CN110840819A - 干细胞外泌体凝胶延缓衰老的应用及制备 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了干细胞外泌体凝胶延缓衰老的应用及制备。本发明首先提供了外泌体在制备延缓衰老的产品中的应用。进一步提供了延缓衰老的产品。本发明干细胞外泌体无免疫原性、无致瘤性，提取方法成熟，但由于外泌体制备得率较低，储备条件严苛，因此将其制备成外泌体凝胶可以方便储存和使用将其涂抹在皮肤上，皮肤皱纹减少，为广大求美者带来便捷。另外，本发明使用干细胞外泌体替代因免疫原性、致瘤性原因导致临床使用严格的干细胞，消除干细胞在皮肤衰老治疗中的局限性，且能达到相应治疗效果。

Description

干细胞外泌体凝胶延缓衰老的应用及制备
技术领域
本发明涉及组织工程与新医药技术领域，具体涉及干细胞外泌体凝胶延缓衰老的应用及制备。
背景技术
衰老是随年龄增加，自身机能减退，内环境稳定能力与应激能力下降，结构、组分逐步退化的一个渐进过程。皮肤是人体最大的器官，随着年龄的增长，逐渐地进入老化状态。另外，由于长期暴露于阳光也会导致皮肤的衰老。皮肤衰老表现为干燥粗糙皱纹加深，是整个机体衰老最外在、最直接明显的表现，因此备受人们关注。
外泌体含有蛋白质(膜蛋白、核相关蛋白、脂蛋白)、RNA(结构RNA、tRNA片段、vtRNA和非编码RNA)和miRNAs，它们是由内质网或高尔基生成，通过胞吐或芽生释放出的细胞，大小约30-150nm。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。当外泌体在首次被发现后，其被认为是细胞***废物的一种方式，如今随着大量对其生物来源、其物质构成及运输、细胞间信号的传导以及在体液中的分布的研究发现外泌体具有多种多样的功能。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方面。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何避免干细胞在皮肤衰老治疗中的局限性。
为解决上述技术问题，本发明提供了干细胞外泌体的应用。
本发明干细胞外泌体的应用主要包括以下几点：
干细胞外泌体在制备延缓衰老的产品中的应用。
干细胞外泌体在制备促进皮肤皱纹减少的产品中的应用。
干细胞外泌体在制备促进表皮增厚的产品中的应用。
干细胞外泌体在制备促进胶原纤维密度增加的产品中的应用。
上述应用中，所述干细胞外泌体可来源于离体的脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓干细胞等。
本发明还提供了一种延缓衰老的产品。
本发明延缓衰老的产品包含干细胞外泌体。
活性成分为干细胞外泌体的延缓衰老的产品也在本发明的保护范围之内。
上述产品中，还可包括辅料。具体的，所述辅料为用于制作凝胶的辅料，所述辅料包括透明质酸钠、丙二醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、U-21、NaOH和水。在本发明中，所述辅料的制备方法为将透明质酸钠0.15g、丙二醇20ml、苯甲酸钠0.1g、山梨酸钾0.1g、U-21 0.5g、NaOH0.15g、去离子水75ml混匀即可。
上述产品中，产品的剂型可为凝胶。
上述产品的制备方法，包括将干细胞外泌体作为活性成分得到所述产品的步骤。具体的，将所述辅料与干细胞外泌体进行混合即可。
上述文中，所述干细胞外泌体来源于离体的脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓干细胞等。
在本发明具体的实施方式中，所述干细胞外泌体是分别利用间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或牙髓干细胞至P5-P10代后进行离心得到的上清过滤得到的。
