CN104263684B - 一种产铁载体类芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种产铁载体类芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产铁载体类芽孢杆菌，该菌株为伊利诺伊类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)，于2014年8月29日保藏中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.9620。本发明菌株在限铁培养基中可以产生铁载体。在盆栽和大田条件下，用本发明的产铁载体菌株的菌悬液在花生播种前浸种处理和生长期灌根处理后，在石灰性土壤中能明显改善花生生长时期的铁营养，并且能增加花生叶绿素含量，增强花生的根系活力，促进花生植株体内氮、磷、钾的积累，提高植株生物量，改善花生品质，提高花生产量。

Description

一种产铁载体类芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种产铁载体类芽孢杆菌及其应用。
背景技术
花生是中国重要的油料作物和经济作物，中国北方地区是花生最大的栽培地区之一。近年来，花生缺铁性黄化病的发生越来越严重，这对花生的产量和质量都造成了很大损害。目前人们防治花生缺铁性黄化病主要是依靠农业防治和化学防治的方法，但农业防治方法费时费力，而且很难从根源上有效防治病害的发生，化学防治方法对环境污染大，并且对人体健康也有一定的伤害。因此，利用生物学方法来防治花生缺铁性黄化病的发生已经逐渐成为人们关注的热点，而找到对花生缺铁性黄化病有很好防治作用的菌种资源是关键，其中产铁载体菌株的筛选和应用是目前微生物学工作者的研究热点之一。
铁载体是微生物和部分植物在低铁应激条件下合成的一类对三价铁离子有高效亲和能力的低分子量(1-2kDa)有机化合物，它可以从各种水溶性和非水溶性的化合物中夺走Fe3+。近几年，产铁载体微生物在植物方面的生防和促生作用越来越受到国内外研究者的关注。很多研究成果讨论了土壤微生物在植物根系吸收铁中可能的作用机理，这种机理可能包括以下几种：(1)缺铁植物根系分泌小分子有机化合物，如酚类和黄素类等化合物，这些化合物可以作为抑菌剂和(或)直接作为微生物生长的碳源来改变植物根际微生物的群落结构，并在植物根际形成特异性的微生物种群，这种特异性微生物种群就会通过分泌铁载体来增加土壤中有效铁的含量，从而提高植株对铁的吸收。(2)一些与植物根系共生的微生物也会改善增强植物对铁的吸收利用，比如根瘤菌(Rhizobium)可以通过结瘤作用来增强植物铁胁迫的生理响应；侵染根系的菌根真菌通过增加植物根系的养分吸收面积和分泌对铁载体来改善植物的铁营养。
目前，关于产铁载体的假单胞菌和真菌在改善植物铁营养和促生方面的报道较多，但关于类芽孢杆菌对植物铁营养的改善和促生方面的报道却没有。
发明内容
本发明的目的是提供一种产铁载体类芽孢杆菌及其应用，主要在花生铁营养的改善和促生方面的应用。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种产铁载体类芽孢杆菌，该菌株分类命名为伊利诺伊类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)YZ29，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月29日，保藏编号：CGMCC No.9620。
