CN110592167A - 一种马齿苋多肽提取物及其制备方法 - Google Patents

一种马齿苋多肽提取物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种马齿苋多肽提取物及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：(1)取干燥后的马齿苋药材，粉碎成粗粉，加入石油醚回流提取，过滤，溶剂挥干；(2)加入水，加入中性蛋白酶，温浸提取，用碱溶液调节pH至9～10，再向其中添加碱性蛋白酶，温浸提取，煮沸灭酶，滤布过滤，减压浓缩，离心保留上清液；(3)将上清液过D101大孔树脂，收集下柱液，用水洗柱，收集水洗液，合并下柱液与水洗液，减压浓缩；(4)加入乙醇，静置后抽滤，减压补水浓缩至无醇；(5)使用截留分子量为2kDa的透析袋，室温下透析，减压浓缩后真空干燥粉碎即得马齿苋多肽提取物。本发明制备的马齿苋多肽提取物蛋白提取率≥53.5％，蛋白含量≥73.8％，且多肽分子量≤2kDa的占比≥92.7％。

Description

一种马齿苋多肽提取物及其制备方法
技术领域
本发明属于植物提取领域，具体涉及一种马齿苋多肽提取物及其制备方法。
背景技术
马齿苋又名长寿菜，为马齿苋科植物全草，多以其干燥地上部分入药，生于山区潮湿肥沃的地方，遍布全国。味酸，性寒。归肝、大肠经，具有清热解毒、凉血止血、止痢之功效，用于热毒血痢、痈肿疗疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血和崩漏下血。近年的药理研究表明，马齿苋具有降血脂、降血糖、抗动脉粥样硬化等功效。
马齿苋中含有多种营养、化学成分，具有丰富的营养价值和特殊的医疗保健作用。据测定，每100g鲜马齿苋中，蛋白质2.3g，脂肪0.5g，碳水化合物3g，粗纤维0.7g，VC为23mg，VE12.2mg，尼克酸0.7mg，胡萝卜素2.23mg，还含有α-亚麻酸300～400mg和苹果酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等人体所需的18种氨基酸(其中8种为人体必需氨基酸)，维生素A、B、D以及无机盐。马齿苋既可入药，又可食用，还可用于化妆品原料，是我国***划定的101种药食同源的野生植物之一。
多肽相对于蛋白质，分子量较低，利于人体的吸收，且很多研究表明，植物来源的水解多肽具有多种特殊的生物活性，应用前景广阔。
现有技术CN108276472A使用纯水、95％乙醇溶液、磷酸缓冲液、超声波发生器磷酸缓冲液提取的方法提取马齿苋中的硒蛋白，其中超声波发生器磷酸缓冲液硒蛋白提取率最高为60.24％；该工艺对设备的要求较高，难以应用至大规模生产中，且提取物中多为高分子量的蛋白，产品应用范围有限。
现有技术CN103554237A使用NaCl溶液提取，超滤器进行浓缩和脱盐，再用无水乙醇沉淀，最后冻干获得马齿苋活性糖蛋白；该工艺使用超滤器对马齿苋提取中的蛋白进行纯化，提取物中的蛋白未进行水解，蛋白分子量较大，而且纯化效果不够，最终产品的蛋白纯度较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种马齿苋多肽提取物及其制备方法。本发明制备的马齿苋多肽提取物蛋白提取率≥53.5％，蛋白含量≥73.8％，且多肽分子量≤2kDa的占比≥92.7％。本发明具有工艺简单，易于操作、多肽分子量低等优点，同时本发明所述工艺易于工业化生产。
本发明解决上述技术问题所采用的技术手段为：
一种马齿苋多肽提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)脱脂：取干燥后的马齿苋药材，粉碎成粗粉，加入药材8～10倍量的石油醚回流提取2～3h，所述石油醚的沸程为60～90℃，过滤，将滤渣中的溶剂挥干，得石油醚脱脂后的药材；