本发明脐带间充质干细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪间充质干细胞外泌体利用Western Blot检测标志性抗体CD9、CD63、CD81均呈阳性，在电镜下均呈双凹圆饼形，NTA检测其粒径分别在97.9nm、112.2nm和113.1nm左右。
本发明试验表明将制备的外泌体凝胶涂抹在皮肤上，皮肤皱纹减少，对皮肤组织行HE染色及Masson染色发现，表皮厚度增加和背部真皮胶原纤维密度增加，表明本发明干细胞外泌体可对抗皮肤衰老。
本发明干细胞外泌体无免疫原性、无致瘤性，提取方法成熟，但由于外泌体制备得率较低，储备条件严苛，因此将其制备成外泌体凝胶可以方便储存和使用将其涂抹在皮肤上，皮肤皱纹减少，为广大求美者带来便捷。另外，本发明使用干细胞外泌体替代因免疫原性、致瘤性原因导致临床使用严格的干细胞，消除干细胞在皮肤衰老治疗中的局限性，且能达到相应治疗效果。
附图说明
图1为间充质干细胞外泌体的Western Blot结果；其中，HUMSC-EXO为脐带间充质干细胞外泌体、BMSC-EXO为骨髓间充质干细胞外泌体、ADSC-EXO为脂肪间充质干细胞外泌体。
图2为间充质干细胞外泌体的透射电镜观察结果；其中，HUMSC-EXO为脐带间充质干细胞外泌体、BMSC-EXO为骨髓间充质干细胞外泌体、ADSC-EXO为脂肪间充质干细胞外泌体。
图3为间充质干细胞外泌体的NTA检测结果
其中，HUMSC-EXO为脐带间充质干细胞外泌体、BMSC-EXO为骨髓间充质干细胞外泌体、ADSC-EXO为脂肪间充质干细胞外泌体。
图4为间充质干细胞外泌体凝胶皮肤渗透率结果图。
图5为间充质干细胞外泌体与成纤维细胞共培养结果图；其中，A为红色荧光干细胞外泌体全部进入细胞内，在Hoechst蓝染的核周围，B为加入PBS和EXO-GLOW对照的图，未发现Hoechst蓝染的核周围有红色染料。
图6为两组小鼠背部皮肤状况、皮肤组织HE染色和Masson染色结果图；A为脐带间充质干细胞外泌体组；B为基础凝胶组。
图7为两组小鼠背部皮肤状况、皮肤组织HE染色和Masson染色结果图；A为骨髓间充质干细胞外泌体组；B为基础凝胶组。
图8为两组小鼠背部皮肤状况、皮肤组织HE染色和Masson染色结果图；A为脂肪间充质干细胞外泌体组；B为基础凝胶组。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1间充质干细胞(MSC)外泌体在延缓皮肤衰老上的应用
一、间充质干细胞外泌体提取及鉴定
1、外泌体的制备
脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞均购于Cyagen(货号：HUXUC-01001，HUCMX-01001，HUXMD-01001)。将三种间充质干细胞分别复苏，使用Cyagen的间充质干细胞培养基(Cyagen，Basal Medium)，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱，以1∶3比例进行传代培养，每2～3d传代一次，培养至P5代后，将培养基替换STEM CELL的间充质干细胞培养基MesenCultTM-ACF PLUS Medium(Human)，在培养基中加辅助干细胞生长添加物(MesenCultTM-ACF PLUS 500X Supplement)，以1∶2比例进行传代，长至90％时收集细胞上清。大量培养脐带间充质干细胞P5-P10代，收集大量细胞培养基，4℃、400g离心10min，4℃、2000g离心30min，4℃、10000g离心60min，去除细胞及细胞碎片，通过0.22μm滤膜过滤后200000g离心120min，离心2次后得到外泌体用PBS重悬，于-80℃保存，得到的三种间充质干细胞外泌体，即脐带间充质干细胞外泌体(HUMSC-EXO)、骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-EXO)、脂肪间充质干细胞外泌体(ADSC-EXO)。
2、外泌体的检测
将得到的三种间充质干细胞外泌体进行Western Blot、透射电镜观察、NTA检测。
