CN110002919A - 一种黄腐酸螯合锌生物肥及其在核桃种植中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种黄腐酸螯合锌生物肥及其在核桃种植中的应用。本发明通过利用混合菌剂与黄腐酸螯合锌溶液相融合制备黄腐酸螯合锌生物肥，腐酸螯合锌肥在核桃叶面施用后微生物迅速大量繁殖，能够降解农药化肥残留，消除重金属污染，黄腐酸螯合锌生物肥利用了黄腐酸的强络合能力与锌离子螯合，更有利于核桃叶片的吸收，提高锌肥的利用率，提高核桃产品品质，降低农药残留，核桃果仁中锌含量较高，实现核桃富锌提升保健功效的目的。

Description

一种黄腐酸螯合锌生物肥及其在核桃种植中的应用
技术领域
本发明涉及化肥领域，具体地说，本发明涉及黄腐酸螯合锌生物肥及其在核桃种植中的应用的技术领域。
背景技术
核桃(Juglans regiaL.)是重要木本油料树种，具有较高的经济、生态和社会效益，近年来随着国家对木本油料产业的大力扶持，市场需求逐渐增加，核桃的栽培面积不断扩大。水肥管理是实现核桃丰产的关键性因素，科学施肥是提高核桃产量相对简单有效的途径，叶片中的营养元素含量，能够反映树体对各种营养成分的需求利用情况，对叶片中营养元素进行动态分析，可以作为施肥的一种依据。叶片不仅提供果实生长发育所需的矿质营养，同时可以将土壤提供的矿质养分储藏起来。随着叶面肥的研究应用，肥料类型不断丰富更新，叶面肥料及其施用效果取得了巨大进展，目前，国内学者有关叶面施肥对核桃的影响研究报道甚少，且主要集中在核桃幼树喷施、不同时期相应浓度喷施对比生长效果等方面。
锌是人体必需的微量元素之一，锌是人体生长发育、生殖遗传、免疫内分泌、神经、体液等重要生理过程中必不可少的物质，缺锌会对人体的各***产生不利影响。粮食、水果、作物等锌来源主要是化肥，化肥中补锌是个间接提高人体锌含量重要途径。以往解决锌营养不良问题的3种主要策略是，一是药剂补充，如市场上销售葡萄糖酸锌口服液等，药剂补充对迅速提高营养缺乏个体的营养状况是很有用的，但花费较大，人们对其可接受性差；二是强化食品，如将锌元素以添加剂的形式加入到成熟大米中，强化食品通常也要增加投入，而且会使食品的观感及风味改变，不易被接受，同时，营养强化食品的安全性也不容忽视；三是饮食多样化，增加肉制品、海产品等食物的摄入。
通过栽培途径，提高作物可食用部分的锌含量，在不改变日常饮食的情况下，可以长期稳定地通过富锌食品来提供人们所需的微量营养。目前，对于富锌核桃栽培的研究报道甚少。
发明内容
针对现有技术中未见有关在核桃种植过程中通过施用黄腐酸螯合锌生物肥来提高核桃可食部分锌含量的技术现状，本发明旨在提供一种黄腐酸螯合锌生物肥及其在核桃种植中的应用。本发明通过利用混合菌剂与黄腐酸螯合锌溶液相融合制备黄腐酸螯合锌生物肥，黄腐酸螯合锌生物肥在核桃叶面施用后微生物迅速大量繁殖，能够降解农药化肥残留，消除重金属污染，黄腐酸螯合锌生物肥利用了黄腐酸的强络合能力与锌离子螯合，更有利于核桃叶片的吸收，提高锌肥的利用率，提高核桃产品品质，降低农药残留，核桃果仁中锌含量较高，实现核桃富锌提升保健功效的目的。
本发明采用主要的技术方案：
本发明具体提供一种黄腐酸螯合锌生物肥的制备方法，具体制备方法步骤如下：
(1)黄腐酸螯合锌溶液制备：按照重量份数比计，将生化黄腐酸1-2份，硫酸锌4-6份，磷酸二氢钾9-11份，水45-55份混合均匀，投入到一级反应釜中，调整pH6.0-7.0，反应温度为30-40℃，反应时间为40-60min，一级反应结束后转入二级反应釜中，反应温度为50-70℃，反应时间为20-30min，二级反应结束后转入三级反应釜中，反应温度为75-85℃，反应时间为15-25min，经过三级反应釜的螯合反应，获得黄腐酸螯合锌溶液；
