CN103446184A

CN103446184A - 羊膜间充质干细胞在制备延长寿命的药物、保健品或化妆品中的应用

Info

Publication number: CN103446184A
Application number: CN2013103586068A
Authority: CN
Inventors: 苗登顺; 谢春凤; 靳建亮
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2013-08-16
Filing date: 2013-08-16
Publication date: 2013-12-18

Abstract

本发明属于生物工程领域，公开了羊膜间充质干细胞在制备延长寿命的药物、保健品或化妆品中的应用。本发明经系列研究，发现羊膜间充质干细胞和/或其分泌产物具有抗衰老等作用，可用于制备延长寿命的药物、保健品或化妆品。

Description

羊膜间充质干细胞在制备延长寿命的药物、保健品或化妆品中的应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及羊膜间充质干细胞在制备延长寿命的药物、保健品或化妆品中的应用。

背景技术

随着全球老龄化社会的到来，老年健康及老年性疾病的防治已成为国际社会面临的重要公共卫生问题。我国是世界上人口最多的国家，也是老年人口最多的国家。国家***公布的第六次全国人口普查主要数据显示，以2010年11月1日零时为准，我国总人口为13.4亿人，其中60岁及以上人口占比已经达到13.26%。这意味着，我国将很快迈入“老龄社会”。为了解决老龄化社会所带来的困扰，抗衰老医学开始兴起。抗衰老也可以延年益寿。探索衰老机制，寻找抗衰老的新靶标与新疗法，成为生命科学的重大课题。

近几十年来，随着现代遗传学、分子生物学、细胞生物学和分子免疫学等边缘学科的飞速发展，人们对衰老的机理有了深层次的认识，提出了若干具有科学价值的衰老学说：程序性衰老学说，复制性衰老学说，自由基学说，DNA损伤修复学说等等。

衰老的自由基学说（free radical theory）是一直被人们普遍关注的具有代表性的衰老学说。这一学说由英国学者Harman在1956年首先提出，认为衰老是由于自由基对细胞成分攻击造成的结果。维持体内适当水平的抗氧化剂和自由基清除剂水平，可以起到延长寿命和延缓衰老的作用[1]。虽然这一学说还不能完全解释衰老这一机体非常复杂的过程，但自由基和衰老之间密切联系已得到国内外学者的广泛认同。

人体内总自由基中约95%以上属于氧自由基(oxygen free radicals,OFR)[2]，又称活性氧（reactive oxygen species,ROS），氧自由基主要来源于线粒体呼吸链反应，进入细胞的氧90%以上被线粒体用于生物氧化,在氧化磷酸化中消耗,代谢物被氧化的同时生成ATP。在线粒体氧化磷酸化生成ATP的过程中，大约有1～4%摄入的氧转化为氧自由基。由于机体抗氧化***的存在，正常情况下机体内自由基的产生与消除处于动态平衡，不会对人体产生伤害。机体中发挥抗氧化作用的主要有抗氧化酶类(如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-px)等)和非酶类抗氧化剂(如维生素C、维生素E和褪黑素(melatonin,MT)等)。随着年龄的增加，人体内自由基水平呈增长趋势，同时自由基清除机制却呈退化趋势，结果造成氧自由基在体内蓄积，并作用于机体细胞的生物大分子，如与核酸的碱基发生化学反应,导致DNA损伤；使生物膜的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，生成脂质过氧化物(lipid peroxidation,LPO)，LPO分解时产生的丙二醛(malonaldehyde,MDA)能使DNA、蛋白质发生交联等等，从而引发机体多种生理功能出现障碍，促进多种老年疾病（如动脉粥样硬化、心脑血管疾病、脑神经细胞变性、糖尿病及肿瘤等）的发生、发展，导致机体的衰老。

Bmi-1(B cell specific moloney murine leukemia virus insertion site 1)基因的表达产物为鼠类淋巴瘤滤过病毒(Bmi-1)致癌基因同源体(GenBank:L13689.1)。Bmi-1属于Polycomb(PcG)基因家族，PcG基因通常被认为在生物发育过程中维持HOX管家基因的时空特异性表达中起了转录抑制作用[3]。1994年，Nathalie等为了深入地研究Bmi-1基因的在体功能，运用同源重组技术在胚胎干细胞敲除此基因，建立了Bmi-1基因敲除(Bmi-1^-/-)小鼠模型，发现Bmi-1^-/-小鼠在神经和造血***有明显的发育缺陷和成熟前衰老的表型[4]。进一步的研究发现Bmi-1^-/-小鼠的神经和造血干细胞的自我更新的能力受损，干细胞池的稳定被打破，干细胞不断衰减，严重损伤了造血和神经***的发育和功能[5-7]。另有研究表明，Bmi-1^-/-小鼠全身许多组织细胞（胸腺、脾脏、骨髓）的ROS水平明显增加。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)能够使ROS水平明显降低并接近WT小鼠水平，并部分地纠正Bmi-1^-/-小鼠的衰老表型[8]。此结果提示Bmi-1可能通过抗氧化作用而发挥抗衰老的作用。

机体衰老是细胞衰老的最终结果，同时衰老也是干细胞和机体细胞数量不足的表现。干细胞作为所有细胞的来源，具有可复制性，由此成为抗衰老医学研究的新支点，越来越多的人期望抗衰老医学在干细胞领域率先取得突破。

干细胞种类繁多，对于运用干细胞研究抗衰老，最初，人们关注于胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)，因其具有无限增殖并且向三个胚层分化的能力[9]，但ES移植存在伦理学争议[10]、且移植后有成瘤性和排斥反应[11]。近来研究发现，成体干细胞也具有向三个胚层分化的能力，其中研究最多的是来源于骨髓的间充质干细胞(bonemarrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)[12]，但是BM-MSCs必须通过有创途径获得，而且随着年龄的增长，细胞的数量显著下降[13]，分化能力降低，所以这些类型的干细胞都因各自存在的问题而较难推广使用[14]。

最近有研究发现，羊膜间充质干细胞(amnion mesenchymal stem cells,AMSCs)具有与BM-MSCs相似的表型，即具有自我更新和多向分化的潜能，表达***标志物CD44、CD90、CD105、CD166[15]，不表达造血干细胞标志物CD34、CD45和单核细胞标志物CD14。AMSCs可能是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的一个中间等级的干细胞，因此增殖能力比BM-MSCs更强[16]。AMSCs低表达HLA-ABC，而不表达HLA-DR，从而说明AMSCs具有低免疫原性[15]，用于同种异体、异种异体移植后，均不会发生免疫排斥反应，而且AMSCs无致瘤性[17,18]，这为各种疾病的细胞替代治疗提供了新的选择。羊膜，是胎儿分娩后的废弃物，是一种易于获取、产量高、无伦理学限制的再生医学细胞来源。这些优势引起了人们对AMSCs的广泛关注，目前已被应用于研究与治疗肝硬化、心肌梗死、神经退行性病变[19]等疾病。

目前尚没有将羊膜间充质干细胞用于制备延长寿命的药物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供羊膜间充质干细胞在制备延长寿命的药物、保健品或化妆品中的应用。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

羊膜间充质干细胞和/或其分泌产物在制备延长寿命的药物、保健品或化妆品中的应用。

所述的应用，其中延长寿命的药物、保健品或化妆品是指抗衰老药物、保健品或化妆品。

所述的应用，其中抗衰老药物、保健品或化妆品是指抗免疫细胞衰老、清除自由基、或者增强抗氧化酶活性的药物、保健品或化妆品。

所述的应用，其中抗衰老药物、保健品或化妆品是指Wnt16蛋白表达抑制剂或者细胞周期素依赖性激酶抑制因子p16、p19或p27蛋白的抑制剂。

所述的应用，其中延长寿命的药物、保健品或化妆品是指改善血液***功能的药物、保健品或化妆品。

所述的应用，其中改善血液***功能是指改善造血功能障碍，尤其是改善淋巴细胞系造血功能障碍。

所述的应用，其中延长寿命的药物、保健品或化妆品是指促进骨骼生长药物、保健品或化妆品。

所述的应用，其中促进骨骼生长是指促进骨形成和/或改善骨质疏松。

所述的应用，其中延长寿命的药物、保健品或化妆品是指改善Bmi-1缺失的药物、保健品或化妆品。

本发明有益效果：

本发明在实施例1中使用Bmi-1^-/-小鼠作为衰老模型，将来自妊娠中晚期β-gal转基因小鼠的第2代AMSCs经腹腔注射到Bmi-1^-/-小鼠体内，观测Bmi-1^-/-小鼠生存期和体重的变化，利用病理组织学、免疫组织化学、分子生物学等方法比较分析了4周龄同窝WT小鼠、对照组Bmi-1^-/-小鼠和移植组Bmi-1^-/-小鼠不同组织器官的表型差异。结果表明AMSCs作为一种多能干细胞，既能通过其迁移到全身不同的组织器官，分化成不同器官的细胞，又能通过上调抗氧化酶的活性，清除氧自由基，抑制衰老相关基因，发挥部分矫正Bmi-1缺失引起早衰的作用。其作用既有AMSCs的直接作用，也有AMSCs分泌产物的作用。因此，AMSCs可用于制备新型抗衰老药物，另外，AMSCs用于制备抗衰老药物还有如下优点：不属于胚胎干细胞，无伦理学限制；容易获得；无创性；废物利用；排斥反应很小；应用领域广等等。

