CN110862445B

CN110862445B - 影响烟草色素含量的NtOEP1基因及其应用

Info

Publication number: CN110862445B
Application number: CN201911316510.9A
Authority: CN
Inventors: 徐国云; 刘萍萍; 周会娜; 郑庆霞; 张慧; 翟妞; 陈千思; 金立锋
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN110862445A

Abstract

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一个影响烟草色素含量的NtOEP1基因及其应用的专利申请。该基因包括999 bp碱基，其中第153‑522位核苷酸是其特异性核心片段，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其编码332个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本申请中，通过对烟草NtOEP1基因的克隆、分析，该基因在烟草色素合成途径调控上具有重要的用途，与植物叶片中色素类物质含量高度相关。进一步通过病毒介导的基因沉默技术，发明人发现在将NtOEP1基因沉默后，新的转基因植株中的色素类物质含量明显降低。利用这一特性，可为烟草的基因工程育种或其他植物新品种培育提供新的策略和路径。

Description

影响烟草色素含量的NtOEP1基因及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一个影响烟草色素含量的NtOEP1基因及其应用的专利申请。

背景技术

烟草作为一种叶用经济作物，其栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。而烟叶品质决定了烟叶的可用性，并直接影响卷烟成品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。

色素类物质是烟草生长过程中一类重要的化合物，主要包括叶绿素和类胡罗卜素类物质。叶绿素在烟草成熟和烟叶调制过程中会大量降解消失，其主要降解方式有两种：一种方式是叶绿素由噗啉环降解产生吡咯类化合物，从而增加烟叶陈化香；另一种方式是叶绿素水解产生的植醇可进一步降解成新植二烯，并再降解成植物呋喃，转化成烟叶的清甜成分。一般而言，叶绿素充分降解后对烟叶品质的提高较为有利，但如果不能降解完全，在干烟叶中，叶绿素就会变成一种不利的化学成分，进而使烟叶带有明显青杂气。而如果叶绿素在调制处理过程中没有充分降解就把烟叶烤干，就会烤出不同程度的“青黄烟”。“青黄烟”不仅外观品质不良，而且对于烟叶质量影响十分明显。因而叶绿素是否降解充分是烟叶分级中被严格控制的指标之一。

烟叶中的黄色素主要是类胡萝卜素，一般认为，烟叶中的类胡萝卜素含量与烟叶品质存在正相关关系，一方面是烟叶外观品质与该类成分含量直接相关；另一方面类胡萝卜素是烟草香气成分的重要前体物质，对烟草的香气量和香气品质呈正相关关系。研究表明，烟叶中的香味成分很大一部分是类胡萝卜素的降解产物，其中不少化合物是烟草中关键的致香成分，如紫罗兰酮、大马酮和异佛尔酮等。

总之，由于烟叶中色素类物质与烟叶品质、烟叶质量关系十分紧密，因而对烟叶色素有关基因的充分和深入研究，从而对色素类物质进行有针对性调控，对于烟叶品质改善和烟叶品种改良具有十分重要的理论和应用意义。

发明内容

本发明目的在于提供一个影响烟草色素含量的NtOEP1基因，从而能够对烟草中色素类物质含量有所调控，进而为改良烟草质量奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

影响烟草色素含量的NtOEP1基因，包括999 bp碱基，其中第153-522位核苷酸是其特异性核心片段，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述影响烟草色素含量的NtOEP1基因在叶片色素含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节NtOEP1基因表达量，来调节控制叶片中色素类物质含量高低。

所述影响烟草色素含量的NtOEP1基因的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtOEP1-F: 5'- ATGGCTGCCTCTCTACAAGC -3'，

NtOEP1-R: 5'- TCATTCAAGTTGGGCATACC -3'。

沉默所述影响烟草色素含量的NtOEP1基因的沉默载体TRV2-NtOEP1，以NTOEP1基因中第153-522位核苷酸作为VIGS的引导序列，通过将此核酸片段***TRV2-LIC空载体中，构建获得TRV2-NTOEP1载体，具体而言：

（1）PCR扩增

以NTOEP1基因中第153-522位核苷酸作为VIGS的引导序列，设计扩增所用引物序列设计如下：

NtOEP1-VI-F: 5'- TCGACGACAAGACCCTGCAGGCAAACTGAACTCAAGGACT -3'，

NtOEP1-VI-R: 5'- TGAGGAGAAGAGCCCTGCAGAATCTCATCAAGGGTGTAGG-3'；

上述序列中，F引物部分5’端的“TCGACGACAAGACCCTGCAG”部分序列、R引物部分5’端的“TGAGGAGAAGAGCCCTGCAG”为TRV2-LIC载体的接头序列；