(2)提取浓缩：向石油醚脱脂后的药材中加入水，加入药材量0.3～0.5％的中性蛋白酶，温浸提取；温浸结束后，用碱溶液将提取溶液调节pH至9～10，再向其中添加药材量的0.3～0.5％的碱性蛋白酶，温浸提取；温浸结束后，煮沸灭酶，滤布过滤，减压浓缩，并使用酸溶液将浓缩液pH调节至中性，离心保留上清液；
(3)D101纯化：将上清液过D101大孔树脂，所述D101大孔树脂的用量为药材量的1/10～1/8，收集下柱液，用水洗柱，收集水洗液，合并下柱液与水洗液，减压浓缩，得第一浓缩液；
(4)醇沉：向第一浓缩液中缓慢加入4～6倍量的90％～100％乙醇，边加边搅拌，2～6℃下静置2～5h后抽滤，抽滤液减压补水浓缩至无醇，得第二浓缩液；
(5)透析：在第二浓缩液中使用截留分子量为2kDa的透析袋，室温下透析5～10h，透析液减压浓缩后真空干燥粉碎即得马齿苋多肽提取物。
优选地，所述步骤(1)中，所述粗粉的目数为20～30目。
优选地，所述步骤(2)中，所述水的加入量为药材10～12倍量(v/m)。
优选地，所述步骤(2)中，所述中性蛋白酶为木瓜蛋白酶。
优选地，所述步骤(2)中，所述温浸提取的温度为45～60℃，时间为1.5～2h。
优选地，所述步骤(2)中，所述碱溶液为NaOH溶液。
优选地，所述步骤(2)中，所述煮沸灭酶的时间为10～30min。
优选地，所述步骤(2)中，所述滤布的目数为300目。
优选地，所述步骤(2)中，所述减压浓缩时的真空度-0.07～-0.09Mpa，温度60～80℃，浓缩液体积为药材量的1/3～1/2(v/m)。
优选地，所述步骤(2)中，所述酸溶液为HCl水溶液。
优选地，所述步骤(3)中，所述水的用量为1～1.5BV树脂体积。
优选地，所述步骤(3)中，所述减压浓缩至药材量的1/15～1/10(v/m)。
优选地，所述步骤(4)中，所述乙醇的浓度为95％。
优选地，所述步骤(4)中，所述浓缩的体积为药材量的1/15～1/10(v/m)。
一种马齿苋多肽提取物，采用如上所述制备方法制备得到。
上述技术方案中，所述步骤(1)中，所述石油醚的加入量为与药材量的体积质量比，即v/m。
上述技术方案中，所述步骤(2)中，所述中性蛋白酶的加入量为与药材量的质量比，即m/m。
上述技术方案中，所述步骤(2)中，所述碱性蛋白酶的加入量为与药材量的质量比，即m/m。
上述技术方案中，所述步骤(3)中，所述D101大孔树脂的用量为与药材量的质量比，即m/m。
上述技术方案中，所述步骤(4)中，所述乙醇的加入量为与第一浓缩液的体积比，即v/v。
本发明的基本原理：
马齿苋中含有较多的蛋白质，约占马齿苋植物干重的19.1％，提取前使用石油醚脱脂可将马齿苋中的脂溶性与小分子物质除去，更利于蛋白的提取；使用蛋白水解酶辅助提取的方法，可以促进蛋白水解成低分子量的多肽，从而促进多肽的溶出，提高提取率；使用非极性大孔树脂D101将非极性或部分弱极性的杂质吸附，多肽随着下柱液与水洗液流出；使用乙醇沉淀的方式，可以将大量的多糖类与醇不溶性物质沉淀下来，提高马齿苋多肽提取物的纯度；超滤可以将高分子量的物质与低分子量的多肽分离开来，获得纯度较高的低分子量的马齿苋多肽提取物。
本发明以干燥后的马齿苋为原料，使用石油醚(沸程60～90℃)回流进行脱脂，挥干溶剂后以加入一定量的中性蛋白酶的水溶液作为提取溶剂进行温浸提取，温浸结束后，调节溶液pH呈碱性，加入适量的碱性蛋白酶温浸提取，提取液煮沸灭酶后过滤；提取液过D101大孔树脂，并使用适量体积的水冲洗，收集合并下柱液与水洗液，合并后浓缩至一定体积，缓慢并搅拌加入一定量的95％乙醇，冰箱低温静置后抽滤，滤液浓缩至无醇后，使用一定截留分子量的透析袋进行透析，将透析液减压浓缩，真空干燥，即得到最终产品，蛋白提取率≥53.5％，蛋白含量≥73.8％，且多肽分子量≤2kDa的占比≥92.7％。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：