附图说明

图1：WT与Bmi-1KO小鼠的基因型

+/+为WT小鼠只显一条687bp条带；-/-为Bmi-1纯合子小鼠只显一条399bp条带；+/-为Bmi-1杂合子小鼠显2条条带，其中一条为687bp，一条为399bp。Neo：表示新霉素抵抗基因(neomycin-resistance gene)，是用于鉴定基因敲除小鼠最常用的标记基因。

图2：AMSCs的制备与干性特征

(A)第2代AMSCs的形态特征(400x)；(B)β-gal转基因小鼠来源的第2代羊膜间充质干细胞呈现Lac Z染色阳性(400x)；(C)AMSCs成骨方向诱导分化后表达碱性磷酸酶(400x)；(D)成脂方向诱导分化后显示油红阳性脂肪细胞(400x)；(E-L)流式细胞仪分析间充质干细胞标记分子CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，胚胎干细胞标记分子SSEA-4和造血干细胞标记分子CD34、CD45在AMSCs的表达；β-gal转基因小鼠来源的第2代羊膜间充质干细胞(M)Bmi-1基因PCR图和(N)Bmi-1Western blot图；(O)RT-PCR分析胚胎干细胞标记分子Oct4和CXCR4在AMSCs的表达；(P-R)免疫荧光染色分析胚胎干细胞标记分子CXCR4在AMSCs的表达(100x)。^*：p<0.05，^**：p<0.01，与对照组相比；Negtive：阴性对照。

图3：AMSCs的扩增

与对照组(A)control相比，分别经生长因子(B)表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、(C)碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、(D)EGF和bFGF和(E)活性维生素D（1,25-dihydroxyvitamin D,1,25(OH)₂D₃）干预，对第2代AMSCs处理8天后明显增加甲基蓝染色阳性AMSC的面积(亚甲基蓝染色)；(F)第2代AMSCs经A-E处理后8天后甲基蓝染色阳性AMSC面积的定量结果。

图4：AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠生存和生长的影响

(A)同窝WT、对照组Bmi-1^-/-和移植组Bmi-1^-/-小鼠存活率统计图；(B)4周龄小鼠体重变化曲线；(C)4周龄小鼠大体照；(D)4周龄小鼠胸腺的形态大小；(E)4周龄小鼠脾脏的形态大小.^**：p<0.01，^***：p<0.001，与同组WT小鼠相比；#：p<0.05，##：p<0.01，与同组对照组Bmi-1^-/-小鼠相比。

图5：AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠胸腺和脾脏T细胞发育的影响

同窝4周龄WT、对照组Bmi-1^-/-和移植组Bmi-1^-/-小鼠(A)胸腺和(B)脾脏T淋巴细胞流式分析结果图；胸腺中(C)CD4和CD8双阴性(DN)、(D)CD4和CD8双阳性(DP)、(E)CD8及(F)CD4单阳性细胞比例统计图；脾脏中(G)DP、(H)CD8及(I)CD4单阳性细胞比例统计图。^***：p<0.001，与同窝WT小鼠相比##：p<0.01，###：p<0.001，与同窝对照组Bmi-1^-/-小鼠相比。

图6：AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠骨髓和脾脏B细胞发育的影响

同窝4周龄WT、对照组Bmi-1^-/-和移植组Bmi-1^-/-小鼠(A)骨髓和(B)脾脏B淋巴细胞流式结果分析图；骨髓中(C)pro-B细胞、(D)pre-B细胞、(E)immature B细胞和(F)mature细胞比例统计图；脾脏中(G)T1期B细胞比例统计图。^*：p<0.05，^**：p<0.01，^***：p<0.001，与同窝WT小鼠相比；#：p<0.05，##：p<0.01，与同窝对照组Bmi-1^-/-小鼠相比。

图7：AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠骨骼衰老的影响

同窝4周龄WT、对照组Bmi-1^-/-和移植组Bmi-1^-/-小鼠(A)小鼠胫骨上端总胶原染色切片显微图像(50x)；(B)胫骨干骺端区和(C)胫骨骨干区HE染色切片显微图像(400x)；(D)Cbfa1、IGF-1和PPARγ Western blot图；(E)骨容量(BV/TV,%)统计图；(F)成骨细胞数(N.Ob/T Area,#/mm²)统计图；(G)脂肪细胞数(N.Ad/T Area,#/mm²)统计图；(H)Cbfa1、(I)IGF-1和(J)PPARγ蛋白相对表达水平统计图。^**：p<0.01，^***：p<0.001，与同窝WT小鼠相比；#：p<0.05，##：p<0.01，###：p<0.001，与同窝对照组Bmi-1^-/-小鼠相比。

图8：供体细胞在宿主器官中的分布

同窝4周龄对照组Bmi-1^-/-和移植组Bmi-1^-/-小鼠心、肝、脾、肺、肾、骨髓和胸腺组织中(A)Bmi-1基因PCR图和(B)Bmi-1Western blot图；（C）β-gal转基因小鼠来源的Lac Z阳性AMSCs在对照组Bmi-1^-/-和移植组Bmi-1^-/-小鼠肺、脾和肾脏中的分布（400x）。

图9：AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠不同器官氧化应激相关指标的影响

同窝4W WT、对照组Bmi-1^-/-和移植组Bmi-1^-/-小鼠全身各组织器官(A)ROS相对水平、(B)H₂O₂相对含量、(C)过氧化氢酶(catalase,CAT)相对活性和(D)总超氧化物歧化酶（total-superoxide dismutase,T-SOD）相对活性的统计图。^*：p<0.05，^**：p<0.01，^***：p<0.001，与同窝WT小鼠相比；#：p<0.05，##：p<0.01，###：p<0.001，与同窝对照组Bmi-1^-/-小鼠相比。

图10：AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠衰老蛋白表达的影响

同窝4周龄WT、对照组Bmi-1^-/-和移植组Bmi-1^-/-小鼠骨组织(A)Wnt16、p16、p19和p27Western blot图；(B)Wnt16、(C)p16、(D)p19和(E)p27蛋白相对表达水平统计图。^*：p<0.05，^**：p<0.01，^***：p<0.001，与同窝WT小鼠相比；#：p<0.05，##：p<0.01，###：p<0.001，与同窝对照组Bmi-1^-/-小鼠相比。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1：羊膜间充质干细胞移植在抗Bmi-1缺失小鼠衰老中的作用及机制研究

1.实验动物

本研究中所有实验小鼠均由南京医科大学SPF级动物实验中心饲养、繁殖，动物在屏障环境饲养，温度22～26℃，湿度45%～75%。实施例1中采用Bmi-1基因敲除动物杂合子小鼠（购自荷兰肿瘤研究所），进行雌雄配对合笼，获得野生型(WT)和Bmi-1纯合子(Bmi-1^-/-)小鼠。β-gal转基因小鼠(购自加拿大McGill大学动物中心)，剪尾1cm后通过LacZ染色(方法见下)鉴定基因型。细胞实验部分采用妊娠中晚期β-gal转基因小鼠；由于Bmi-1^-/-小鼠在出生后一个月内大部分死亡，因此动物实验部分选用出生后2天同窝WT和Bmi-1^-/-小鼠作为受体鼠，β-gal转基因小鼠作为供体鼠(妊娠中晚期)。

2.动物基因型鉴定

2.1β-gal转基因小鼠的鉴定：

2.1.1以LacZ缓冲液（2mM MgCl₂,0.01%脱氧胆酸钠,0.02%Nonidet-P40(NP-40，Ameresco，USA）in0.01M PBS,PH7.3）清洗鼠尾3次，每次5min。

2.1.2将0.5mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-galactoside,X-gal）溶于50μl/ml二甲基亚砜(galactoside,DMSO)，同时将5mM亚铁***和5mM铁***溶于LacZ缓冲液，然后将二者混匀。

2.1.3将此染色液加入盛有鼠尾的1.5mlEP管中，每管500μl。

2.1.4置于恒温孵育箱中，37℃，避光孵育过夜。

2.1.5次晨，观察鼠尾着色情况，着色为β-gal转基因小鼠，未着色为野生型小鼠。

2.2.2Bmi-1^-/-小鼠基因型的鉴定：

2.2.2.1溶解鼠尾：1.5ml EP管中加入350μl鼠尾溶解液（1000ml溶解液中含100mMTris-HCl、pH8.5、5mM EDTA、0.2%SDS、200mM NaCl，室温保存）和10mg/ml蛋白酶K10μl，55℃，摇床以170revolutions per minute(rpm)摇晃过夜。

2.2.2.2各管中加入350μl苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)溶液，剧烈振荡15秒，室温静置3min。