（2）酶切、连接

利用限制性内切酶Pst I对TRV2-LIC质粒进行单酶切，然后利用Infusion连接酶将TRV2-LIC的单酶切产物和步骤（1）中的PCR扩增片段进行连接；

（3）转化、筛选

将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含有卡那霉素（50 mg/L）的LB培养基上涂布，37℃过夜倒置培养进行筛选以形成单菌落，进一步鉴定后，确定重组正确单克隆即为干涉用TRV2-NtOEP1重组载体。

影响烟草色素含量的NTOEP1基因所编码蛋白，包括332个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述影响烟草色素含量的NTOEP1基因所编码蛋白在叶片色素类物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中色素类物质含量相关，降低该蛋白表达含量后，叶片中色素类物质含量明显降低。

利用所述影响烟草色素含量的NtOEP1基因的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术等干扰、沉默、敲除或超量表达NtOEP1基因，可获得色素含量变化的烟草转化植株新品种。具体例如：

利用病毒介导的基因沉默技术（VIGS），以NtOEP1基因中第153-522位核苷酸作为VIGS的引导序列，将此核酸片段***TRV2-LIC载体中，构建获得TRV2-NtOEP1载体，并将该载体转化植株，通过筛选、鉴定获得NtOEP1基因沉默植株，所述NtOEP1基因沉默植株中色素类物质含量明显下降。

换言之，一种培育低色素类物质含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtOEP1基因的表达使其沉默，NtOEP1基因沉默的新烟草品种植株中色素含量显著下降。

本申请中，通过对烟草NtOEP1基因的克隆、对应蛋白的分析，发明人发现该基因在烟草色素合成途径调控上具有重要的用途，与植物叶片中色素类物质含量高度相关。进一步通过病毒介导的基因沉默技术，发明人发现在将NtOEP1基因沉默后，新的转基因植株中的色素类物质含量明显降低。利用这一特性，可为烟草的基因工程育种或其他植物新品种培育提供新的策略和路径。

附图说明

图1与空载体对照植株相比NtOEP1基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2病毒诱导沉默NtOEP1基因后的表型分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。

生物材料：

烟草材料，栽培烟草（Nicotiana tabacum）品种K326，购买于玉溪中烟种子有限责任公司；本氏烟（Nicotiana benthamiana）种子由中国农业科学院烟草研究所馈赠；

沉默烟草基因所用到的载体质粒TRV2-LIC（空载体对照）、TRV1、TRV2-PDS载体，购买于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。

基因测序及引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

实验试剂：

限制性内切酶、dATP、dTTP、PrimerSTAR GXL DNA polymerase、DNA凝胶回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、质粒DNA小量纯化试剂盒MiniBESTPlasmid purification Kit、乙酰丁香酮等，TAKARA生物技术有限公司产品；

RNA提取TRIZOL试剂，Invitrogen公司产品；

反转录试剂盒，Roche公司产品；

DNAase酶，Fermentas公司产品；

MES，Sigma公司产品；

Insusion连接酶，Clontech公司产品；

LB 液体培养基（1L）：10 g 细菌蛋白胨（bacteriological peptone），10 g 氯化钠（NaCl），5 g 酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

1M 2-(N- 吗啉) 乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O 溶解MES，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200 mM 乙酰丁香酮（Acetosyringone）储备液：无水乙醇溶解乙酰丁香酮，-20℃储存备用；

实验仪器：

PCR仪，型号为：Mastercycler ep gradient，德国Eppendorf 公司。

实施例1

本实施例主要就影响烟草色素含量的NtOEP1基因的获得过程，简要介绍如下。

（一）烟草RNA提取及cDNA合成

（1）总RNA提取

以生长3周左右的烟草K326的幼嫩叶片为样品，经液氮充分研磨成粉状后；

取约100 mg粉末状材料置于盛有1.0 ml的TRIZOL试剂的1.5 ml离心管中，随后加入200 μl氯仿，振荡混匀、离心，小心将上层水相转入另一离心管中；