该菌株的菌落及菌体特征为：本发明的产铁载体类芽孢杆菌在LB平板培养基(酵母浸膏，5g；蛋白胨，10g；氯化钠，10g；蒸馏水，1000mL；琼脂，15-20g；121℃灭菌20min；pH7.0。)上培养24h后菌落呈圆形，乳黄色，稍***，边缘整齐，表面光滑。菌体呈长杆状，大小为0.5-0.7×1.2-2.0μm，产芽孢，革兰氏阳性。
该菌株的生理生化特征为：伏-普试验阴性，柠檬酸盐利用试验阴性，硝酸盐还原试验阴性，D-葡萄糖发酵试验阴性，甘露醇发酵试验阴性，L-***糖发酵试验阳性，淀粉水解试验阳性，明胶液化试验阳性，接触酶试验阳性，氧化酶试验阴性。
上述产铁载体类芽孢杆菌在改善花生铁营养和促生方面的应用。
所述产铁载体类芽孢杆菌的应用方法，制备菌悬液，将上述菌悬液(浓度为108cfu·mL-1，菌液体积为能浸没所有种子)浸泡花生种子25-35min(优选30min)后播种；或者在花生定苗后和开花前(或后)用菌悬液灌根；或者是将上述菌悬液浸泡花生种子播种后，在花生定苗后和开花前(或后)用菌悬液灌根。
所述菌悬液的浓度为108cfu·mL-1。
灌根时的用量为：盆栽试验中每株25mL，田间试验每株200mL。
菌悬液的制备方法：将斜面保存的CGMCC9620转接到装有5-10mL(优选10mL)液体培养基(盆栽试验为LB培养基；田间试验为豆芽汁培养基)的试管中，放在恒温摇床中培养12-16h(优选12h)，温度：37℃；转速：180-200rpm。将活化好的菌液按1％接种量接入到100-200mL(优选200mL)培养基中，放入摇床培养24h，温度：37℃；转速：180-200rpm(180rpm)，然后8000rpm离心10min，弃去上清液，加入适量的无菌去离子水，制成菌悬液。
LB培养基：酵母浸膏，5g；蛋白胨，10g；氯化钠，10g；蒸馏水，1000mL；121℃灭菌20min；pH7.0。
豆芽汁培养基：黄豆芽10g，蔗糖30g，硫酸铵8g，蒸馏水，1000mL；121℃灭菌20min；pH7.0。
一种生物防治菌剂，包括上述的伊利诺伊类芽孢杆菌(Paenibacillusillinoisensis)。
上述生物菌剂在改善花生铁营养和促生方面的应用。
本发明所产生的有益效果：
经研究表明，在盆栽和大田条件下，用本发明的产铁载体菌株的菌悬液在花生播种前浸种处理和生长期灌根处理后，在石灰性土壤中能明显改善花生生长时期的铁营养，并且能增加花生叶绿素含量，增强花生的根系活力，促进花生植株体内氮、磷、钾的积累，提高植株生物量，改善花生品质，提高花生产量。
本发明的产铁载体类芽孢杆菌能明显改善花生生长时期的铁营养状况，促进花生生长。
本研究筛选的CGMCC9620菌株在盆栽条件和大田条件下对花生铁营养和促生效果的研究，所采用的试验方法和条件与已有的文献报道相比，更贴近实际应用状态(很多报道研究的假单胞菌和真菌是在水培条件下验证对花生的影响的，而不是在石灰性土壤中)，这也有力地说明了对花生铁营养的吸收和促生方面的效果是很明显的。另外，目前未见关于类芽孢杆菌对植物铁营养的改善和促生方面的报道，这说明本研究筛出的CGMCC9620菌株丰富了防治花生缺铁性黄化病的菌种资源。类芽孢杆菌是一种能够形成芽孢的细菌它比假单胞菌更容易在土壤中生存，比真菌生长速度快更容易发挥作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种产铁载体类芽孢杆菌，该菌株分类命名为伊利诺伊类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月29日，保藏编号：CGMCC No.9620。
CGMCC9620筛选过程：
(1)分离和纯化
该菌种从花生根际土壤中分离筛选得到。