2.2.2.3离心15min(12000rpm)，使液体分为三层。

2.2.2.4取上层无色水相液体约200μl于新1.5ml EP管中，注意勿吸取中层液体。

2.2.2.5新EP管中加入400μl无水乙醇后，颠倒数次至产生絮状沉淀。

2.2.2.6离心5min(12000rpm)。

2.2.2.7弃液，倒置EP管于吸水纸上，室温干燥10min。

2.2.2.8各管中加100μl无菌蒸馏水后，55℃水浴1小时以溶解DNA。

2.2.2.9Bmi-1PCR反应体系

Bmi-1的正向引物序列为：5’-CAGTTAGGCAGTATGTAGTTTTC-3’，反向引物为5’-GTTGTGGTGGAGTGTAAGAGTGT-3’；

NEO基因的正向引物为：5’-AAGATGTTGGCGACCTCGTATTGG-3’，反向引物为：5’-GCAAGACCTGCCTGAAACCGAACT-3’。

引物由上海Invitrogen公司合成。

2.2.2.10Bmi-1PCR反应条件

NEO PCR反应体系及反应条件同Bmi-1。Bmi-1扩增产物为687bp，NEO扩增产物399bp。

2.2.2.11PCR产物电泳

配制2%琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖，加入50ml TAE缓冲液，混匀，微波加热5～7min，至琼脂糖完全融解，取出置通风橱中，冷却至65℃，加入2μl溴乙锭(EB)液，混匀，倒入预先准备好的电泳槽中，立即***梳子。待其完全冷却时，拔出梳子，调整好凝胶方向并将凝胶置于TAE电泳缓冲液中。

将PCR产物加入6×上样缓冲液4μl，混匀、离心，取12μl加入已经预制好的2%琼脂糖凝胶的上样孔中，120V，电泳10min。将电泳后的凝胶拍照、存档，记录基因型(图1)。

3．种子细胞的的制备

3.1小鼠AMSCs的原代及传代培养

3.1.1取妊娠中晚期β-gal转基因小鼠进行研究。

3.1.2小鼠经***麻醉，颈椎脱臼处死，浸入75%酒精。

3.1.35min后，将小鼠从75%酒精中取出，移到超净台内。

3.1.4将羊膜机械地剥离，用PBS反复冲洗，去除血迹，剪碎羊膜。

3.1.5加入0.05%trypsin+0.02%EDTA，于37℃，200r/min，消化，55min。

3.1.6离心，1500r/min，5min，弃掉胰酶。

3.1.7用PBS冲洗，离心，1000r，5min，弃去上清。

3.1.8αMEM标准培养基(αMEM+15%FBS+2mM L-谷氨酰胺+100U/ml青链霉素+50μg/ml抗坏血酸)重悬组织碎片，种于培养皿中，于37℃，5%CO₂中培养。每隔3天，半量换液一次，待生长到80%～90%整合时，收集贴壁细胞作为原代AMSCs。

3.1.9待生长到到80%～90%融合时，用2.5g/L的胰酶和0.02M的乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)，于37℃，消化3～5min，根据显微镜下观察到的细胞皱缩程度终止消化，吹打混匀，低速离心1000r/min，离心5min，加入标准培养基按1：2传代继续培养，得到传代细胞。

4.动物实验

4.1种子细胞的鉴定

使用LacZ细胞化学染色法确定种子细胞表达β-半乳糖苷酶。

4.1.1将细胞培养液倾倒后，以0.01M PBS冲洗3次，每次3min。

4.1.2加入高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛(periodate-lysine-paraformaldehyde，PLP)固定45min，再以LacZ缓冲液清洗3次，每次5min。

4.1.3将0.5mg/ml X-gal溶于50μl/ml DMSO，同时将5mM亚铁***和5mM铁***溶于LacZ缓冲液，然后将二者混匀。

4.1.4将此染色液加入培养皿中，置于37℃温箱中避光孵育过夜，水洗、显微镜下拍照。

4.2AMSCs腹腔内注射

用31号微量注射器将0.1ml细胞悬液(5×10⁶AMSCs/50μl)腹腔注射到出生后2天的Bmi-1^-/-小鼠体内，PBS作为对照研究，每周1次，持续3次。

4.3Lac-Z组织化学染色

4.3.1实验步骤

4.3.1.1对于以下三组小鼠：WT，Bmi-1^-/-和Bmi-1^-/-+AMSCs（Bmi-1^-/-小鼠移植AMSCs组）小鼠，在小鼠4周龄时进行研究，每组5只小鼠，共15只。

4.3.1.22%水合氯醛腹腔注射(0.2ml/10g)麻醉。

4.3.1.3沿前正中线剪开胸部及腹部，将灌注针***心尖部，同时剪开肝脏，进行生理盐水灌注。

4.3.1.4待血循环被冲洗干净时，再灌注PLP100ml。

4.3.1.5小心取下全身各组织器官标本，心脏标本沿冠状面，将其平均切成上、下两部分；肾脏标本撕去肾包膜，沿矢状面将其平均分成左、右两部分。肝脏、肺脏标本剪开。

4.3.1.6使用PBS清洗PLP。

4.3.1.7对于以上三组动物模型，各取三只动物的全身标本进行Lac-Z组织化学染色，

染色方法同以上基因型鉴定。

4.4大体观察及HE染色

4.4.1实验步骤

4.4.1.1进行LacZ组织化学染色24h后，在体视显微镜下进行观察拍照。

4.4.1.2拍照完毕后，进行PLP4℃后固定72h。

4.4.1.3脱腊水化，切片。

4.4.1.4取已经切好的切片，置于二甲苯中脱蜡，每次5min，共三次。100%酒精两次，每次3min，95%、80%、70%梯度酒***化，每次3min，流水冲洗5min。

4.4.1.5苏木素染色15s，流水冲洗5min，1%盐酸酒精分化20秒，流水冲洗至光学显微镜下观察细胞核呈蓝色为止。

4.4.1.6醇溶伊红染色1分钟，80%、95%、100%梯度酒精脱水，每次2min。

4.4.1.7二甲苯透明两次，每次2min。

4.4.1.8中性树胶封片。

4.5总胶原组织化学染色

4.5.1过饱和苦味酸直红染色液的配制

取苦味酸0.2克，加入150ml消毒蒸馏水，充分搅拌，静置后取上清100ml，在上清中加入0.1克天狼星红(Sirius Red)，充分搅拌，避光保存。

4.5.2实验步骤

4.5.2.1取各组已经切好的切片，脱腊水化。

4.5.2.2将配制好的过饱和苦味酸直红染色液孵育于标本上，室温孵育1小时。

4.5.2.3流水冲洗5分钟，苏木素复染1分钟，流水冲洗3分钟，1%盐酸酒精分化10秒，流水冲洗至光学显微镜下观察细胞核呈蓝色为止。

4.5.2.4梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

4.5.2.5正置荧光显微镜(日本Olympus公司)下观察，用DP70型CCD(日本Olympus公司)采集图像。

4.5.2.6用Northern Eclipse软件(美国Empix Imaging公司)进行图像定量分析，定量指标包括：BV/TV：即骨小梁区域的总胶原阳性面积与骨小梁区域的面积的百分比。用SPSS13.0统计软件进行分析。

5.流式细胞仪测活性氧(ROS)水平

5.1实验步骤

5.1.1实验小鼠脱颈椎处死后，取全身各组织器官，胫骨组织用5ml注射器将骨髓细胞冲出并反复吹打，用注射器从针头推出，制成单细胞悬液。其他组织，剪碎，经200目筛网滤过制成单细胞悬液。1500rpm，4℃离心5min，弃上清。

5.1.2加入1ml预冷的PBS制得单细胞悬液，调整待测细胞的浓度为1×10⁶～10⁷个/ml。1500rpm，4℃离心10min，弃上清。

5.1.3加入预制的荧光探针2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酯(2,7-dichlorofluorescin dictate,DCF-DA)工作液，轻轻混匀后37℃孵育30min。1500rpm，4℃离心10min，弃上清。

5.1.4加入10%胎牛血清37℃孵育20min。1500rpm，4℃离心10min，弃上清。

5.1.5加入适量PBS，流式细胞仪检测细胞内荧光探针的平均荧光强度。

5.1.6用SPSS13.0统计软件进行分析。

6.组织总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、过氧化氢(hydrogendioxide,H₂O₂)和过氧化氢酶(catalase,CAT)含量的检测

6.1实验步骤

6.1.1组织匀浆的制备

6.1.1.1取全身各组织器官块(0.2g-1g)在预冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入4ml的试管中。

6.1.1.2用移液管量取0.86%冷生理盐水，生理盐水的体积总量应该是组织块重量9倍，将生理盐水移入试管中，用眼科剪尽量将组织块剪碎。

6.1.1.3机器匀浆：用组织匀浆机以15000r/min，匀浆时间10秒/次，间隔30秒，连续3-5次，在冰上进行。

6.1.1.4将制备好的10%组织匀浆液用低速离心机在4℃，以2500r/min离心10分钟，离心好的匀浆留取上清液弃下面沉淀不用。

6.1.2考马斯亮兰蛋白含量测定

用生理盐水稀释上清制备1%组织匀浆液，测定范围为1mg/ml左右为宜。按说明书操

作步进行：

按公式计算：

6.1.3T-SOD活性检测

测定原理：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应***产生O₂ ^-，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现***，当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少。根据抑制率的高低计算出T-SOD的活性。