Western Blot：采用BCA蛋白浓度检测法测定脐带间充质干细胞外泌体(HUMSC-EXO)、骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-EXO)、脂肪间充质干细胞外泌体(ADSC-EXO)蛋白浓度，Western blotting检测外泌体特征性标志物CD9、CD63、CD81和阴性标记物Cainexin，内参为GAPDH。
步骤如下：①总蛋白的提取：将收集到的外泌体超声波作用5s后冰上静置10s，如此反复10次以充分破解外泌体。4℃条件下，14000g离心15min，转移上清至新EP管中；②总蛋白的定量：采用BCA蛋白浓度检测法测定蛋白浓度：试剂A与试剂B按50∶1的比例配置BCA工作液，充分混匀。取2mg/mL BSA标准品进行连续倍比稀释，制成浓度依次为2000、1500、1000、750、500、250、125、25μg/mL的标准液。各稀释浓度蛋白质标准品与待测蛋白质样品均取25μL加入到96孔板中(各蛋白浓度做3复孔)，接着向各孔加入200μL工作液，充分混匀，37℃条件下孵育30min后在酶标仪上检测562nm波长时的吸光度值。绘制标准曲线，计算样品的浓度；③配胶：组装好玻璃板，加入配置好的10％的分离胶后，异丙醇液封。待分离胶凝固后，弃去异丙醇，滤纸吸干残留液体，接着加入5％浓缩胶，***梳子，待胶凝固。④电泳与转膜：取30μg蛋白质与5×上样缓冲液以4∶1的比例混匀，95℃蛋白变性5min，冷却后依次加样。按80V的浓缩胶和120V的分离胶进行电泳。当溴酚蓝指示线跑至与分离胶底部相距2cm处停止电泳。取出并切除四周无效凝胶，从阳极到阴极依次按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的顺序组装转膜架。按200mA的条件进行恒流转膜1h。(注意事项：转膜前滤纸需在转移缓冲液中浸泡，PVDF膜在分析纯甲醇中活化2min)；⑤封闭及抗体孵育：RT，PVDF膜于10％脱脂奶粉封闭液中封闭1h。随后将膜置于一抗溶液(CD9 1∶500，CD63 1∶1000，CD81 1∶1000，Cainexin 1∶1000，GAPDH 1∶1000)中，4℃冰箱孵育过夜。次日，TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次15min。将膜置于HRP标记的II抗(IgG 1∶3000)中，摇床上孵育1h后，TBST缓冲液再次漂洗PVDF膜3次，每次15min；⑥显影及成像：将Thermo Fisher化学发光试剂A液与B液混合成工作液，滴在PVDF膜上，化学发光成像分析仪上观察条带显影并拍照。
Western Blot的结果如图1所示，从图中可以看出脐带间充质干细胞外泌体(HUMSC-EXO)、骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-EXO)和脂肪间充质干细胞外泌体(ADSC-EXO)的标志性抗体CD9、CD63、CD81均呈阳性，而Cainexin、GAPDH均呈阴性，因此通过上述步骤获得了脐带间充质干细胞外泌体(HUMSC-EXO)、骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-EXO)和脂肪间充质干细胞外泌体(ADSC-EXO)。
透射电镜观察：将孔径为2nm的载样铜网固定于支架上，滴加20μL的外泌体悬液于铜网正面，室温静置60s；利用干燥滤纸从铜网侧缘吸干液体，滴加2％醋酸双氧铀溶液20μL，室温负染60s；经干燥滤纸自铜网侧缘吸干负染液；将载样铜网烘干10min；将载样铜网置于TEM样品小室内，观察SMSC-Exos的形态，摄电镜照片。
透射电镜观察的结果如图2所示，从图中可以看出脐带间充质干细胞外泌体(HUMSC-EXO)、骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-EXO)和脂肪间充质干细胞外泌体(ADSC-EXO)在电镜下均呈双凹圆饼形。