土壤样品采自山东省兖州市寨子洼(35°44'N,116°75'E)花生种植地。将花生根际土壤小心抖落到无菌袋里，放于低温保鲜盒，带回实验室后立即进行处理。称取根际土壤样品10g，放入90mL无菌水中，振荡30min后制成土壤悬浮液。分别吸取1mL悬浮液，按照10倍比例梯度稀释后，各取10-4、10-5和10-6倍稀释液200μL涂布于牛肉膏蛋白胨平板(牛肉膏，5g；蛋白胨，10g；氯化钠，10g；蒸馏水，1000mL；琼脂，15-20g；121℃灭菌20min；pH7.2-7.4)上，静置10min后倒置于37℃恒温培养箱中培养约24h。挑选代表性菌落于平板上再通过三区划线法纯化，纯化后的微生物分离物为：CGMCC9620，分离物保存于斜面中备用。
(2)CGMCC9620产铁载体性能的检测
将菌株用牙签点接在CAS平板，在37℃恒温培养箱中培养2-5d，观察菌落周围产生橙黄色变色圈者为能够产生铁载体的菌株，若没有形成变色圈说明菌株不能产生铁载体。
所述CAS平板制备：
①取0.012g CAS(Chromeazuorls，北京瀛海精细化工厂)溶于10mL双蒸水中，并与2mL1mmol/L的FeCl3溶液混匀，得溶液a；
②取0.015gHDTMA(Hexadeeyltrimethylammoniumbormide，北京索莱宝科技有限公司)溶于8mL双蒸水中，得溶液b；
③将a溶液缓慢加入b溶液中，充分混匀即得染液c；
④将10×MM9盐溶液(Na2HPO430g，KH2PO41.5g，NaCl 2.5g，NH4Cl 5g，双蒸水500mL)20mL，哌嗪二乙醇磺酸(pipes，Sigma公司出品)6.04g加入盛有150mL双蒸水的洁净三角瓶里，混匀后用质量浓度为50％NaOH调节pH至6.8，再加入琼脂粉3.2g，得培养基d；
⑤将染液c、培养基d、及1mmol/L CaCl2、1mmol/L MgSO4·7H2O、质量浓度为20％葡萄糖、质量浓度为10％水解酪素分别灭菌(115℃，20min)后，置于50℃水浴锅内保温待用；
⑥分别量取上述1mmol/L CaCl20.2mL、1mmol/L MgSO4·7H2O 4mL、质量浓度为20％葡萄糖2mL及质量浓度为10％水解酪素6mL加入培养基d中，再沿瓶壁加入染液c，充分摇匀(勿产生气泡)，即得蓝色定性检测培养基。
然后按每皿20mL倒入培养皿中，待凝固后备用。
CGMCC9620扩大培养方法：
将斜面保存的CGMCC9620转接到装有10mL液体LB培养基(酵母浸膏，5g；蛋白胨，10g；氯化钠，10g；蒸馏水，1000mL；121℃灭菌20min；pH7.0。)的试管中，放在恒温摇床中培养12h(温度：37℃；转速：180rpm)。将活化好的菌液按1％接种量接入到1000mL的盛有200mL液体LB培养基或豆芽汁培养基(黄豆芽10g，蔗糖30g，硫酸铵8g，蒸馏水，1000mL；121℃灭菌20min；pH7.0。)的三角瓶中，放入摇床培养24h(温度：37℃；转速：180rpm)。
CGMCC9620的鉴定
(1)菌落特征及菌体形态
该菌株的菌落及菌体特征为：在LB平板培养基上(酵母浸膏，5g；蛋白胨，10g；氯化钠，10g；蒸馏水，1000mL；琼脂，15-20g；121℃灭菌20min；pH7.0。)培养24h后菌落呈圆形，乳黄色，稍***，边缘整齐，表面光滑。菌体呈长杆状，大小为(0.5-0.7)μm×(1.2-2.0)μm，产芽孢，革兰氏阳性。
(2)生理生化特征
伏-普试验阴性，柠檬酸盐利用试验阴性，硝酸盐还原试验阴性，D-葡萄糖发酵试验阴性，甘露醇发酵试验阴性，L-***糖发酵试验阳性，淀粉水解试验阳性，明胶液化试验阳性，接触酶试验阳性，氧化酶试验阴性。
(3)16S rDNA序列分析