测定方法，取组织上清液，再用冷生理盐水1：9稀释成1%匀浆液。按说明书操作步进行：

计算：

a、定义：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。

b、公式：

6.1.4H₂O₂含量检测

测定原理：过氧化氢H₂O₂可以与钼酸作用生成一种络合物在405nm处测定其生成量可计算出H₂O₂的量。

测定方法，取组织上清液，根据不同的组织蛋白含量，再用生理盐水稀释成合适的比例，按说明书操作步骤进行：

计算公式：

6.1.5CAT活力检测

测定原理：过氧化氢酶(CAT)分解H₂O₂的反应可通过钼酸铵而迅速中止，剩余的H₂O₂与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，可计算出CAT的活力。

测定方法：取组织上清液，再用生理盐水稀释成最佳取样浓度，待测。

计算

a.定义：每毫克组织蛋白每秒钟分解1μmol的H₂O₂的量为一个活力单位。

b.公式：

6.1.6用SPSS13.0统计软件进行分析。

7.蛋白印迹(Western Blot)检测

7.1实验步骤

7.1.1试剂配制

7.1.1.1RIPA试剂配方：

注：各成份混合后出现沉淀，需用NaOH溶解，再用浓盐酸调pH至7.2后加入Cocktail1片，500μl分装入4ml EP管。

7.1.1.22×加样缓冲液配方：

7.1.1.3分离胶和浓缩胶配方：

7.1.1.430%丙烯酰胺(AA)液配方：

注：混匀后37℃溶解，滤纸过滤，棕色瓶存于室温。每隔数月须重新配制(pH值不超过7.0能用，否则须重新配制)。

7.1.1.510%十二烷基磺酸钠(SDS)配方：

试剂名剂量

电泳级SDS 10.0g

ddH₂O 100ml(定容)

注：加热到68℃并用磁力搅拌器搅拌助溶，浓盐酸调pH7.2，定容至100ml，室温储存。7.3.1.610%过硫酸铵(APS)配方：

试剂名剂量

过硫酸铵（APS） 0.1g

ddH₂O 1ml

注：4℃保存，过硫酸铵在溶液中会慢慢衰变，故应隔周新鲜配置。

7.1.1.7蛋白电泳液(10×)配方：

7.1.1.8蛋白质转移缓冲液配方：

7.1.1.90.05%PBST(洗涤液)配方：

试剂名剂量

1×磷酸盐缓冲液（PBS） 1000ml

Tween-20 500μl

7.1.1.105%脱脂奶粉－PBST配方：

试剂名剂量

脱脂奶粉 5g

PBST 100ml

7.1.2对于以上三组动物模型，在移植后4周，取全身不同器官进行研究，每组5只小鼠，共15只。

7.1.3按质量/体积约为1:25比例加RIPA于样品管，匀浆器冰上匀浆，置冰盒中于摇床上摇30min。

7.1.413000rpm4℃离心15min。

7.1.5吸取脂肪层下的上清液(约100-200μl)于新EP管中。

7.1.6另取10μl加入新EP管中，利用考马斯亮蓝染色法，于核酸蛋白测定仪上测蛋白浓度。

7.1.7加入等体积2×加样缓冲液（loading buffer）于EP管，沸水煮5min，-40℃保存。

7.1.8取长短不一的两块玻板，用沾甲醇的脱脂棉(或乙醇)擦拭，挥发至干。将玻板封闭好以确保不漏胶。

7.1.9灌制分离胶：根据所检测的目的蛋白分子量配制适当浓度的分离胶，将凝胶溶液平稳地注入两层玻板中(以平稳流速从玻板的中间位置注入)，缓慢持续注入至液面距梳齿1.5cm处(或梳子齿长+1cm)，再在液面上小心注入一层水(或10%SDS，约2-3cm高)，以隔绝空气，静置至凝胶形成。

7.1.10制备浓缩胶：待分离胶完全聚合后(胶面与上面的水相有明显的界面，约30min)，倾出覆盖层液体，用滤纸吸净上层液体。混匀浓缩胶，以连续平稳的流速在分离胶上面注入浓缩胶液至两玻板间，然后立即***梳子。待浓缩胶完全聚合后，小心拔下梳子，注意不要改变玻板的相对位置。

7.1.11将凝胶板安置于电泳槽，在电泳槽上下即两侧电极槽中注入电泳缓冲液。

7.1.12加样：用微量进样器吸样紧贴玻璃板加样，每次加样后吸新鲜蛋白电泳液清洗进样器。

7.1.13电泳：恒压电泳110V2h。

7.3.14取出凝胶：从电泳装置上卸下玻板，用撬板撬开玻板。在紧靠最左边一孔的凝胶上部切除一角以标注凝胶的方位。

7.1.15转膜：在容器内装入足量的1×蛋白转移缓冲液，将凝胶、海绵二块、滤纸四张、硝酸纤维素膜1张(须在角上用铅笔作标记以分清正反面)，泡在1×蛋白转移缓冲液中平衡10～15min。按从黑板到白板，依次装上一块海绵、两张滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、两张滤纸、一块海绵，用滚棒滚压，保持整个装置内湿润和没有气泡。

7.1.16将此电转移装置放入电泳槽中，凝胶面向阴极，膜面向阳极，安装好。灌满转移缓冲液(需淹没凝胶)。

7.1.17恒流0.3A转移60-120min。

7.1.18转膜结束后，取出膜和凝胶，膜取出后用PBST漂洗3次×10min。

7.1.19封闭：硝酸纤维素膜放入平皿中，加入5%PBSTM封闭液，37℃封闭1h×2次。

7.1.20一抗孵育：把膜放入杂交袋中，封闭四周，在一角剪一小口，加入一抗(工作浓度按说明书所示，用1%PBST稀释)，膜周围尽可能不留气泡，4℃过夜。

7.1.21洗膜：膜用5%PBST洗3次，每次5min。

7.1.22二抗孵育：把膜放入新的杂交袋中，加入二抗(工作浓度按说明书所示，用1%PBST稀释)，置摇床上室温反应2h。

7.1.23膜用PBST洗5次，每次15min。

7.1.24显影：膜平放在护卡膜上(正面向上)，将Chemiluminescent Substrate kit(德国RocheCat No.11500708001)A液和B液各300μl1:1混合(根据膜大小调节用量)，均匀滴满整个膜面，反应1min。用吸水纸吸干膜周围的残液，用护卡膜把膜封好，注意不留气泡，放入压片盒，关日光灯，开红灯，剪与膜差不多大小的胶片，压在膜上，关上压片盒进行曝光(第1次一般为5min，充分曝光，第二次可依据第一次的结果选择曝光时间)。准备好三个托盘，从左至右依次是：显影液、自来水、定影液。取出胶片投入显影液中，在显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，用水漂洗去除显影液后，投入定影液中数十秒即可(见胶片变透明即可)，开灯，用水冲净胶片，晾干。

7.1.25将胶片置扫描仪上采集阳性条带，分析实验结果。

8.小鼠AMSCs培养、增殖分化及相关检测

8.1小鼠AMSCs培养

使用β-gal转基因小鼠羊膜制备原代AMSCs和第2代和3代AMSCs，方法同前。

8.2第3代AMSCs增殖能力的检测

8.2.1第3代AMSCs细胞悬液均分成5份，其中4份分别加入终浓度为10^-8mM活性维生素D(1,25-dihydroxyvitamin D,1,25(OH)₂D₃)，10^-7mM***素2(prostaglandin2,PEG2)，10ng/ml表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)，10ng/ml成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，每组分别种到三个直径60mm的培养皿中，做好标记，于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，每3天换一次培养液，培养7天后，去培养液终止培养，进行亚甲基蓝染色。

8.2.2亚甲基蓝染色：细胞用PBS冲洗后，无水乙醇固定30s，蒸馏水冲洗，10mM的硼酸盐缓冲液洗3mins，1%亚甲蓝室温下孵育30mins，染色结束后，用硼酸盐缓冲液冲洗干净，空气中晾干拍照。

8.2.3IPP图像处理软件计算细胞占培养皿底面积的百分比，并以均数±标准差(mean±SEM)表示，采用SPSS13.0软件时行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，两组均数之间比较采用t检验，P＜0.05示具有显著差异。

8.3第3代AMSCs分化能力检测

8.3.1诱导第3代AMSCs向成骨分化及检测

8.3.1.1AMSCs接种到培养皿中，24h后弃去培养基，换成成骨细胞诱导液(αMEM培养液、15%胎牛血清、100U/ml青霉素、100g/mL链霉素、10^-8M***、50μg/ml抗坏血酸)，于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，每3天换一次培养液，14天后终止培养并进行碱性磷酸酶染色。

8.3.1.2碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色法：细胞用PBS清洗1遍，无水乙醇固定，片刻倒掉，用自来水轻轻冲洗，再用硼酸盐缓冲液清洗1遍，加ALP底物液(萘酚1mg溶于50微升乙二醇苯醚后，与2mg快红同时溶于5ml PH9.2Tris-HCL)，室温，避光，15min。自来水冲洗，晾干后镜下观察拍照。