加入500 μl异丙醇，沉淀、离心分离出RNA，再经75%酒精洗涤，室温微干后，加入适当体积的RNase free的水，充分溶解；

最后对所提取的总RNA经DNase I处理，以便后续cDNA制备，DNase I消化处理时，10μL反应体系参考如下：

所提取总RNA，1 μg；

10×reaction buffer with MgCl₂，1 μl；

DNase I（RNase-free），1 μl （1U）；

DEPC-treated water加至10 μl；

37℃水浴中放置 30 min。

（2）cDNA合成

在无菌0.2 ml离心管中配置模板RNA/引物混合液，70℃保温10 min后迅速在冰上急冷2 min以上，离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于离心管底部；

所述模板RNA/引物混合液（7μl体系），具体为：

步骤（1）中DNase I消化后RNA (100 ng/μl)，1 μl；

Oligo (dT) Primer (50 μM)，1 μl；

RNase free dH₂O，5 μl；

在上述离心管中配置反转录反应液后，42℃保温1 h；70℃保温15 min后冰上冷却，所得即为cDNA；

具体反转录反应液体系（10 μl）为：

上述模板RNA/引物变性溶液，7 μl；

5×M-MLV buffer，2 μl；

dNTP Mixture (各10 mM)，0.5 μl；

RNase Inhibitor （40 U/μl），0.25 μl；

RTase M-MLV (RNase H-) (200 U/μl)，0.25 μl。

（3）PCR扩增

首先，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtOEP1-F: 5'- ATGGCTGCCTCTCTACAAGC -3'，

NtOEP1-R: 5'- TCATTCAAGTTGGGCATACC -3'；

随后，以步骤（2）中所制备cDNA为模板，进行PCR扩增，50μl扩增体系设计如下：

cDNA模板，1 μl；

GXL polymerase，1 μl；

5×GXL buffer，10 μl；

dNTP Mixture (10 mM)，4 μl；

Primer-F/R，8 μl；

ddH₂O，26 μl；

PCR反应程序如下表所示：98℃、10 sec；55℃、10sec，68℃、1min，35个循环，72℃延伸5min。

对扩增获得的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，随后回收PCR扩增产物并纯化后，进行测序。

测序结果表明，本申请克隆所得NtOEP1基因，包括999 bp碱基，其中第153-522位核苷酸是其特异性核心片段，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGGCTGCCTCTCTACAAGCAGCTGCTACTCTAATGCAACCAACAAAGGTTGGTGTTGCCCCAGCTAGAAACAACCTGCAGTTGAGGTCTGCTCAAAGTGTGAGCAAAGCATTTGGTGTTGAACCAGCTGCAGCTAGGCTTACTTGCTCTTTGCAAACTGAACTCAAGGACTTGGCTCAAAAGTGCACTGATGCTGCCAAGGTTGCTGGTTTTGCTCTGGCCACTTCTGCCCTTGTCGTCTCAGGAGCAAATGCTGAAGGAGTTCCAAAACGTCTAACCTTCGACGAAATTCAAAGCAAGACATACATGGAAGTAAAGGGAACTGGAACTGCTAACCAGTGCCCTACGATAGAAGGAGGTGTTGCCAGCTTTGCCTTCAAGCCAGGCAAATACAATGCCAAGAAATTCTGCTTAGAGCCCACATCATTCACAGTCAAGGCAGAGAGTGTGAACAAGAATGCACCCCCAGATTTCCAGAAAACCAAGCTCATGACACGCTTAACCTACACCCTTGATGAGATTGAGGGACCATTCGAAGTGTCTTCTGATGGCACTGTTAAGTTTGAGGAGAAGGATGGAATTGATTATGCTGCTGTTACAGTTCAGCTTCCTGGTGGTGAGCGTGTGCCCTTCCTCTTCACTATCAAACAGCTAGTGGCAAGCGGCAAACCAGAAAGCTTTAGCGGTGAATTCCTTGTGCCATCATACAGAGGTTCATCCTTCCTTGACCCAAAGGGACGGGGTGGATCTACTGGCTATGACAACGCTGTTGCATTGCCTGCTGGAGGGAGAGGAGACGAGGAGGAGCTTGAGAAGGAGAACGTAAAGAATACTGCATCTTCTACAGGAAAGATCACCCTGAGTGTTACCCAGTGCAAGCCAGAGACCGGTGAGGTCATTGGAGTATTTGAGAGCATCCAGCCATCTGATACTGATCTCGGTGCAAAGGTCCCCAAGGATGTGAAAATCCAGGGTATCTGGTATGCCCAACTTGAATGA。