本发明制备的马齿苋多肽提取物蛋白提取率≥53.5％，蛋白含量≥73.8％，且多肽分子量≤2kDa的占比≥92.7％。本发明具有工艺简单，易于操作、多肽分子量低等优点，同时本发明所述工艺易于工业化生产。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
取干燥的马齿苋药材粉碎至30目粗粉，称取500g，加入5L的石油醚(沸程60～90℃)回流提取2h，过滤，将滤渣中的石油醚挥干；向脱脂后的药材加入5L的水，加入1.5g木瓜蛋白酶，50℃温浸2h；使用NaOH水溶液调节提取液pH至9，再加入1.5g的碱性蛋白酶，50℃温浸2h，煮沸20min灭酶，300目滤布过滤，提取液减压浓缩，真空度-0.07Mpa，温度65℃，浓缩至200ml，并使用HCl水溶液将浓缩液pH调节至中性，离心保留上清液；过50g D101大孔树脂柱，收集下柱液，使用80ml水洗，合并下柱液与水洗液。浓缩下柱液与水洗液至50ml，缓慢并搅拌加入200ml 95％乙醇，边加边搅拌，4℃静置3h，抽滤，保留上清液。上清液浓缩至无醇，加水定容至50ml，使用截留分子量为2kDa透析袋室温下透析10h，透析液减压浓缩，真空干燥后即得马齿苋多肽提取物产品。
检测计算后得马齿苋多肽提取物中蛋白提取率53.5％，蛋白质含量为75.4％，多肽分子量≤2kDa的占比为92.7％。
实施例2
取干燥的马齿苋药材粉碎至30目粗粉，称取500g，加入4L的石油醚(沸程60～90℃)回流提取3h，过滤，将滤渣中的石油醚挥干。向脱脂后的药材加入6L的水，加入2g木瓜蛋白酶，55℃温浸2h。使用NaOH水溶液调节提取液pH至10，再加入2g的碱性蛋白酶，55℃温浸2h，煮沸30min灭酶，300目滤布过滤，提取液减压浓缩，真空度-0.07Mpa，温度65℃，浓缩至250ml，并使用HCl水溶液将浓缩液pH调节至中性，离心保留上清液；过60g D101大孔树脂柱，收集下柱液，使用90ml水洗，合并下柱液与水洗液。浓缩下柱液与水洗液至40ml，缓慢并搅拌加入200ml 95％乙醇，边加边搅拌，4℃静置2h，抽滤，保留上清液。上清液浓缩至无醇，加水定容至40ml，使用截留分子量为2kDa透析袋室温下透析5h，透析液减压浓缩，真空干燥后即得马齿苋多肽提取物产品。
检测计算后得马齿苋多肽提取物中蛋白提取率56.2％，蛋白质含量为73.8％，多肽分子量≤2kDa的占比为94.1％。
实施例3
取干燥的马齿苋药材粉碎至30目粗粉，称取500g，加入5L的石油醚(沸程60～90℃)回流提取2h，过滤，将滤渣中的石油醚挥干。向脱脂后的药材加入6L的水，加入2.5g木瓜蛋白酶，55℃温浸1.5h。使用NaOH水溶液调节提取液pH至9.5，再加入2.5g的碱性蛋白酶，60℃温浸1.5h，煮沸20min灭酶，300目滤布过滤，提取液减压浓缩，真空度-0.07Mpa，温度65℃，浓缩至200ml，并使用HCl水溶液将浓缩液pH调节至中性，离心保留上清液；过50g D101大孔树脂柱，收集下柱液，使用80ml水洗，合并下柱液与水洗液。浓缩下柱液与水洗液至50ml，缓慢并搅拌加入300ml 95％乙醇，边加边搅拌，6℃静置4h，抽滤，保留上清液。上清液浓缩至无醇，加水定容至50ml，使用截留分子量为2kDa透析袋室温下透析8h，透析液减压浓缩，真空干燥后即得马齿苋多肽提取物产品。
检测计算后得马齿苋多肽提取物中蛋白提取率58.5％，蛋白质含量为78.3％，多肽分子量≤2kDa的占比为95.9％。
对比例1
取干燥的马齿苋药材粉碎至30目粗粉，称取500g，加入5L的95％乙醇回流提取2h，过滤，将滤渣中的乙醇挥干。向脱脂后的药材加入6L的水，加入2.5g木瓜蛋白酶，55℃温浸1.5h。使用NaOH水溶液调节提取液pH至9.5，再加入2.5g的碱性蛋白酶，60℃温浸1.5h，煮沸20min灭酶，300目滤布过滤，药渣用4L水回流提取1.5h，300目滤布过滤，提取液减压浓缩，真空度-0.07Mpa，温度65℃，浓缩至200ml，并使用HCl水溶液将浓缩液pH调节至中性，离心保留上清液；过50g AB-8大孔树脂柱，收集下柱液，使用100ml水洗，合并下柱液与水洗液。浓缩下柱液与水洗液至60ml，缓慢并搅拌加入350ml 95％乙醇，边加边搅拌，6℃静置4h，抽滤，保留上清液。上清液减压浓缩，真空干燥后即得产品。