NTA检测：参照仪器说明书要求，调整Nano Sizer的各项参数；向比色皿中加入2μL1∶1000稀释的外泌体样品；测定粒子数和粒子浓度；PBS清洗比色皿，样品重复测定6次；进行数据分析，导出分析报告。
NTA检测的结果如图3所示，从图中可以看出脐带间充质干细胞外泌体(HUMSC-EXO)、骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-EXO)和脂肪间充质干细胞外泌体(ADSC-EXO)粒径大小集中在97.9nm、112.2nm和113.1nm左右，呈单峰，密度均一，纯度较高。
二、间充质干细胞外泌体凝胶的制备
基础凝胶：将药用透明质酸钠0.15g、丙二醇20ml、苯甲酸钠0.1g、山梨酸钾0.1g、U-21 0.5g、NaOH 0.15g、去离子水75ml混匀后，4℃保存，备用。
外泌体凝胶：外泌体(外泌体使用前解冻)与基础凝胶以1ug∶1ul混匀，即可，最终得到了脐带间充质干细胞(HUMSC-EXO)外泌体凝胶、骨髓间充质干细胞(BMSC-EXO)外泌体凝胶和脂肪间充质干细胞(BMSC-EXO)外泌体凝胶。
三、间充质干细胞外泌体凝胶进行皮肤渗透性检测
干细胞外泌体孵育EXO-GLOW(Green)一个小时后使用EXOQUICK沉淀得到绿色荧光干细胞外泌体，配浓度梯度为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml的外泌体，通过贝克曼(Beckman)DTX 880/800多功能酶标仪检测AlexaFluor 488(H2O)荧光条件下干细胞外泌体的吸光度，绘制标准曲线：Y＝3695X-28.033(X为干细胞外泌体浓度，Y为吸光度)(如图4所示)。将绿色荧光的干细胞外泌体在与基础凝胶1∶1混匀，取150ug绿色荧光干细胞外泌体与150ul凝胶混匀后，作用于SD大鼠游离皮肤，分别于4h、6h、8h、10h、12h取残留凝胶，用PBS稀释至1ml，用多功能酶标仪检测荧光含量，带入标准曲线，计算外泌体凝胶皮肤渗透率。结果如表1所示：在皮肤作用12h后干细胞外泌体在皮肤的渗透率可达21％。
表1不同时间干细胞外泌体皮肤渗透率
时间 4h 6h 8h 10h 12h
吸光度 1840 1760 1720 1640 1580
皮肤渗透率 8％ 12％ 14％ 18％ 21％
四、间充质干细胞外泌体的细胞内吞实验
将成纤维细胞以3×103个/孔的细胞密度种于96孔板中，一共种6个孔，37℃，5％CO2条件下培养；将干细胞外泌体进行红色荧光标记DIR后与2孔成纤维细胞共培养8h，同时2孔加入等量的PBS作为对照组，8h后弃上清并加入PBS清洗两次，多聚甲醛固定10min，PBS漂洗3次，DAPI染核60s，PBS漂洗3次；倒置荧光显微镜下观察BMSCs对DiR-Exos的摄取情况，结果如图5所示，可见红色荧光外泌体全部进入细胞内，在DAPI蓝染的核周围(图5中A)；加入PBS的对照组，未发现DAPI蓝染的核周围有红色染料(图5中B)。
五、衰老动物模型建立
衰老小鼠模型：选取健康成年雄性Balb/c小鼠35只，对小鼠背部进行刮毛处理，每天将小鼠暴露在紫外辐射进行照射(UVB-313波长在280-320nm之间，其灯的峰值光谱输出约为313nm，UVA-340其波长在320-400nm之间，灯的峰值光谱输出为340nm)，选取两个UVB灯管和一个UVA灯管，通过紫外线强度计测量鼠笼底部小鼠活动范围紫外线剂量，并测得小鼠的最小红斑剂量(MED)为60mJ/cm2，从最小红斑剂量照射，动物每周接受3次照射，共照射8周。UVB和UVA第一二周照射剂量均为60mJ/cm2，第三周照射剂量均为120mJ/cm2，第四周照射剂量均为180mJ/cm2，第五到八周照射剂量均维持在240mJ/cm2，每周测量一次体重，获得衰老小鼠模型30只。
其中，照射剂量的输出用紫外测量仪进行测量，具体公式为：
照射剂量(mJ/cm2)＝光照射时间(秒)x紫外照射密度(mW/cm 2)。
六、脐带间充质干细胞外泌体凝胶应用于缓解衰老结果观察