对NtOEP1基因进行分析后，可知其编码332个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

MAASLQAAATLMQPTKVGVAPARNNLQLRSAQSVSKAFGVEPAAARLTCSLQTELKDLAQKCTDAAKVAGFALATSALVVSGANAEGVPKRLTFDEIQSKTYMEVKGTGTANQCPTIEGGVASFAFKPGKYNAKKFCLEPTSFTVKAESVNKNAPPDFQKTKLMTRLTYTLDEIEGPFEVSSDGTVKFEEKDGIDYAAVTVQLPGGERVPFLFTIKQLVASGKPESFSGEFLVPSYRGSSFLDPKGRGGSTGYDNAVALPAGGRGDEEELEKENVKNTASSTGKITLSVTQCKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKVPKDVKIQGIWYAQLE。

实施例2

利用实施例1中所获得影响烟草色素含量的NtOEP1基因，发明人进一步构建了基因沉默用VIGS干涉载体TRV2-NtOEP1，相关构建过程简要介绍如下。

（1）目的片段的获得

选择NTOEP1基因中较特异的一段核酸片段（序列表SEQ ID NO.1的第153-522位核苷酸序列）为VIGS 的引导序列，设计引物并以实施1所获得的cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因片段。

NtOEP1基因沉默载体构建时，PCR扩增所用引物序列设计如下：

NtOEP1-VI-F: 5'- TCGACGACAAGACCCTGCAGGCAAACTGAACTCAAGGACT -3'，

NtOEP1-VI-R: 5'- TGAGGAGAAGAGCCCTGCAGAATCTCATCAAGGGTGTAGG-3'；

相关扩增体系、及扩增程序参考实施例1即可，最终扩增片段长度为370 bp。

（2）酶切、连接

利用限制性内切酶Pst I对TRV2-LIC质粒进行单酶切，然后利用Infusion连接酶将TRV2-LIC的单酶切产物和步骤（1）中的PCR扩增片段进行连接，10 μl处理体系设计如下：

2 x Infusion连接酶，2 μl；

TRV2-LIC单酶切片段，2 μl

PCR扩增片段，6 μl；

50℃，15 min，随后放冰上1-2 min。

（3）转化、筛选

将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含有卡那霉素（50 mg/L）的LB培养基上涂布，37℃过夜倒置培养进行筛选以形成单菌落，进一步测序鉴定后，确定重组正确的即为干涉用TRV2-NtOEP1重组载体。

实施例3

在实施例2基础上，发明人进一步利用农杆菌介导的转基因体系，筛选获得了NtOEP1基因沉默的转基因植株，结合植株表型以对NtOEP1基因功能进行进一步分析。具体过程简要介绍如下。

（1）转化农杆菌、并制备侵染液

将实施例2中所制备TRV2-NtOEP1重组载体转化GV3301农杆菌感受态细胞后，涂布LB平板（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平），28℃倒置黑暗培养2-3天，挑取单菌落，并利用菌落PCR筛选携带NtOEP1基因片段的农杆菌单克隆；

作为对照，分别将TRV1、TRV2-LIC、TRV2-PDS 也进行了农杆菌转化。

分别将含有TRV1、TRV2-LIC、TRV2-NtOEP1、TRV2-PDS 农杆菌单菌落接入5 ml LB培养基中 (含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平)，28℃、180 r/min 过夜振荡培养至 OD约为1.0；再转接入到30 ml LB液体培养基中继续培养，28℃过夜振荡培养至 OD 约为2.0；

3900 r/min 离心 15 min 收集农杆菌到50 ml离心管中，弃上清，向各菌体中加入注射缓冲液（10 mM的MES，10 mM的 MgCl₂，250 μM的乙酰丁香酮），调OD值约为1.0，室温放置3-6小时；

再向TRV2-LIC、TRV2-NtOEP1、TRV2-PDS悬浮液中等体积加入TRV1悬浮液，混匀后，即可作为侵染液。

（2）植株侵染

选取生长4周左右的本氏烟草幼苗（事先将烟草种子播种于育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm × 10cm）中，于22℃，16 h 光照/8 h 黑暗条件下生长培养），分组后，挑选长势一致、约4-5片叶子的烟草植株，用1ml 无针头无菌注射器通过压滤法把含有不同TRV重组质粒的农杆菌悬浮液从叶片背面压入全部展开的叶片中，使菌液充满整个叶片，于 22℃，75% 空气湿度中培养。

