CN103601814B - 从猪皮中提取透明质酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明阐述一种从猪皮中提取透明质酸的方法，该方法采用猪皮为主要原料，经过粗提、除蛋白、沉淀、酶解、络合、解离、沉淀，干燥后即获透明质酸。本方法生产周期短、成本低、收率高，不产生任何有毒有害物质，而且所得产品安全性高，可用于药品领域。

Description

从猪皮中提取透明质酸的方法
技术领域
本发明方法涉及猪皮深加工技术领域，具体涉及一种透明质酸的提取方法，一种以猪皮为原料，通过生物酶解技术，从而提取透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸(Haluronicacid、HA)又名玻璃酸，是一种酸性粘多糖，1934年美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸是由N-已酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成的线形多糖结构。
透明质酸具有很大粘性，对骨关节具有润滑作用。还能促进物质在皮肤中的扩散率、调节细胞表面和细胞周围的Ca2+，Mg2+，K+，Na+离子运动。在组织中的强力保水作用是其最重要的生理功能之一，故被称为理想的天然保湿因子，其理论保水值高达800ml/g，在***中的实际保水值为80ml/g。此外，透明质酸还有促进纤维增生、加速创伤愈合作用。
透明质酸作为药物主要应用于眼科治疗手术，如晶体植入、摘除，角膜移植，抗青光眼手术等，还用于治疗骨关节炎、外伤性关节炎和滑囊炎以及加速伤口愈合。透明质酸在化妆品中的应用更为广泛，它能保持皮肤湿润光滑、细腻柔嫩，富有弹性，具有防皱，抗皱、美容保健和恢复皮肤生理功能的作用。
透明质酸的生产工艺主要分为两大类：以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。国内目前几个以鸡冠为原料生产透明质酸的厂家，因原料有限，无法形成规模。国内目前有2家发酵法生产透明质酸的企业。每年产量不足2000公斤，根本不能满足国内的需求，国内主要名牌化妆品如奥丽斯、永芳都用到透明质酸，但由于国内产量有限，因此目前化妆品用透明质酸主要依靠进口。
陆文雄等曾在1999年发表过一篇名为《猪皮透明质酸的制备研究》的论文，里面较详细的介绍了一种用猪皮制备明质酸的方法，其得到的透明透质酸符合相关质量标准，采用本专利方法制备的透明质酸质量比陆文雄等制备的略高一筹，收率大大提升。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种从猪皮中提取透明质酸的方法，是一种以扩大原料来源，形成规模化生产链，同时又简化工艺，通过对参数的修改来提高收率，并节能省时为目的而开发出来的新方法，该方法包括如下步骤：
(1)粗提：冰冻猪皮解冻后用丙酮脱水后粉碎，加水用胶体磨磨成糊状，按每1kg猪皮加水6～8L，加氯化钠80～100g，搅拌加热至80～90℃，保温10～20min，冷却至40～50℃，用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液。
(2)除蛋白，沉淀：粗提液按体积比为1∶(0.5～1.5)比例与氯仿混合搅拌3h，分出水相，按体积比为1∶(1.5～3.0)比例加95％乙醇，收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥，得粗品透明质酸。
(3)酶解：粗品透明质酸溶于0.1mol/L氯化钠，溶解浓度为0.5％～1.5％，用1mol/L盐酸调pH4.0～5.0，按体积比为1∶(0.5～1.5)比例加入氯仿搅拌，分出水层，用稀氢氧化钠调pH7.0～8.0，加蛋白水解酶，于30～40℃，酶解20～30h。
(4)络合、解离、沉淀：酶解液中先按体积比为1∶(0.5～1.5)比例加入氯仿除杂蛋白，然后按体积比为1∶(0.5～1.5)比例加入1％氯化十六烷基吡啶(CPC)，放置后，收集沉淀，用0.4mol/LNaCl解离，离心，取出清液，按体积比为1∶(2～4)比例加入95％乙醇，收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥，得精品透明质酸。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
本发明采用猪皮为原料提取透明质酸，打破了市场素以鸡冠为原料生产透明质酸的现状，而且猪皮来源广，其中透明质酸又含量丰富，可以形成规模化的生产链，以满足市场对透明质酸的需求。与陆文雄等的方法相比，本发明方法所制得的透明质酸收率大大提升，质量也略有上升。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)粗提：取冰冻猪皮20kg，解冻后用丙酮脱水后粉碎，加纯化水用胶体磨磨成糊状后，加纯化水120L，加氯化钠1600g，搅拌加热至80℃，保温10min，冷却至40℃，用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液117.6L。
(2)除蛋白，沉淀：粗提液与氯仿58.8L混合搅拌3h，分出水相117.3L，加95％乙醇176L，收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥，得粗品透明质酸216g。