8.3.2诱导第3代AMSCs向脂肪分化及检测

8.3.2.1AMSCs接种于培养皿后，24h后弃去培养基，换成成脂诱导培养液(含15%胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、50μg/ml抗坏血酸、100μg/ml胰岛素，10^-8M***)，于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。每隔3天，换液1次。观察生长情况，第14天终止培养并进行油红染色。

8.3.2.2油红染色法：细胞用PBS轻轻冲洗后，4℃，PLP固定30min，PBS冲洗，加油红染液15min。60%异丙醇漂洗，轻轻振荡，去除多余染料，自来水冲洗，加入少量磷酸盐缓冲液，显微镜下观察拍片。

9.RT-PCR

9.1实验步骤

9.1.1将细胞培养液倾倒后，以0.01M PBS冲洗3次，每次3min。

9.1.2在100mm培养皿内加入1ml TRIzol，以无RNase的1ml枪头钝端将细胞从培养皿底部刮下，然后连同TRIzol一同转移至1.5ml无RNase的Eppendorf管。

9.1.3将匀浆样品在室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

9.1.4每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。

9.1.52-8℃10000×g离心15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。

9.1.6把水相转移到新管中，用异丙醇沉淀水相中的RNA，每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，振荡混匀，室温放置10min。

9.1.72-8℃10000×g离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，弃上清。

9.1.8用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml75℅乙醇。不超过7500×g，2-8℃离心5min，弃上清。

9.1.9室温放置干燥RNA沉淀，大约晾5-10min。加入25-200μl无RNA酶(RNAase)的水，用枪头吸打几次，55-60℃水浴10min使RNA溶解。

9.1.10取1μl总RNA稀释到100μl在核酸测定仪上测量RNA浓度。

9.1.11取2μg总RNA(Xμl)进行逆转录：取Xμl总RNA加灭菌0.1%DEPC水至10μl+50pmol/μl Oligo(d)T151μl+10mM dNTP Mix1μl混匀，65℃水浴5min后快速置冰上。

9.1.12加下述反应体系：

9.1.13移液器轻轻吹打混匀离心，37℃水浴55min。

9.1.1470℃水浴15min。收集逆转录产物（cDNA）于-86℃冰箱保存。

9.1.15PCR反应引物：

Bmi-1的正向引物序列为：5’-ATTGATGCCACTACCATAAT-3’，反向引物为5’-CCTGGACATCACAAATAGGAC-3’；

Oct4的正向引物序列为：5’-CGCCCGCATACGAGTTCT-3’，反向引物为5’-CTTCTCCAACTTCACGGCATT-3’；

CXCR4的正向引物序列为：5’-GACGGACAAGTACCGGCTGC-3’，反向引物为5’-GACAGCTTAGAGATGATGAT-3’；

GAPDH基因（内参）的正向引物为：5’-CATTTCACTCAAGGTTGTCAGC-3’，反向引物为：5’-ATCATACTTGGCAGGTTTCTCC-3’。

引物由上海Invitrogen公司合成。

9.1.16PCR反应体系

9.1.17PCR条件：

GAPDH的PCR反应体系和条件同待检基因。Bmi-1扩增产物为103bp，Oct4扩增产物为188bp，CXCR4扩增产物为480bp，GAPDH扩增产物346bp。

9.1.18收集反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳验证荧光定量RT-PCR产物的分子量小并明确无非特异性扩增。

9.1.19使用紫外光测定法(ultraviolet photometry,UVP)计算机图像扫描分析***测定所检测基因信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)水平，以磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参照，计算所检测基因mRNA的相对含量，结果以所检测基因mRNA占GAPDH条带密度的百分率(%)表示。

10.流式细胞仪技术

10.1麻醉：腹腔注射1%戊巴比妥6-10μl/g体重。分离胸腺、脾脏，双侧股骨和胫骨，置于冰上。

10.2将筛网置于冰上培养皿中，研磨胸腺、脾脏，得到细胞悬液，冰上静置；用PBS将长骨骨髓冲出，得到细胞悬液，冰上静置。

10.32000rpm，离心5min，去上清，加PBS100μl重悬细胞。

在此步，细胞数量需要大致地调整，以不少于1x10⁷/份细胞为佳，以野生型对照小鼠(WT)细胞悬液为阴性对照。

10.4标记抗体：

10.5骨髓造血细胞：WT留3份细胞，2份作对照

10.6避光加抗体：（Sca-1,Lin,c-kit是造血干细胞(haemopoietic stem cell,HSC)的表面标记，其中，sca-1_-PE指第二通道PE红色荧光标记的抗小鼠sca-1抗体，Lin_-Alexa _Flour488指第一通道Alexa Flour488绿色荧光标记的抗小鼠Lin抗体，c-kit_-PE-CY5.5指第三通道PE-CY5.5紫色荧光标记的抗小鼠c-kit抗体）；

阴性对照：只加PE同型对照1.25μl；

第2份对照：加sca-1_-PE1.25μl；c-kit_-PE-CY5.50.3μl；

样本：加sca-1_-PE1.25μl，c-kit_-PE-CY5.50.3μl，Lin_-Alexa _Flour4885μl。

10.7室温，避光20min。加PBS至1ml重悬，2000rpm，5min，弃上清洗。

10.8.200μl PBS重悬，加200μl4%多聚甲醛混匀，避光4℃待上机检测。

10.9骨髓B细胞：

避光加抗体：

阴性对照：只加同型对照-FITC0.25μl；

样本：加B220_-PE2.5μl、CD43_-FITC0.25μl、IgM_-PECy5.51.25μl。

10.10同骨髓造血细胞。

10.11脾脏B细胞：

避光加抗体：

阴性对照：不加；

样本：加B220_-PE2.5μl、IgM_-PECy5.51.25μl、IgD_-Alex _Flour6470.625μl。

10.12同骨髓造血细胞。

10.13脾脏T细胞：

避光加抗体

阴性对照：不加；

样本：加：CD4_-FITC0.5μl、CD8_-PE1.25μl。

10.14同骨髓造血细胞。

10.15胸腺T细胞

避光加抗体：

阴性对照检：不加；

样本：加CD4_-FITC0.5μl、CD8_-PE1.25μl、CD25_-APC0.625μl、CD44_--PECy5.51.25μl。

（APC，Allophycocyanin，别藻蓝素，蓝色荧光）

10.16同骨髓造血细胞。

10.17上机分析。

11.血细胞计数

11.1取同窝4周龄WT、对照组Bmi-1^-/-和处理组Bmi-1^-/-小鼠，各6只。

11.2各组动物***麻醉，采用心脏采血法，取外周血20μl，加入180μl稀释液中，混匀后上机检测。每只小鼠检测3份。

12.统计分析

数据用均数±标准差表示，用SPSS13.0软件进行单因素方差分析或t检验，p<0.05被认为统计学意义。

结果:

1.1AMSCs的制备与干性特征

使用胰酶消化法分离培养原代AMSCs，培养3d天后，贴壁细胞迅速增多，可见细胞贴壁生长，呈梭形、多角形等。通过传代扩增的第2代AMSCs呈均一的长梭形(图2A)。经LacZ细胞化学染色、多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分别证实β-gal转基因小鼠来源的第2代AMSCs呈现β半乳糖苷酶活性(图2B，LacZ阳性)，表达Bmi-1基因和蛋白(图2M和N)，被用来作为供体细胞。

为了明确AMSCs的多向分化潜能，我们将第3代AMSCs向成骨细胞和脂肪细胞方向诱导，分别通过碱性磷酸酶染色、油红染色方法检测AMSCs向成骨细胞、脂肪细胞方向分化的能力。结果显示：向成骨细胞诱导培养14天后，碱性磷酸酶染色呈阳性，即碱性磷酸酶呈阳性表达(图2C)；向脂肪细胞诱导培养14天后，油红染色显示部分细胞已分化为脂肪细胞(图2D)；从而说明了AMSCs具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。

为了证实AMSCs的多能性特性及其***的特征，通过RT-PCR、免疫荧光、流式细胞仪检测了胚胎干细胞标记分子CXCR4、Oct-4、SSEA4，造血干细胞标记分子CD34、CD45以及间充质干细胞标记分子CD29、CD44、CD73、CD90、CD105在第2代AMSCs表达。结果发现：第2代AMSCs能够高表达***标记分子CD29、CD44、CD73、CD90、CD105(图2E-I)，不表达造血干细胞标记物CD34、CD45(图K-L)，并表达胚胎干细胞标记分子CXCR4、Oct4、SSEA4(图2J,O-R)。这些结果说明AMSCs具有间充质干细胞的表型特征。

1.2AMSCs的扩增

为了明确AMSCs的增殖潜能及其是否受到生长因子或激素的调节，第2代AMSCs经10ng/ml EGF、10ng/ml bFGF或10^-8M1,25(OH)₂D₃处理8天后，经亚甲基蓝染色检测了第2代AMSCs的增殖状况。结果显示：生长因子EGF和bFGF处理或联合处理及1,25(OH)₂D₃处理后，都能明显增加甲基蓝染色AMSC的面积(图3A-F)。这些结果说明：生长因子EGF和bFGF及1,25(OH)₂D₃都具有促进AMSC增殖的作用，可以用来刺激AMSC体外扩增。