16S rDNA基因序列，见序列表所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：本发明的菌株与Paenibacillus illinoisensis(AB073192)同处于一个最小分支上，其16S rDNA基因序列与Paenibacillus illinoisensis(JQ579623)的菌株序列相似度为99％，结合上述生理生化特征结果，鉴定本发明的菌株为伊利诺伊类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)。
为了明确CGMCC9620在花生铁营养的改善和促生方面的应用，进行了如下试验：
盆栽试验和田间试验
将斜面保存的CGMCC9620转接到装有10mL液体培养基(盆栽试验为LB培养基，田间试验为豆芽汁培养基)的试管中，放在恒温摇床中培养12h(温度：37℃；转速：180rpm)。将活化好的菌液按1％接种量接入到200mL培养基中，放入摇床培养24h(温度：37℃；转速：180rpm)，然后8000rpm离心10min，弃去上清液，加入适量的无菌去离子水，制成浓度为108cfu·mL-1的菌悬液。
上述LB培养基：酵母浸膏，5g；蛋白胨，10g；氯化钠，10g；蒸馏水，1000mL；121℃灭菌20min；pH7.0。
豆芽汁培养基：黄豆芽10g，蔗糖30g，硫酸铵8g，蒸馏水，1000mL；121℃灭菌20min；pH7.0。
在播种前，将花生种子在108cfu·mL-1的菌悬液中浸泡30min，取出种子，将表面的水阴干，播种。在花生定苗后和开花前再次用108cfu·mL-1的菌悬液采用灌根法各施菌一次，盆栽试验中每株25mL，田间试验每株200mL。对照组用等量无菌去离子水处理。在花生各生育期(即幼苗期、开花下针期、荚果期和饱果期)测定花生叶片活性铁含量和叶绿素含量、根系活力、植株全氮磷钾，收获时统计相关产量因子。结果如下表所示。
表1在盆栽试验中各生育期不同处理组花生叶子的叶绿素含量和活性铁含量的差异
C：空白对照，不施用菌剂；Y：CGMCC9620制备的菌剂。Y处理组的均值下面括号中的数值表示比对照组(C)提高的百分比。下同。
表2在田间试验中各生育期不同处理组花生叶子的叶绿素含量和活性铁含量的差异
在土壤缺铁条件下，花生叶子的活性铁含量能够直接反应土壤微生物供给花生铁营养的状况。铁对植物叶绿素的合成至关重要，叶绿素的合成前体ALA(5-氨基酮戊酸)在形成过程中需要铁的参与，由ALA形成叶绿素的过程也需要铁的参与。因此，花生叶片活性铁含量和叶绿素含量可以综合反映花生的铁营养状况。在盆栽条件下，四个生育期中，CGMCC9620处理组的花生叶子的叶绿素和活性铁含量均比对照组的高(表1)；在大田条件下，CGMCC9620处理组的叶子叶绿素和活性铁含量在花生整个生育期中依旧一直比对照组的高(表2)，由此证明，CGMCC9620可以促进花生的铁营养吸收。
表3在盆栽试验中各生育期不同处理下花生的根系活力差异
TAAR：总吸收面积；AAAR：活跃吸收面积。
植物根系活力强度和植物的整个生命活力密切相关，花生根系吸收面积的大小和根系活力的强度与花生地上部分的生长和发育有着直接的关系。根系总吸收面积可直接反映根系吸收水分、养分能力的大小，而根系活跃吸收面积可反映根系活力情况。由表3可以看出，CGMCC9620处理组的花生根系总吸收面积和活跃吸收面积都比对照组的高。因此，CGMCC9620对花生根系活力的提高有一定的帮助。
表4在盆栽试验中各生育期不同处理组花生植株全氮、全磷和全钾积累量的差异
表5在田间试验中各生育期不同处理组花生植株全氮、全磷和全钾积累量的差异