接种2周后，采集叶片并提取RNA，利用实时PCR检测基因沉默效率，同时利用高效液相色谱法测量烟草叶片色素类物质含量。

基因沉默后基因表达量检测结果如图1所示，部分表型结果如图2所示。具体色素含量检测情况如下表所（单位：μg/g）示：

。

综合分析可以看出，病毒诱导沉默的TRV2-NtOEP1植株中NtOEP1基因的表达水平仅为对照的15%左右（图1），说明沉默效果显著。八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是影响类胡萝卜素合成的限速酶之一，烟草沉默该基因后会造成叶片失绿、漂白表型，目前该基因也被用来作为检测沉默效率的标志基因。阳性对照TRV2-PDS新生叶片完全漂白，新生叶片完全失绿，说明我们这批注射得到的结果是真实可靠的（图2）。NtOEP1基因沉默后，新生的叶片呈现浅黄色，失绿表型明显，而阴性对照TRV2-LIC空载体对照植株新生叶片与未注射植株表型相同。另外，病毒诱导沉默的TRV2-NtOEP1植株中新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β胡萝卜素含量与对照植株相比显著下降（表1），说明NtOEP1基因与烟草色素含量相关。这些实验结果表明，通过病毒诱导的基因沉默的方法，可明显调整烟叶中的色素含量。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 影响烟草色素含量的NtOEP1基因及其应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atggctgcct ctctacaagc agctgctact ctaatgcaac caacaaaggt tggtgttgcc 60

ccagctagaa acaacctgca gttgaggtct gctcaaagtg tgagcaaagc atttggtgtt 120

gaaccagctg cagctaggct tacttgctct ttgcaaactg aactcaagga cttggctcaa 180

aagtgcactg atgctgccaa ggttgctggt tttgctctgg ccacttctgc ccttgtcgtc 240

tcaggagcaa atgctgaagg agttccaaaa cgtctaacct tcgacgaaat tcaaagcaag 300

acatacatgg aagtaaaggg aactggaact gctaaccagt gccctacgat agaaggaggt 360

gttgccagct ttgccttcaa gccaggcaaa tacaatgcca agaaattctg cttagagccc 420

acatcattca cagtcaaggc agagagtgtg aacaagaatg cacccccaga tttccagaaa 480

accaagctca tgacacgctt aacctacacc cttgatgaga ttgagggacc attcgaagtg 540

tcttctgatg gcactgttaa gtttgaggag aaggatggaa ttgattatgc tgctgttaca 600

gttcagcttc ctggtggtga gcgtgtgccc ttcctcttca ctatcaaaca gctagtggca 660

agcggcaaac cagaaagctt tagcggtgaa ttccttgtgc catcatacag aggttcatcc 720

ttccttgacc caaagggacg gggtggatct actggctatg acaacgctgt tgcattgcct 780

gctggaggga gaggagacga ggaggagctt gagaaggaga acgtaaagaa tactgcatct 840

tctacaggaa agatcaccct gagtgttacc cagtgcaagc cagagaccgg tgaggtcatt 900

ggagtatttg agagcatcca gccatctgat actgatctcg gtgcaaaggt ccccaaggat 960

gtgaaaatcc agggtatctg gtatgcccaa cttgaatga 999

<210> 2

<211> 332

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Ala Ala Ser Leu Gln Ala Ala Ala Thr Leu Met Gln Pro Thr Lys

1 5 10 15

Val Gly Val Ala Pro Ala Arg Asn Asn Leu Gln Leu Arg Ser Ala Gln

20 25 30

Ser Val Ser Lys Ala Phe Gly Val Glu Pro Ala Ala Ala Arg Leu Thr

35 40 45

Cys Ser Leu Gln Thr Glu Leu Lys Asp Leu Ala Gln Lys Cys Thr Asp

50 55 60

Ala Ala Lys Val Ala Gly Phe Ala Leu Ala Thr Ser Ala Leu Val Val

65 70 75 80

Ser Gly Ala Asn Ala Glu Gly Val Pro Lys Arg Leu Thr Phe Asp Glu

85 90 95

Ile Gln Ser Lys Thr Tyr Met Glu Val Lys Gly Thr Gly Thr Ala Asn

100 105 110

Gln Cys Pro Thr Ile Glu Gly Gly Val Ala Ser Phe Ala Phe Lys Pro

115 120 125

Gly Lys Tyr Asn Ala Lys Lys Phe Cys Leu Glu Pro Thr Ser Phe Thr

130 135 140

Val Lys Ala Glu Ser Val Asn Lys Asn Ala Pro Pro Asp Phe Gln Lys

145 150 155 160

Thr Lys Leu Met Thr Arg Leu Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Ile Glu Gly

