿鱼眼原料的处理不用丙酮。
对比例2
在本对比例中，其方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤2）将月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液更换为去离子水。
对比例3
在本对比例中，其方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤1）不使用丙酮处理鱿鱼眼，步骤2）将月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液更换为去离子水。
对比例4
在本对比例中，其方法和对比例3基本相同，其区别在于：不进行步骤3）的超临界二氧化碳除杂处理。
对比例5
在本对比例中，其方法和对比例3基本相同，其区别在于：不进行步骤3）的酶解除杂处理。
对比例6
在本对比例中，其方法和对比例5基本相同，其区别在于：不进行步骤3）的超临界二氧化碳除杂处理。
对比例7
在本对比例中，其方法和对比例1基本相同，其区别在于：不进行步骤4）的透明质酸酶酶解处理。
对比例8
在本对比例中，其方法和对比例6基本相同，其区别在于：不进行步骤5）的透析处理。
透明质酸提取物质量评价：将上述实施例和对比例提取的透明质酸以葡萄糖醛酸含量、蛋白质含量、脂肪含量、灰分含量、透明质酸提取率为指标进行质量比较，其中葡萄糖醛酸测定方法为Bitter-Miuit咔唑测定法，脂肪、蛋白质、灰分分别采用GB 5009.6-2016、5009.5-2016、GB 5009.4-2016，透明质酸提取率=m提取/M原料中含有，透明质酸分子量采用王彦厚2004的检测方法测定，结果见表1所示。
表1不同实施例和对比例提取的透明质酸质量指标比较
Figure DEST_PATH_IMAGE001
由表1可知，本发明获得的透明质酸纯度和提取率均取得良好效果，通过改变本发明中丙酮处理、表面活性剂提取、超临界二氧化碳处理、酶解和透析等操作，对比例1-8结果显示，透明质酸纯度和提取率受上述提取操作影响显著，仅在上述操作协同作用，才能获得良好的透明质酸提取效果，对比例1-3也已证明这一结果。实施例1-3结果表明，本发明可根据需要，获得一定分子量范围的小分子透明质酸。
小分子透明质酸提取物吸收效果评价：取各实施例和对比例制备的小分子透明质酸0.1g，配制成1%水溶液，通过涂抹至人体皮肤，10min后观察小分子透明质酸的吸收量，以去离子水冲洗涂抹部位，测定清洗液中小分子透明质酸的残留量，结果见表2。
表2 不同实施例和对比例提取的透明质酸持水性比较
Figure 281231DEST_PATH_IMAGE002
由表2可知，本发明获得的小分子透明质酸持吸收性良好，表明提取过程未破坏透明质酸的分子结构，确保了提取的透明质酸的生物学活性。

Claims (7)

1.一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：其经过以下步骤：
（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其2-5倍重量的丙酮，静置10-15min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；
（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其5-10倍重量、质量分数为1-15%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡，在收集的气泡中加入气泡重量2-5倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用酸溶液调节pH值为5-6，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；
（3）除杂：将步骤（2）中得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量2-6%的蛋白酶，酶解并在结束后灭活，离心，取上清液；
（4）透明质酸小分子化：将步骤（3）中得到的上清液中加入质量分数为3-5%的透明质酸酶，搅拌，酶解条件为：pH值6-8，酶解温度30-40℃，酶解时间30-90min，酶解结束后离心，取上清液；
（5）透析、干燥：将步骤（4）中得到的上清液转移至透析袋中，经过两步透析，在室温下共透析20-24h，取第二步透析的去离子水，加入其1-3倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。
2.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述的酸溶液为盐酸溶液、柠檬酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述的超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为20-25MPa，温度控制为20-30℃，二氧化碳流速15-20 kg·h-1，处理时间20-25min。
4.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述的蛋白酶由胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的两种酶组成，两种酶添加比例为1:1。
5.根据权利要求1或4所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述的酶解的条件为：酶解温度40-50℃，酶解时间60-180min，pH值6-8。
6.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（4）中，所述的透明质酸酶的制备方法为：
（s1）选取新鲜鱿鱼眼，粉碎后放入25-35℃培养箱中，自然发酵10-24h；
（s2）过滤取滤液；
（s3）滤液中加入95%乙醇，离心取沉淀，沉淀用去离子水复溶、离心，并重复3遍，得沉淀；
（s4）取含10-30%透明质酸的液体培养基，按培养基重量接种5-10%的、步骤s3）中得到的沉淀，在温度25-35℃，培养10-24h，离心，取上清液，即获得透明质酸酶。
7.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（5）中，所述的两步透析，选择不同截留分子量的透析袋，其第一步用透析袋截留分子量为1000Da的透明质酸，透析时间10-12h；其第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为40000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间10-12h，最后收集去离子水。
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