氮、磷和钾是植物必需的三大营养元素，其中氮和磷是植物体内许多重要有机化合物的组成成份，在多方面影响着植物的代谢过程和生长发育，氮还是叶绿素的重要组成元素，氮素的丰缺与叶子中叶绿素含量有密切的关系；钾是植物体内多种酶的活化剂，在代谢过程中起着重要作用，不仅可促进光合作用，还可以促进氮代谢，提高植物对氮的吸收和利用。铁不仅是微生物固氮酶中铁蛋白和钼铁蛋白的必需组成元素，而且是豆科植物共生固氮作用的必要元素之一。因此，植物的光合作用会随着铁元素和氮元素吸收能力的提高而增强，生长也逐渐旺盛，植物吸收营养元素的能力又得到增强。由表4和表5看出，在花生生长期内，CGMCC9620处理组的花生植株体内氮、磷、钾的积累量比对照组的高，说明CGMCC9620产生的铁载体在促进花生铁营养吸收的同时，也促进了花生对氮、磷、钾的吸收，从而促进了花生的生长。
表6在田间试验中各生育时期不同处理组的植株生物量和收获时产量因子的差异
花生植株生物量和荚果产量是CGMCC9620能否促进花生生长的最终反应。在田间试验中，CGMCC9620处理的花生荚果产量比对照组的提高了37.5％，这比2004年Dey报道的菌株PGPR2处理的花生荚果产量比对照组提高了28.3％的结果要好。这更有力地证明了CGMCC9620可以促进花生铁营养的吸收，从而提高了花生产量。
表7在盆栽试验中收获时不同处理组的花生仁蛋白质和粗脂肪含量的差异
表8在田间试验中收获时不同处理组的花生仁蛋白质和粗脂肪含量的差异
花生属于豆科植物，是一种重要的油料和蛋白资源。由表7和表8看出，在盆栽试验和田间试验中，CGMCC9620都可以提高花生的品质。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (8)

1.一种产铁载体类芽孢杆菌，其特征在于，该菌株分类命名为伊利诺伊类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014 年8月29日，保藏编号：CGMCC No.9620。
2.权利要求1 所述的产铁载体类芽孢杆菌在改善花生铁营养和促生方面的应用。
3.权利要求1所述的产铁载体类芽孢杆菌在改善花生铁营养和促生方面的应用方法，其特征在于，制备浓度为108cfu·mL-1菌悬液，将上述菌悬液浸泡花生种子25-35min后播种，菌液体积为浸没所有种子为准；或者在花生定苗后、开花前或开花后用菌悬液灌根；或者是将所述菌悬液浸泡花生种子播种后，在花生定苗后、开花前或开花后用菌悬液灌根。
4.如权利要求3所述的应用方法，其特征在于，灌根时的用量为：盆栽每株25mL，田间每株200mL。
5.如权利要求3所述的应用方法，其特征在于，将上述菌悬液浸泡花生种子30min。
6. 如权利要求3所述的应用方法，其特征在于，所述菌悬液的制备方法：将斜面保存的CGMCC9620 转接到装有5-10mL 液体培养基的试管中，放在恒温摇床中培养12-16h，温度：37℃，转速：180-200rpm；将活化好的菌液按1％接种量接入到100-200mL 培养基中，放入摇床培养24h，温度：37℃，转速：180-200rpm，然后8000rpm 离心10min，弃去上清液，加入适量的无菌去离子水，制成菌悬液；所述液体培养基为LB培养基：酵母浸膏，5g，蛋白胨，10g，氯化钠，10g，蒸馏水，1000mL，121℃灭菌20min，pH7.0；或豆芽汁培养基：黄豆芽10g，蔗糖30g，硫酸铵8g，蒸馏水，1000mL，121℃灭菌20min，pH7.0。
7. 一种生物防治菌剂，其特征在于，包括权利要求1 所述的伊利诺伊类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)。
8.权利要求7所述的生物防治菌剂在改善花生铁营养和促生方面的应用。
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