1.3AMSCs移植延长Bmi-1^-/-小鼠的寿命和改善其生长发育

为了明确AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠成熟前衰老表型的影响，我们通过腹腔注射10⁶个AMSCs/50μlPBS到Bmi-1^-/-小鼠，从出生后2天开始，每周1次，注射3次，对照组腹腔注射PBS,继而分别对同窝WT小鼠、对照组Bmi-1^-/-小鼠和移植组Bmi-1^-/-小鼠存活率进行了监测。正常WT小鼠一般能存活2-3年，Bmi-1^-/-小鼠的平均生存期仅为4周左右，AMSCs移植组Bmi-1^-/-小鼠的生存期明显延长，14周左右仍有小鼠存活(图4A)。这一结果说明AMSCs移植能显著地延长Bmi-1^-/-小鼠的生存期。

与同窝WT小鼠相比，Bmi-1^-/-小鼠生后1天体格略小，随着年龄增长，逐渐出现驼背等表现。4周龄Bmi-1^-/-小鼠表现为体型小，体重轻，胸腺和脾脏大小、重量显著地低于WT小鼠。结果说明Bmi-1基因敲除导致小鼠出生后进行性生长阻滞。

为明确AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠体重、胸腺及脾脏的影响，我们比较分析了4周龄同窝WT、对照组Bmi-1^-/-小鼠和移植组Bmi-1^-/-小鼠的体型、体重以及胸腺和脾脏大小的差异。结果显示：与同窝对照Bmi-1^-/-小鼠相比，移植组Bmi-1^-/-小鼠体型明显增大(图4C)，从第3周起，体重明显升高(图4B)，但仍明显低于同窝WT小鼠；胸腺和脾脏的大小较同窝Bmi-1^-/-小鼠明显增大，仍小于同窝WT小鼠(图4D和E)。这些结果说明了AMSCs能够改善Bmi-1缺失早衰小鼠的生长阻滞。

1.4AMSCs移植改善Bmi-1^-/-小鼠的造血障碍

为明确AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠血细胞参数的影响，我们取同窝WT小鼠、对照组Bmi-1^-/-小鼠和移植组Bmi-1^-/-小鼠的外周血进行血液常规参数的检测。结果显示：与对照组Bmi-1^-/-小鼠相比，移植组Bmi-1^-/-小鼠淋系细胞比例得到明显的纠正(表1)。这些结果说明AMSCs的移植改善了缺失早衰小鼠的造血障碍。

表1.AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠外周血细胞参数的影响

^*：p<0.05，^**：p<0.01，^***：p<0.001，与同窝WT小鼠相比；#：p<0.05，与同窝对照组Bmi-1^-/-小鼠相比。

1.5AMSCs移植改善Bmi-1^-/-小鼠淋巴细胞发育障碍

为了进一步观察AMSCs移植后对Bmi-1^-/-小鼠T系和B系淋巴细胞发育的影响，我们通过免疫荧光染色，流式细胞仪检测了胸腺和脾脏T系淋巴细胞及骨髓和脾脏中B系淋巴细胞各阶段比例的变化。

胸腺是T细胞分化发育的场所，胸腺的大小变化反映了T细胞发育状态的改变。我们观察到4周龄Bmi-1^-/-小鼠的胸腺明显小于同窝WT小鼠。流式细胞分析发现与同窝WT小鼠相比，Bmi-1^-/-小鼠胸腺中CD4⁺CD8⁺双阳性细胞的比例明显低于WT小鼠，CD4^-CD8^-双阴性细胞比例明显增加。AMSCs移植4周后Bmi-1^-/-小鼠CD4⁺CD8⁺双阳性细胞的比例明显增加(图5A和5D)，CD4^-CD8^-双阴性细胞比例明显降低(图5A和5C)。这些结果说明AMSCs移植明显改善了Bmi-1缺失引起的胸腺细胞增殖和成熟的障碍。

成熟的T细胞可定居到外周淋巴器官中，我们进一步检测了脾脏中成熟T细胞的比例变化。流式细胞分析发现WT小鼠、对照组Bmi-1^-/-小鼠和移植组Bmi-1^-/-小鼠脾脏中成熟的CD4⁺和CD8⁺T细胞比例均无明显差异(图5B和5G)。

在骨髓中，B细胞的发育大概分为pro-B cell(B220+IgM^-CD43⁺)、pre-B cell（B220⁺IgM^-CD43^-）、immature B cell（B220⁺IgM⁺CD43^-）三个阶段。从骨髓出来的不成熟B细胞会进入脾脏定居，经过T1(IgM⁺IgD^-)和T2(IgM⁺IgD⁺)两个阶段最终成为成熟的B细胞(B220⁺IgM⁺CD43^-)。我们通过免疫荧光染色，流式细胞仪分析了AMSCs移植后对Bmi-1缺失小鼠骨髓和脾脏中不同阶段B细胞发育的影响。结果显示：与同窝WT小鼠相比，Bmi-1^-/-小鼠骨髓中pro-B细胞、pre-B细胞及immature B细胞亚群比例显著下降，matureB细胞无明显差异(图6A、C-F)，脾脏中T1(IgM⁺IgD^-)细胞比例显著下降(图6B、G）。这些结果证实了Bmi-1的缺失导致骨髓和脾脏B细胞亚群比例的改变。与对照组Bmi-1^-/-小鼠相比，移植组Bmi-1^-/-小鼠pro-B细胞比例在骨髓中明显地增加，脾脏中T1细胞也显著增加，达到同窝WT小鼠的水平(图6C)。这些结果说明了AMSCs移植能够部分矫正Bmi-1的缺失导致脾脏和骨髓中部分B细胞亚群比例的异常。

1.6AMSCs移植改善Bmi-1缺失早衰小鼠骨骼衰老

为了明确AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠骨骼衰老的影响，我们利用组织学、组织化学及Western blot的方法，观察了AMSCs移植对Bmi-1^-/-小鼠骨量、成骨细胞、骨髓中脂肪细胞及相关分子蛋白表达水平的影响。与WT小鼠相比，对照组Bmi-1^-/-小鼠骨容量和成骨细胞数均明显降低，骨组织中核心连接因子a-1(Cbfa-1)和***-1(insulin-like growth factor,IGF-1)蛋白表达水平均明显下调；但是，骨髓中脂肪细胞数明显增加，骨组织中主导脂肪细胞分化的基因产物过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome Proliferator-activated receptorγ,PPARγ)表达水平则明显上调(图7)。这些结果证实了Bmi-1^-/-小鼠存在成熟前骨质疏松的骨骼早衰表型。与对照组Bmi-1^-/-小鼠相比，移植组Bmi-1^-/-小鼠骨容量和成骨细胞数均明显升高，Cbfa-1和IGF-1蛋白表达水平均明显上调；骨髓中脂肪细胞数明显减少，骨组织中PPARγ表达水平明显下调，然而，这些指标都没有达到正常WT的水平。这些结果说明AMSCs移植能够通过增加成骨细胞骨形成，抑制骨髓脂肪细胞形成，而改善Bmi-1缺失引起的成熟前骨质疏松。

1.7移植的AMSCs能迁移到宿主不同器官中

为明确移植的AMSCs在Bmi-1^-/-小鼠体内不同器官的分布，我们通过PCR和Westernblot及LacZ组织化学染色检测了Bmi-1基因和蛋白在对照组和移植组Bmi-1^-/-小鼠不同器官中的表达和供体细胞在移植组Bmi-1^-/-小鼠不同器官的分布。结果显示：在对照组Bmi-1^-/-小鼠心、肝、脾、肺、肾、骨髓及胸腺组织中检测不到Bmi-1基因和蛋白的表达，而在移植组Bmi-1^-/-小鼠的这些器官组织中，能检测到Bmi-1基因和蛋白的表达(图8A和B)。移植组小鼠肺、脾脏和肾脏组织中观察到散在的LacZ阳性细胞，而对照组小鼠则检测不到LacZ阳性细胞(图8C)。这些结果说明AMSCs移植到Bmi-1^-/-小鼠体内，能够通过迁移，分布到达全身不同组织器官。

1.8AMSCs移植抑制Bmi-1缺失引起的氧化应激增加

为明确AMSCs移植延长Bmi-1^-/-小鼠的寿命及改善其早衰表型是否与其抗氧化应激作用有关，我们检测了同窝WT小鼠、对照组Bmi-1^-/-小鼠和移植组Bmi-1^-/-小鼠全身不同组织细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、过氧化氢(hydrogen peroxide,H₂O₂)含量、总超氧化物歧化酶(total-superoxide dismutase,T-SOD)活性和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性的变化。结果发现：与同窝WT小鼠相比，对照组Bmi-1^-/-小鼠肝、脾、肺、肾、骨髓、胸腺组织细胞中ROS水平明显升高，移植组Bmi-1^-/-小鼠肝、脾、肺、骨髓、胸腺组织细胞中ROS水平得到明显地改善(图9A)。与同窝WT小鼠相比，对照组Bmi-1^-/-小鼠心、肝、脾、肺、肾、骨髓、胸腺组织中H₂O₂含量显著增加，AMSCs移植后心、脾、骨髓、胸腺中H₂O₂含量明显降低(图9B)。同时，对照组Bmi-1^-/-小鼠心、肝、脾、肾、骨髓、胸腺组织中CAT活性显著降低，AMSCs移植后心、脾、肾、骨髓、胸腺组织中CAT活性明显纠正(图9C)。对照组Bmi-1^-/-小鼠心、肝、脾、肺、肾、骨髓、胸腺中抗氧化酶T-SOD活性显著降低，AMSCs移植后，心、脾、骨髓、胸腺中T-SOD的活性出现明显地改善(图9D)。这些结果说明AMSCs移植能够降低Bmi-1^-/-小鼠氧自由基水平，增强抗氧化酶的活性，达到抑制Bmi-1^-/-小鼠的氧化应激，从而发挥延长Bmi-1^-/-小鼠的寿命并改善其衰老表型的作用。