检测计算后得马齿苋多肽提取物中蛋白提取率32.5％，蛋白质含量为43.9％，多肽分子量≤2kDa的占比为72.8％。
对比例2
取干燥的马齿苋药材粉碎至30目粗粉，称取500g，加入6L的水，使用NaOH水溶液调节提取液pH至9，再加入2.5g的碱性蛋白酶，60℃温浸2h，煮沸20min灭酶，300目滤布过滤，药渣用4L水回流提取1.5h，300目滤布过滤，提取液减压浓缩，真空度-0.07Mpa，温度65℃，浓缩至200ml，并使用HCl水溶液将浓缩液pH调节至中性，离心保留上清液；过60g活性炭(200目)柱，收集下柱液，使用100ml水洗，合并下柱液与水洗液。浓缩下柱液与水洗液至60ml，缓慢并搅拌加入200ml 95％乙醇，边加边搅拌，4℃静置2h，抽滤，保留上清液。上清液减压浓缩至60ml，使用截留分子量为3.5kDa透析袋室温下透析8h，透析液减压浓缩，真空干燥即得产品。
检测计算后得马齿苋多肽提取物中蛋白提取率36.5％，蛋白质含量为38.1％，多肽分子量≤2kDa的占比为64.8％。
对比例3
取干燥的马齿苋药材粉碎至30目粗粉，称取500g，加入5L的乙酸乙酯回流提取2h，过滤，将滤渣中的乙酸乙酯挥干。向脱脂后的药材加入6L的水，加入2.5g木瓜蛋白酶，55℃温浸1.5h。使用NaOH水溶液调节提取液pH至9.5，再加入2.5g的碱性蛋白酶，60℃温浸1.5h，煮沸20min灭酶，300目滤布过滤，提取液减压浓缩，真空度-0.07Mpa，温度65℃，浓缩至200ml，并使用HCl水溶液将浓缩液pH调节至中性，离心保留上清液；过50g D101大孔树脂柱，收集下柱液，使用80ml水洗，合并下柱液与水洗液。浓缩下柱液与水洗液至50ml，缓慢并搅拌加入300ml 95％乙醇，边加边搅拌，6℃静置4h，抽滤，保留上清液。上清液浓缩至无醇，加水定容至50ml，使用截留分子量为2kDa透析袋室温下透析8h，透析液减压浓缩，真空干燥后即得马齿苋多肽提取物产品。
检测计算后得马齿苋多肽提取物中蛋白提取率41.0％，蛋白质含量为53.7％，多肽分子量≤2kDa的占比为60.1％。
对比例4
取干燥的马齿苋药材粉碎至30目粗粉，称取500g，加入5L的石油醚(沸程60～90℃)回流提取2h，过滤，将滤渣中的石油醚挥干。向脱脂后的药材加入6L的水，加入2.5g木瓜蛋白酶，55℃温浸1.5h。使用NaOH水溶液调节提取液pH至9.5，再加入2.5g的碱性蛋白酶，60℃温浸1.5h，煮沸20min灭酶，300目滤布过滤，提取液减压浓缩，真空度-0.07Mpa，温度65℃，浓缩至200ml，并使用HCl水溶液将浓缩液pH调节至中性，离心保留上清液；过50g D101大孔树脂柱，收集下柱液，使用80ml水洗，合并下柱液与水洗液。浓缩下柱液与水洗液至50ml，缓慢并搅拌加入400ml 95％乙醇，边加边搅拌，6℃静置4h，抽滤，保留上清液。上清液浓缩至无醇，加水定容至50ml，使用截留分子量为2kDa透析袋室温下透析8h，透析液减压浓缩，真空干燥后即得马齿苋多肽提取物产品。
检测计算后得马齿苋多肽提取物中蛋白提取率43.1％，蛋白质含量为43.9％，多肽分子量≤2kDa的占比为55.3％。
效果实施例
一、马齿苋多肽提取物相关检测方法
蛋白质检测方法：测定方法依据GB 5009.5-2016
多肽分子量≤10kDa占比：测定方法依据GB 31645-2018
二、计算公式
蛋白提取率＝(蛋白质量/药材质量)×100％
实施例1～3及对比例1～4制得的马齿苋多肽提取物的指标如表1所示。
表1实施例1～3及对比例1～4制得的马齿苋多肽提取物的指标
案例 蛋白质含量％ 提取率％ 多肽分子量≤2kDa占比％
实施例1 53.5 75.4 92.7