(3)酶解：粗品透明质酸溶于43.2L0.1mol/L氯化钠溶液，用1mol/L盐酸调pH4.0，加入氯仿21.6L搅拌，分出水层43.1L，用稀氢氧化钠调pH7.0，加链霉蛋白酶8.62g，于30℃，酶解20h。
(4)络合、解离、沉淀：酶解液中先加入氯仿21.6L除杂蛋白，然后加入1％氯化十六烷基吡啶(CPC)21.6L，放置后，收集沉淀，加0.4mol/LNaC11.2L解离，离心，取出清液，加入95％乙醇2.4L，收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥，得精品透明质酸164g。
实施例2
(1)粗提：取冰冻猪皮20kg，解冻后用丙酮脱水后粉碎，加纯化水用胶体磨磨成糊状后，加纯化水160L，加氯化钠2000g，搅拌加热至90℃，保温20min，冷却至50℃，用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液158.2L。
(2)除蛋白，沉淀：粗提液与氯仿237L混合搅拌3h，分出水相236.7L，加95％乙醇710.1L，收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥，得粗品透明质酸221g。
(3)酶解：粗品透明质酸溶于14.7L0.1mol/L氯化钠溶液，用1mol/L盐酸调pH5.0，加入氯仿22.0L搅拌，分出水层14.6L，用氢氧化钠调pH8.0，加链霉蛋白酶3.6g，于40℃，酶解30h。
(4)络合、解离、沉淀：酶解液中先加入氯仿21.9L除杂蛋白，然后加入1％氯化十六烷基吡啶(CPC)21.9L，放置后，收集沉淀，用0.4mol/L的NaC11.2L解离，离心，取出清液，加入95％乙醇2.4L，收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥，得精品透明质酸166g。
采用陆文雄等的检测方法，实施例检测结果以及陆文雄等对比例的检测结果如下表：
表1：实施例与对比例的检测结果对比
从表1中可以看出，采用本发明的方法生产出的透明质酸收率大大提升，质量也略有上升。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.从猪皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粗提：将猪皮脱水后粉碎，加水浸泡提取，过滤，得粗提液；
(2)除蛋白，沉淀：粗提液与氯仿混合搅拌，分出水相，水相加95％乙醇，收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥，得粗品透明质酸；
(3)酶解：粗品透明质酸溶于0.1mol/L氯化钠，调pH，加入氯仿搅拌，分出水相，水相调pH，加蛋白水解酶，酶解；
(4)络合、解离、沉淀：酶解液用氯仿除杂蛋白，然后加入浓度为1％的氯化十六烷基吡啶，放置后，收集沉淀，解离，离心，取出清液，清液加入95％乙醇，收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥，得精品透明质酸。
2.根据权利要求1所述的从猪皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，所用原料为解冻后的冷冻猪皮。
3.根据权利要求1所述的从猪皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，“加水浸泡提取”具体为“加水，并用胶体磨研磨脱水粉碎后的猪皮，按每1kg猪皮加水6～8L，加氯化钠80～100g，搅拌加热至80-90℃，保温10～20min，冷却至40～50℃”，“过滤”具体为“用滤布加硅藻土加压过滤”。
4.根据权利要求1所述的从猪皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，粗提液或酶解液与氯仿混合的体积比均为1∶(0.5～1.5)。
5.根据权利要求1所述的从猪皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，粗提液与95％乙醇的体积比为1∶(1.5～3.0)。
6.根据权利要求1所述的从猪皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为“粗品透明质酸溶于0.1mol/L氯化钠，溶解质量浓度为0.5％～1.5％，用1mol/L盐酸调pH值至4.0～5.0，按体积比为1∶(0.5～1.5)比例加入氯仿搅拌，分出水相，水相用稀氢氧化钠调pH值至7.0～8.0，加蛋白水解酶，于30～40℃，酶解20～30h”。
7.根据权利要求1所述的从猪皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所用蛋白水解酶为：胰酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶。
8.根据权利要求1所述的从猪皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所用蛋白水解酶为：木瓜蛋白酶。
9.根据权利要求1所述的从猪皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，酶解液与浓度为1％的氯化十六烷基吡啶的体积比为1∶(0.5～1.5)，清液与95％乙醇的体积比为1∶(2～4)。
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