1.9AMSCs移植抑制Bmi-1缺失引起的衰老相关分子的表达水平

为了明确AMSCs移植改善Bmi-1缺失引起的骨骼早衰是否与抑制衰老相关基因的表达水平有关，我们通过Western blot检测了骨组织中Wnt16和细胞周期素依赖性激酶抑制因子p16、p19和p27表达水平的改变。结果显示：与同窝WT小鼠相比，对照组Bmi-1^-/-小鼠Wnt16、p16、p19和p27蛋白的表达水平均显著上调，而AMSCs移植后这些蛋白的表达水平均显著下调(图10)。这些结果说明AMSCs移植改善Bmi-1缺失引起的骨骼早衰可能与下调衰老调节分子Wnt16、p16、p19和p27蛋白表达水平有关。AMSCs及其分泌产物可用于制备Wnt16、p16、p19和p27蛋白的抑制剂。

讨论:

羊膜组织主要由中胚层来源的羊膜间充质细胞(amnion mesenchymal stem cells,AMSCs)和外胚层来源的羊膜上皮细胞(amnion epithelial cells,AECs)两类细胞组成。据文献报道，AECs不表达间充质细胞标记分子，体外培养时呈特有的铺路石样外观，而AMSCs高表达间充质细胞标记分子，体外培养时贴壁生长，呈长梭形，成纤维细胞样形态特征[17,20-23]。我们的研究结果也证实了AMSCs呈梭形，纺锤形，传代培养呈均匀一致的成纤维细胞样形态特征，表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，从而说明我们分离的细胞是AMSCs。我们进一步证实AMSCs能够表达胚胎干细胞标记分子CXCR4，Oct4和SSEA-4，不表达造血干细胞标记分子CD34、CD45，经体外诱导培养能够分化为成骨细胞或脂肪细胞，这与先前的AMSCs研究结果一致[17,18,23]。同时，我们还发现AMSCs的增殖受到生长因子bFGF和EGF，1,25(OH)₂D₃的调节。bFGF、EGF和1,25(OH)₂D₃都能明显地促进AMSCs增殖，bFGF和EGF联合处理能更加明显地促进AMSCs增殖。这些分子在促进AMSCs增殖中的作用机制尚有待研究。我们的结果支持AMSCs具有多能间充质干细胞特征的结论。

干细胞抗衰老疗法也称“再生医疗技术”，被誉为目前国际上最为有效的抗衰老治疗手段。其可能的作用机制如下：①直接作用：干细胞作为新兴的种子细胞是一种具有多向分化潜能的细胞。移植干细胞能自我更新并可分化成多种细胞，对组织进行修复。②旁分泌作用：干细胞能够分泌大量细胞因子，以间充质干细胞为例，其分泌因子在功能上主要可分为免疫调节、抗细胞凋亡、血管发生、支持干/祖细胞的增殖与分化、化学趋化、抗瘢痕六大类。它们通过自分泌或旁分泌的方式，改善机体局部微环境，促进内源性干细胞的迁移和分化，挽救濒临凋亡的细胞，从而达到抗衰老治疗的目的[24-25]。

近年来研究最多的干细胞是来源于骨髓的间充质细胞(bone marrow-mesenchymalstem cells,BM-MSCs)，但是BM-MSCs必须通过有创途径获得，而且随着年龄的增长，其数量和干细胞潜能显著下降。由于AMSCs系从产后废弃物的羊膜组织中分离获得，不仅来源充分、扩增能力强、低免疫原性，而且它的使用无伦理学问题，因此，被再生医学领域视为一种重要的供体细胞[16]。先前已有研究表明：将AMSCs移植到同种异体或异种异体动物后，能够通过迁移、归巢到病变组织器官，进而分化为相关的组织器官的细胞，如心肌细胞[17]、肝脏细胞[26]、神经细胞等，达到治疗不同的疾病，如肝硬化[26]、帕金森综合症[27]等。

Bmi-1基因是Polycomb Group基因家族成员之一，在生长发育过程中抑制了Hox基因的时空特异性表达。Bmi-1缺失小鼠表现为成熟前早衰，生存期显著缩短，仅能存活4周左右，主要与神经干细胞、造血干细胞和骨髓间充质干细胞的自我更新能力下降有关[4-7,28]。在本研究中我们将从β-gal转基因小鼠获取的第2代AMSCs作为供体细胞通过腹腔注射移植到Bmi-1^-/-小鼠体内，以探讨AMSCs移植在抗衰老中的作用及机制。结果发现AMSCs移植能明显延长Bmi-1^-/-小鼠的生存期，进而我们对4周龄同窝WT小鼠、对照组Bmi-1^-/-小鼠和移植组Bmi-1^-/-小鼠的表型进行了比较分析。

我们的研究结果发现，与WT小鼠相比，对照组Bmi-1^-/-小鼠体型、胸腺和脾脏显著减小，体重明显降低，这与以往的结果一致[28]。与对照组Bmi-1^-/-小鼠相比，移植组Bmi-1^-/-小鼠体重明显增加，体型、胸腺和脾脏均明显增大。上述结果说明AMSCs的移植显著矫正了Bmi-1^-/-小鼠部分的生长阻滞。

当Bmi-1缺乏时，小鼠表现出血液***的异常表型[29]。我们的研究结果也证实了4周龄Bmi-1^-/-小鼠外周血中白细胞、血小板显著减少，淋系粒系细胞比例倒置，其它血液参数(红细胞数、血红蛋白浓度、红细胞压积，平均红细胞体积)没有变化。AMSCs移植后，淋系细胞比例得到显著的纠正，其它参数无变化。这说明AMSCs的移植能够部分矫正了Bmi-1^-/-小鼠外周血细胞参数的异常。

胸腺是T细胞分化发育的场所，胸腺的大小变化反映了T细胞发育状态的改变。T细胞发育、功能及存活障碍将引发严重的细胞免疫缺陷。细胞免疫缺陷包括遗传性免疫缺陷和获得性免疫缺陷。而提搞胸腺中T细胞的产生乃是恢复T细胞免疫性的最合乎生理的途径。但困难是,随年龄增高胸腺的量和功能愈来愈差。与以往的实验结果一致，我们同样发现：与WT小鼠相比，Bmi-1^-/-小鼠胸腺明显减小，Bmi-1^-/-小鼠胸腺中CD4⁺CD8⁺双阳性细胞的比例明显低于WT小鼠，CD4^-CD8^-双阴性细胞比例明显增加[11]。所以Bmi-1^-/-小鼠可能存在遗传性免疫缺陷。我们发现：AMSCs移植后，Bmi-1^-/-小鼠胸腺中CD4⁺CD8⁺双阳性细胞的比例明显增加，CD4^-CD8^-双阴性细胞比例明显降低，但未恢复至WT水平。因此，我们的研究结果可证明：AMSCs移植能够部分矫正Bmi-1缺失引起的细胞免疫缺陷。

骨髓中B细胞的发育大概分为pro-B细胞、pre-B细胞、immature B细胞几个阶段[30,31]。我们的结果发现，Bmi-1的缺失导致骨髓和脾脏B细胞亚群比例的改变。与对照组Bmi-1^-/-小鼠相比，移植组Bmi-1^-/-小鼠pro-B细胞比例在骨髓中明显地增加，脾脏中T1细胞也显著增加，达到同窝WT小鼠的水平。脾脏体积的增大可能与成熟B细胞比例的增加有关。这些结果说明AMSCs的移植可能同时促进了骨髓中pro-B细胞的发育和脾脏中B细胞的成熟，从而部分矫正骨髓和脾脏异常的表型。因此，我们的研究结果证明了：AMSCs移植能够部分矫正Bmi-1缺失引起的造血障碍。

先前的研究结果显示，4周龄Bmi-1^-/-小鼠表现为成熟前的骨质疏松[28]。我们的结果发现，与WT小鼠相比，对照组Bmi-1^-/-小鼠骨容量和成骨细胞数均明显降低，骨组织中Cbfa-1和IGF-1蛋白表达水平均明显下调；但是，骨髓中脂肪细胞数明显增加，骨组织中PPARγ表达水平则明显上调，这与以往对Bmi-1^-/-小鼠的研究结果一致[28]。AMSCs移植后，尽管上述指标没有恢复至WT小鼠水平，骨容量和成骨细胞数显著增加、Cbfa1和IGF-1的蛋白表达水平显著上调，脂肪细胞数显著减少及Pparγ蛋白表达水平下调。这些结果说明AMSCs移植能通过促进成骨细胞骨形成和抑制骨髓脂肪细胞形成，不仅部分地矫正了Bmi-1缺失引起的成熟前骨质疏松的早衰表型，而且通过改善造血微环境促进了Bmi-1缺失引起的造血障碍的矫正。