每组脐带间充质干细胞外泌体凝胶用于缓解衰老的衰老小鼠模型平均随机分为三组，每组10只：外泌体组、基础凝胶组和空白对照组。外泌体组：在小鼠背部皮肤表面涂抹步骤二得到各个干细胞的外泌体凝胶；基础凝胶组，在小鼠背部皮肤表面涂抹与外泌体组中外泌体凝胶等量的基础凝胶；空白对照组，无特殊处理。两周后进行观察在普通光学显微镜下观察组织结构，进一步取背部正中皮肤组织行HE染色及Masson染色对比皮肤变化，采集HE染色及Masson染色照片。
脐带间充质干细胞外泌体凝胶的结果如图6所示，肉眼可见外泌体组(图6中A)小鼠背部皮肤相比于基础凝胶组(图6中B)的小鼠背部皮肤的皱纹减少。从HE染色结果可以看出与基础凝胶组(图6中B)相比外泌体组(图6中A)小鼠的背部表皮厚度增加，从Masson染色结果可以看出与基础凝胶组(图6中B)相比外泌体组(图6中A)小鼠的背部真皮胶原纤维密度增加。并且基础凝胶组和外泌体组均比空白对照组背部皮肤衰老情况好转。
骨髓间充质干细胞外泌体凝胶的结果如图7所示：肉眼可见外泌体组(图7中A)小鼠背部皮肤相比于基础凝胶组(图7中B)的小鼠背部皮肤的皱纹减少。从HE染色结果可以看出与基础凝胶组(图7中B)相比外泌体组(图7中A)小鼠的背部表皮厚度增加，从Masson染色结果可以看出与基础凝胶组(图7中B)相比外泌体组(图7中A)小鼠的背部真皮胶原纤维密度增加，并且基础凝胶组和外泌体组均比空白对照组背部皮肤衰老情况好转。
脂肪间充质干细胞外泌体凝胶的结果如图8所示：肉眼可见外泌体组(图8中A)小鼠背部皮肤相比于基础凝胶组(图8中B)的小鼠背部皮肤的皱纹减少。从HE染色结果可以看出与基础凝胶组(图8中B)相比外泌体组(图8中A)小鼠的背部表皮厚度增加，从Masson染色结果可以看出与基础凝胶组(图8中B)相比外泌体组(图8中A)小鼠的背部真皮胶原纤维密度增加，并且基础凝胶组和外泌体组均比空白对照组背部皮肤衰老情况好转。
具体HE染色步骤如下：①组织切片***染色缸内，常规脱蜡入水，流水漂洗3次；②苏木素染液5min，1％盐酸酒精分色，流水漂洗3次；③氨水中10-20s，促蓝，流水漂洗3次；④伊红染色3min，流水漂洗3次；⑤常规脱水、透明、中性树胶封固。
具体Masson染色步骤如下：①石蜡切片脱蜡至水。②置Harris苏木素染液染核10min。③在1％盐酸酒精中分化数秒，充分水洗。④用Masson丽春红酸性品红液5-10min后，充分水洗。⑤以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻，用1％磷钼酸水溶液分化5min。⑥不经水洗，直接用苯胺蓝溶液复染5min。⑦以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。⑨依次采用95％乙醇、无水乙醇脱水2次，每次5min。⑨二甲苯透明2次，每次5min，吹干后用中性树胶封片。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.干细胞外泌体在制备延缓衰老的产品中的应用。
2.干细胞外泌体在制备促进皮肤皱纹减少的产品中的应用。
3.干细胞外泌体在制备促进表皮增厚的产品中的应用。
4.干细胞外泌体在制备促进胶原纤维密度增加的产品中的应用。
5.一种延缓衰老的产品，其特征在于：所述产品包括干细胞外泌体。
6.一种延缓衰老的产品，其特征在于：所述产品的活性成分为干细胞外泌体。
7.根据权利要求5或6所述的产品，其特征在于：所述产品还包括辅料。
8.根据权利要求5或6所述的产品，其特征在于：所述产品为凝胶。
9.权利要求5-8任一所述产品的制备方法，其特征在于：包括将干细胞外泌体作为活性成分得到所述产品的步骤。
10.根据权利要求1-4所述的应用，或，权利要求5-8所述的产品，其特征在于：所述干细胞外泌体来源于离体的脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和/或牙髓干细胞。
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