165 170 175

Pro Phe Glu Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Lys Phe Glu Glu Lys Asp

180 185 190

Gly Ile Asp Tyr Ala Ala Val Thr Val Gln Leu Pro Gly Gly Glu Arg

195 200 205

Val Pro Phe Leu Phe Thr Ile Lys Gln Leu Val Ala Ser Gly Lys Pro

210 215 220

Glu Ser Phe Ser Gly Glu Phe Leu Val Pro Ser Tyr Arg Gly Ser Ser

225 230 235 240

Phe Leu Asp Pro Lys Gly Arg Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Asp Asn Ala

245 250 255

Val Ala Leu Pro Ala Gly Gly Arg Gly Asp Glu Glu Glu Leu Glu Lys

260 265 270

Glu Asn Val Lys Asn Thr Ala Ser Ser Thr Gly Lys Ile Thr Leu Ser

275 280 285

Val Thr Gln Cys Lys Pro Glu Thr Gly Glu Val Ile Gly Val Phe Glu

290 295 300

Ser Ile Gln Pro Ser Asp Thr Asp Leu Gly Ala Lys Val Pro Lys Asp

305 310 315 320

Val Lys Ile Gln Gly Ile Trp Tyr Ala Gln Leu Glu

325 330

Claims

1.影响烟草色素含量的NtOEP1基因在烟草叶片色素含量调控中的应用，其特征在于，利用基因沉默技术，通过下调NtOEP1基因表达量，来降低烟草叶片中色素类物质含量；

所述影响烟草色素含量的NtOEP1基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

所述色素类物质指：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β胡萝卜素。

2.如权利要求1所述影响烟草色素含量的NtOEP1基因在烟草叶片色素含量调控中的应用，其特征在于，PCR扩增制备影响烟草色素含量的NtOEP1基因时，如下步骤制备获得：

（1）提取烟草样品基因组，并反转录为cDNA备用；

NtOEP1-F: 5'- ATGGCTGCCTCTCTACAAGC -3'，

NtOEP1-R: 5'- TCATTCAAGTTGGGCATACC -3'。

3.如权利要求1所述影响烟草色素含量的NtOEP1基因在烟草叶片色素含量调控中的应用，其特征在于，沉默影响烟草色素含量的NtOEP1基因时，采用沉默载体TRV2-NtOEP1进行基因沉默，所述沉默载体TRV2-NtOEP1，通过如下步骤构建获得：

（1）PCR扩增

以NtOEP1基因中第153-522位核苷酸作为VIGS的引导序列，设计扩增用引物序列如下：

NtOEP1-VI-F: 5'- TCGACGACAAGACCCTGCAGGCAAACTGAACTCAAGGACT -3'，

NtOEP1-VI-R: 5'- TGAGGAGAAGAGCCCTGCAGAATCTCATCAAGGGTGTAGG-3'；

所述引物序列中，F引物5’端的“TCGACGACAAGACCCTGCAG”序列、R引物5’端的“TGAGGAGAAGAGCCCTGCAG”序列为TRV2-LIC载体的接头序列；

（2）酶切、连接

利用限制性内切酶PstI对TRV2-LIC质粒进行单酶切，然后利用Infusion连接酶将TRV2-LIC的单酶切产物和步骤（1）中的PCR扩增片段进行连接；

（3）转化、筛选

将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含有卡那霉素的LB培养基上涂布，37℃过夜倒置培养进行筛选以形成单菌落，进一步鉴定后，确定重组正确单克隆即为干涉用TRV2-NtOEP1重组载体。

4.影响烟草色素含量的NtOEP1基因所编码蛋白在烟草叶片色素类物质含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与烟草叶片中色素类物质含量相关，降低该蛋白表达量后，烟草叶片中色素类物质含量明显降低；

所述影响烟草色素含量的NtOEP1基因所编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

5.利用影响烟草色素含量的NtOEP1基因的烟草新品种培育方法，其特征在于，通过转基因技术、瞬时表达技术，沉默或敲除NtOEP1基因，获得色素含量下调的烟草转化植株新品种；

所述色素指：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β胡萝卜素。