AMSCs移植不仅可以改善造血微环境，而且可以通过造血***的矫正而进一步维持成骨微环境，改善其氧化应激水平，促进成骨，来较好地发挥防治骨质疏松的作用。

β-半乳糖苷酶是一个非常有效的分子标记物，可以有效地示踪供体细胞在体内迁移、分布、增殖和分化，以明确其在参与正常组织自我更新和损伤组织修复中的作用。在本研究中我们使用从β-gal转基因小鼠获取的AMSCs作为供体细胞，移植到Bmi-1^-/-小鼠体内，通过LacZ组织化学染色来示踪供体细胞在Bmi-1^-/-小鼠全身不同组织器官的分布。我们的结果发现在移植组Bmi-1^-/-小鼠肺、脾和肾脏检测到一些LacZ阳性细胞，而在对照组小鼠则检测不到。同时，我们利用PCR和Western blot的方法在Bmi-1^-/-小鼠全身不同器官检测到Bmi-1基因和蛋白的表达。我们的另一项研究通过移植β-gal转基因小鼠来源的AMSCs到WT小鼠，利用神经细胞特异性标记分子和β-gal免疫荧光双标，证明了移植的AMSCs能够分化为神经胶质细胞和少突胶质细胞[19]。这些结果说明移植的AMSCs能够通过血液循环迁移到Bmi-1^-/-小鼠不同组织器官，分化成不同组织的细胞，而发挥矫正Bmi-1缺失引起早衰的直接作用。

近期研究表明AMSCs培养上清中含有大量细胞因子[46]。Franz等[47]注射AMSCs上清液治疗大肠杆菌感染的全层皮肤烧伤大鼠的实验结果显示，在治疗后的第25天，隔周上清液治疗组较感染对照组伤口愈合度有15%的提高，而增加注射频次即隔天注射更可提高20%的伤口愈合度。由此说明了AMSCs具有有效的旁分泌作用。

当各种因素打破了体内自由基生成和消除的动态平衡时，就会使自由基超过生理限度从而导致组织损伤。衰老的自由基假说认为随着年龄的增长，活性氧在人体不断产生积累，引起细胞、组织和器官的衰老[48]。累积的ROS攻击机体细胞的生物大分子(脂质、蛋白质、核酸)而造成组织氧化性损伤导致衰老和相关疾病的发生。SOD是生物体内防御氧化损伤的重要的金属酶,它催化超氧阴离子·O₂ ^-发生歧化反应，从而清除·O₂ ^-；CAT是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使H₂O₂分解为分子氧和水，清除体内过氧化氢，从而使细胞免于遭受H₂O₂的毒害，是生物生防御体系的关键酶。先前的研究[8]表明：抗氧化剂通过降低氧化应激的水平去纠正Bmi-1^-/-小鼠的衰老表型。最近有研究[49]表明：干细胞移植也可以作为一种治疗手段，去治疗许多与氧化应激有关的疾病，如急性心肌梗死[50]、脑缺血[51]和糖尿病[52,53]，但是干细胞移植在抗氧化应激中的作用尚未见报道。大鼠MSCs和人骨髓基质细胞在抗坏血酸的条件下培养能够表达活性SOD1、SOD2、CAT、GSH-px以及硫氧蛋白还原酶已经被证实[54,55]。我们的结果发现：AMSCs移植能够延长Bmi-1^-/-小鼠的寿命，部分矫正Bmi-1缺失引起的造血障碍和成熟前骨质疏松。为了明确AMSCs移植在抗衰老中的作用机制，我们检测了同窝WT小鼠、对照组Bmi-1^-/-小鼠和移植组Bmi-1^-/-小鼠全身不同组织细胞内ROS水平、H₂O₂含量、T-SOD和CAT活性的变化。结果发现：AMSCs移植能够使Bmi-1^-/-小鼠不同组织器官ROS和H₂O₂含量降低，T-SOD好CAT活性升高。这些结果说明ASMCs移植可通过旁分泌作用增加抗氧化酶活性，清除自由基而发挥矫正Bmi-1缺失引起的衰老表型。

1987年，Rijsewijk等[56]通过对果蝇无翅基因Wg和小鼠致癌基因int-1的基因序列对比,发现二者具有高度的序列同源性,因此将二者合称为Wnt。Wnt的共同特点为能够编码一组含23～24个半胱氨酸保守序列的Wnt蛋白(Wnt1～Wnt16)[39,57]。Wnt信号通路由胞外信号分子(Wnt蛋白)、跨膜受体和复杂的胞内级联蛋白所组成,可分为经典途径和非经典途径两种。目前研究最广泛、最清楚的是Wnt/β-catenin信号通路也称为经典的Wnt信号通路。Wnt/β-catenin信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡和细胞定位控制等过程[58]。Binet等[59]的研究表明,无论在复制性衰老还是在癌基因诱导衰老的MEFs中，都可检测到高表达的Wnt16蛋白，在培养液内加入Wnt16蛋白可促进MEFs进了衰老,而用siRNA抑制Wnt16蛋白表达后，MEFs内p53及p21蛋白表达水平下调,细胞衰老被抑制。我们的研究结果也发现，与WT小鼠相比，Bmi-1^-/-小鼠骨组织中Wnt16蛋白表达水平明显上调，说明Wnt16表达上调在Bmi-1^-/-小鼠衰老中也起重要作用。我们的结果发现AMSCs移植明显抑制了Wnt16在Bmi-1^-/-小鼠骨组织中的表达。这些结果说明AMSCs移植通过旁分泌作用抑制Wnt16蛋白表达可能是其发挥抗衰老作用的机制之一。

先前的研究报道Bmi-1能通过p16和p19通路来调节神经干细胞[6,54]和造血干细胞[5,55]的增殖和凋亡。p27作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子之一在调控细胞周期进程中具有十分重要的作用[60]，是Bmi-1调控细胞周期的另一负性调控分子。为了明确AMSCs移植到Bmi-1^-/-小鼠体内引起的骨量增多和脂肪细胞减少是否与上调CDKI有关，我们通过Western-blot检测了p16，p19，p27在骨组织的表达。结果显示与同窝Bmi-1^-/-小鼠相比，p16、p19和p27在受体小鼠骨组织中的表达水平明显降低。这些结果说明AMSCs移植也能通过旁分泌作用抑制p16、p19和p27的表达发挥其抗衰老作用。

本研究表明多能干细胞AMSCs移植能够迁移到全身不同的组织器官，分化成不同器官的细胞，发挥部分矫正Bmi-1缺失引起早衰的直接作用；同时可通过旁分泌作用，上调抗氧化酶的活性，清除氧自由基，抑制衰老相关基因表达，发挥部分矫正Bmi-1缺失引起早衰的间接作用。本研究为AMSCs移植延缓衰老提供了理论和实验依据。

小结：

本发明在实施例1中，为了研究羊膜间充质干细胞移植在抗衰老中的作用及机制，我们将来源于β-gal转基因小鼠的第2代AMSCs移植到Bmi-1^-/-小鼠体内，比较分析了4周龄移植组Bmi-1^-/-小鼠与对照组Bmi-1^-/-小鼠不同器官的表型差异，小结如下表2：

表2：

注：↓↓↓：显著降低 ↓：降低(有统计学意义)

↑↑↑：显著增高(有统计学意义) ↑↑：明显增高

↑：增高(有统计学意义) -：阴性+：阳性

结论：

本研究结果表明AMSCs移植能够既能通过其迁移到全身不同的组织器官，分化成不同器官的细胞，又能通过分泌不同因子经旁分泌作用上调抗氧化酶的活性，清除氧自由基，抑制衰老相关基因，发挥部分矫正Bmi-1缺失引起早衰的作用。

缩略词

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Claims

1.羊膜间充质干细胞和/或其分泌产物在制备延长寿命的药物、保健品或化妆品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于延长寿命的药物、保健品或化妆品是指抗衰老药物、保健品或化妆品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于抗衰老药物、保健品或化妆品是指抗免疫细胞衰老、清除自由基、或者增强抗氧化酶活性的药物、保健品或化妆品。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于抗衰老药物、保健品或化妆品是指Wnt16蛋白表达抑制剂或者细胞周期素依赖性激酶抑制因子p16、p19或p27蛋白的抑制剂。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于延长寿命的药物、保健品或化妆品是指改善血液***功能的药物、保健品或化妆品。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于改善血液***功能是指改善造血功能障碍，尤其是改善淋巴细胞系造血功能障碍。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于延长寿命的药物、保健品或化妆品是指促进骨骼生长药物、保健品或化妆品。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于促进骨骼生长是指促进骨形成和/或改善骨质疏松。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于延长寿命的药物、保健品或化妆品是指改善Bmi-1缺失的药物、保健品或化妆品。