CN110903371B

CN110903371B - 烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1及其应用

Info

Publication number: CN110903371B
Application number: CN201911317223.XA
Authority: CN
Inventors: 张慧; 徐国云; 周会娜; 翟妞; 刘萍萍; 金立锋; 郑庆霞; 陈千思; 李泽锋
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN110903371A

Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1基因及其应用专利申请。该基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1由185个氨基酸残基组成。该蛋白与植物叶片纤维二糖含量相关，降低该基因的表达后，叶片中纤维二糖含量显著升高。本发明通过对烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1的初步研究，发现其与烟草纤维二糖含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草叶片中纤维二糖含量明显升高，基于这一特性，可为烟草新品种的培育提供应用基础和参考借鉴。

Description

烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1及其应用专利申请。

背景技术

糖类物质是烟草中一类重要的天然组分，按重量计算最多可占烟草总量的20%左右。在卷烟燃烧过程中，糖类组分通常会发生一系列的、复杂的化学反应，生成多种产物，从而直接或间接影响卷烟的感官品质。实际卷烟生产制造中，糖类物质也常作为添加剂在烟草制品中广泛使用，如作为保润剂、粘合剂、香味剂等。

作为糖类物质中最为常见的一种，纤维素是一种由葡萄糖组成的大分子多糖，也是世界上最丰富的可再生资源之一。工业生产中，通过将纤维素降解为小分子糖的转化，可用于加工制造燃料或者相关类别的精细化学品。

纤维二糖与纤维素的关系如同麦芽糖与淀粉的关系一样，水解后可得到两分子D-(+)-葡萄糖，即β-葡萄糖苷。纤维二糖作为纤维素分子的结构单元，也是纤维素酶水解纤维素时的主要产物，它能抑制纤维素酶的水解作用，但并不影响酶对纤维素的吸附。

总之，随着烟草基因工程深入，结合纤维二糖与纤维素的关系，以及纤维素对于烟草品质的重要影响，对于与烟草中纤维素类物质相关编码基因的深入研究和开发，可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定良好的技术基础。

发明内容

基于烟草纤维素类物质相关调控基因的研究，本发明目的在于提请一个烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1基因及其在烟草纤维二糖含量调控方面的应用，从而为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1的编码基因NtCRP1，由558个碱基构成，其中特异性核酸片段为53-396位碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示，。

所述编码基因NtCRP1在叶片纤维二糖含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草NtCRP1基因表达量，来调控烟叶纤维二糖含量情况。

所述编码基因NtCRP1的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtCRP1-F：5’- CAGCATACAAACCCAGAAAA - 3’，

NtCRP1-R：5’- ATAGAATGGCACACCATACC - 3’。

烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由185个氨基酸残基组成。

所述烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1在叶片纤维二糖含量调控中的应用，该蛋白与烟叶中纤维二糖含量有关，降低该蛋白含量后，烟叶中纤维二糖含量显著升高。

利用所述编码基因NtCRP1的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtCRP1基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得纤维二糖含量变化的烟草新品种；

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtCRP1基因的表达使其沉默，NtCRP1基因沉默植株中纤维二糖含量显著升高，进而获得具有新的纤维素含量特性的植物新品种。

换言之，一种培育高纤维二糖含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtCRP1基因的表达使其沉默，NtCRP1基因沉默的新烟草品种植株中纤维二糖含量显著升高。

在对烟草纤维素相关基因研究过程中，发明人通过对特定烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1的初步研究，发现其与烟草纤维二糖含量高度相关。实际功能验证过程中，在将该基因沉默后，烟草中纤维二糖含量发生了明显升高。基于这一特性，可为烟叶中纤维素含量条件、烟草新品种培育奠定一定技术基础和提供一定技术借鉴参考。

附图说明

图1 为与对照植株相比，NtCRP1基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2 为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的纤维二糖含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2（一种常用载体），其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；

MMA（100 mL）：1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M,pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As。

实施例1

本实施例就烟草NtCRP1基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草NtCRP1基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关NtCRP1基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtCRP1-F：5’- CAGCATACAAACCCAGAAAA - 3’，

NtCRP1-R：5’- ATAGAATGGCACACCATACC - 3’；

以烟草K326叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtCRP1基因；

PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组TRV2- NtCRP1载体

将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃过夜培养；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2- NtCRP1。

需要说明的是，

烟草NtCRP1基因，包括558个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体碱基序列为：

ATGTCTGTAGCATTTCTACAGCAAAGTTTCCTAATTAGTCCTCCTCTTTCTTCAGCATACAAACCCAGAAAAAATACCTCTTACTTTCCTGTACATAGCACTAAAATCTTGTGCAAACACACCCCAGATGATGAACCACAAGACTCTTTTAGGAAAAGTGAAAATAAATGGGGTAAGTTGGCATTAGTAGCAGTGGCAGCTGGGATATTGACAGTGGGGTCAGTGGATCCAGCTTCAGCTGCTAAGACTGGTGGTCGAGTTGGTGGTCAGGCTTTTCGATCTTCAGCTCCTCGCTCTTCTTCACCTAGGATCAATAATTCTAGAACAAATATCTATGTCAATCCACCAGTTGCTCCTCCTCTAGTTGGTGGATATGGGTATGGTGTGCCATTCTATGGTGGATGGGGCTGGTCGCCTTTCTCGTTCTTCGCACCAGGCCCTGGTGTTGCCGTTGGCGTCGGAGGTGGATTCGATACGCTGGTGCTGTTCTTGGTTCTTGGTGCTGTTGCTTCTGTTCTTCGGAGGGTTCTTCGGTCAAGAGACGAAGATGAATACTAG。

烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1，包括185个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体氨基酸序列为：

MSVAFLQQSFLISPPLSSAYKPRKNTSYFPVHSTKILCKHTPDDEPQDSFRKSENKWGKLALVAVAAGILTVGSVDPASAAKTGGRVGGQAFRSSAPRSSSPRINNSRTNIYVNPPVAPPLVGGYGYGVPFYGGWGWSPFSFFAPGPGVAVGVGGGFDTLVLFLVLGAVASVLRRVLRSRDEDEY。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2- NtCRP1载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2、TRV2-PDS重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2（载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2- NtCRP1的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；

取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD₆₀₀ =1.0 ~ 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA(1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M, pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As)重悬，调节OD₆₀₀=1.0 左右；

最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4 w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

注射3周后的烟草表型并无变化，进一步通过qRT-PCR对NtCRP1基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2- NtCRP1的侵染植株中，NtCRP1的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtCRP1浸染植株）和对照组（TRV2浸染植株）中的纤维二糖含量进行了检测，检测方法参照《基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程》（郑庆霞等，烟草科技，2019））。检测结果如图2所示，可以看出，实验组纤维二糖含量升高了1倍左右。基于此结果，可为烟叶中多糖类物质如纤维素组成、组份含量调整、以及新品种培育奠定一定技术基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1及其应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 558

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atgtctgtag catttctaca gcaaagtttc ctaattagtc ctcctctttc ttcagcatac 60

aaacccagaa aaaatacctc ttactttcct gtacatagca ctaaaatctt gtgcaaacac 120

accccagatg atgaaccaca agactctttt aggaaaagtg aaaataaatg gggtaagttg 180

gcattagtag cagtggcagc tgggatattg acagtggggt cagtggatcc agcttcagct 240

gctaagactg gtggtcgagt tggtggtcag gcttttcgat cttcagctcc tcgctcttct 300

tcacctagga tcaataattc tagaacaaat atctatgtca atccaccagt tgctcctcct 360

ctagttggtg gatatgggta tggtgtgcca ttctatggtg gatggggctg gtcgcctttc 420

tcgttcttcg caccaggccc tggtgttgcc gttggcgtcg gaggtggatt cgatacgctg 480

gtgctgttct tggttcttgg tgctgttgct tctgttcttc ggagggttct tcggtcaaga 540

gacgaagatg aatactag 558

<210> 2

<211> 185

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Ser Val Ala Phe Leu Gln Gln Ser Phe Leu Ile Ser Pro Pro Leu

1 5 10 15

Ser Ser Ala Tyr Lys Pro Arg Lys Asn Thr Ser Tyr Phe Pro Val His

20 25 30

Ser Thr Lys Ile Leu Cys Lys His Thr Pro Asp Asp Glu Pro Gln Asp

35 40 45

Ser Phe Arg Lys Ser Glu Asn Lys Trp Gly Lys Leu Ala Leu Val Ala

50 55 60

Val Ala Ala Gly Ile Leu Thr Val Gly Ser Val Asp Pro Ala Ser Ala

65 70 75 80

Ala Lys Thr Gly Gly Arg Val Gly Gly Gln Ala Phe Arg Ser Ser Ala

85 90 95

Pro Arg Ser Ser Ser Pro Arg Ile Asn Asn Ser Arg Thr Asn Ile Tyr

100 105 110

Val Asn Pro Pro Val Ala Pro Pro Leu Val Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly

115 120 125

Val Pro Phe Tyr Gly Gly Trp Gly Trp Ser Pro Phe Ser Phe Phe Ala

130 135 140

Pro Gly Pro Gly Val Ala Val Gly Val Gly Gly Gly Phe Asp Thr Leu

145 150 155 160

Val Leu Phe Leu Val Leu Gly Ala Val Ala Ser Val Leu Arg Arg Val

165 170 175

Leu Arg Ser Arg Asp Glu Asp Glu Tyr

180 185

Claims

1.烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1的编码基因NtCRP1在叶片纤维二糖含量调控中的应用，其特征在于，该基因所编码蛋白与烟草叶片纤维二糖含量相关，降低该基因表达量后，烟草叶片中纤维二糖含量明显升高；

所述烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1的编码基因NtCRP1，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1在叶片纤维二糖含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与烟草叶片纤维二糖含量相关，降低该蛋白含量后，叶片中纤维二糖含量明显升高；

所述烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.利用烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1的编码基因NtCRP1的烟草新品种培育方法，其特征在于，利用病毒诱导的基因沉默技术，干扰NtCRP1基因的表达使其沉默，NtCRP1基因沉默植株中纤维二糖含量显著升高，进而获得纤维二糖含量变化的烟草新品种；

4.如权利要求3所述烟草新品种培育方法，其特征在于，基因沉默过程中，构建基因沉默用重组载体过程中，PCR扩增烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1的编码基因NtCRP1时，引物序列设计如下：

NtCRP1-F：5’-CAGCATACAAACCCAGAAAA-3’，

NtCRP1-R：5’-ATAGAATGGCACACCATACC-3’。