实施例2 56.2 73.8 94.1
实施例3 58.5 78.3 95.9
对比例1 32.5 43.9 72.8
对比例2 36.5 38.1 64.8
对比例3 41.0 53.7 60.1
对比例4 43.1 43.9 55.3
本发明以马齿苋为原料，经脱脂、酶解、大孔树脂纯化、醇沉、透析后的马齿苋多肽提取物中蛋白提取率≥53.5％，蛋白质含量≥73.8％，且多肽分子量≤2kDa的占比≥92.7％。该工艺操作简单、提取率高、蛋白纯度高、多肽分子量低等优点；同时，本发明所述的工艺易于工业化生产。
上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种马齿苋多肽提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)脱脂：取干燥后的马齿苋药材，粉碎成粗粉，加入药材8～10倍量的石油醚回流提取2～3h，所述石油醚的沸程为60～90℃，过滤，将滤渣中的溶剂挥干，得石油醚脱脂后的药材；
(2)提取浓缩：向石油醚脱脂后的药材中加入水，加入药材量0.3～0.5％的中性蛋白酶，温浸提取；温浸结束后，用碱溶液将提取溶液调节pH至9～10，再向其中添加药材量的0.3～0.5％的碱性蛋白酶，温浸提取；温浸结束后，煮沸灭酶，滤布过滤，减压浓缩，并使用酸溶液将浓缩液pH调节至中性，离心保留上清液；
(3)D101纯化：将上清液过D101大孔树脂，所述D101大孔树脂的用量为药材量的1/10～1/8，收集下柱液，用水洗柱，收集水洗液，合并下柱液与水洗液，减压浓缩，得第一浓缩液；
(4)醇沉：向第一浓缩液中缓慢加入4～6倍量的90％～100％乙醇，边加边搅拌，2～6℃下静置2～5h后抽滤，抽滤液减压补水浓缩至无醇，得第二浓缩液；
(5)透析：在第二浓缩液中使用截留分子量为2kDa的透析袋，室温下透析5～10h，透析液减压浓缩后真空干燥粉碎即得马齿苋多肽提取物。
2.如权利要求1所述的一种马齿苋多肽提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述水的加入量为药材10～12倍量。
3.如权利要求1所述的一种马齿苋多肽提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述中性蛋白酶为木瓜蛋白酶。
4.如权利要求1所述的一种马齿苋多肽提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述温浸提取的温度为45～60℃，时间为1.5～2h。
5.如权利要求1所述的一种马齿苋多肽提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述煮沸灭酶的时间为10～30min。
6.如权利要求1所述的一种马齿苋多肽提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述减压浓缩时的真空度-0.07～-0.09Mpa，温度60～80℃，浓缩液体积为药材量的1/3～1/2。
7.如权利要求1所述的一种马齿苋多肽提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述水的用量为1～1.5BV树脂体积。
8.如权利要求1所述的一种马齿苋多肽提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述减压浓缩至药材量的1/15～1/10。
9.如权利要求1所述的一种马齿苋多肽提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述浓缩的体积为药材量的1/15～1/10。
10.一种马齿苋多肽提取物，其特征在于，采用如权利要求1～9任意一种马齿苋多肽提取物的制备方法制备得到。
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