(2)混合菌剂制备：选用短小芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、红假单胞菌、阿维链霉菌和酵母菌进行混合，制备获得混合菌剂，检测活菌数达到8.6×1010cfu/ml；
(3)黄腐酸螯合锌生物肥的制备：按照重量份数比计，将步骤(1)制备的黄腐酸螯合锌溶液6-8份和步骤(2)制备的混合菌剂1-2份，混合均匀后，制得螯合锌肥混合液，按重量百分比计，向螯合锌肥混合液中加入1-3％黄原胶、1-2％甲壳素，起到菌体悬浮和保水作用，混合搅拌均匀，制备获得黄腐酸螯合锌生物肥。
优选的，本发明，所述黄腐酸螯合锌溶液制备，按照重量份数比计，将生化黄腐酸1份，硫酸锌5份，磷酸二氢钾10份，水60份混合均匀，投入到一级反应釜中，调整pH 6.0，反应温度为35℃，反应时间为50min，一级反应结束后转入二级反应釜中，反应温度为60℃，反应时间为25min，二级反应结束后转入三级反应釜中，反应温度为80℃，反应时间为20min，经过三级反应釜的螯合反应，获得黄腐酸螯合锌溶液。
优选的，本发明，所述混合菌剂制备，按照体积比计，选用短小芽孢杆菌：红假单胞菌：甲基营养型芽孢杆菌：阿维链霉菌：酵母菌＝4:5:5:2:4，进行混合，制备获得混合菌剂，检测活菌数达到8.6×1010cfu/ml。
优选的，本发明，所述黄腐酸螯合锌生物肥，按照重量份数比计，将黄腐酸螯合锌溶液7份和混合菌剂1份，混合均匀后，制得螯合锌肥混合液，按重量百分比计，向螯合锌肥混合液中加入2％黄原胶、1.5％甲壳素，起到菌体悬浮和保水作用，混合搅拌均匀，制备获得黄腐酸螯合锌生物肥。
本发明，所述生化黄腐酸，具体制备方法步骤如下：
(1)原料处理：按照重量份数比计，将秸秆11-13份、麸皮4-6份、木屑2-4份、核桃青皮2-4份、薄皮核桃壳1-2份、尿素1-2份，混合均匀，机械破碎，后加入清水30-40份混合，获得混合原料；
(2)第一阶段发酵：按重量百分比计，向步骤(1)获得的混合原料中，加入第一阶段发酵混合菌剂5％，当料温上升至65℃以上时，维持48h，期间翻拌2次，获得第一阶段发酵物；
(3)第二阶段发酵：按重量百分比计，向步骤(2)获得的第一阶段发酵物中，加入步骤(1)制备的加入混合原料20％，和第二阶段发酵混合菌剂5％，混合均匀发酵96h，期间翻拌4次，获得第二阶段发酵物；
(4)生化黄腐酸的制备：将步骤(3)制备的第二阶段发酵物挤压过滤得到的悬浮液，经浓缩精制，可得到浓度为65％的生化黄腐酸。
本发明，所述第一阶段发酵混合菌剂，按照体积比计，链嗜酸菌：短小芽孢杆菌：白腐菌：热纤维梭菌＝1:2:1:1。
本发明，所述第二阶段发酵混合菌剂，按照体积比计，枯草芽孢杆菌：黑曲霉：木霉菌＝2:2:1。
优选的，本发明，所述生化黄腐酸原料，按照重量份数比计，将秸秆12份、麸皮5份、木屑3份、核桃青皮3份、薄皮核桃壳1份、尿素1份，混合均匀，机械破碎，后加入清水35份混合，获得混合原料。
本发明，所述短小芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、红假单胞菌、阿维链霉菌、酵母菌、白腐菌、热纤维梭菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和木霉菌，其发酵液检测活菌数均不低于1×109cfu/ml。
进一步，本发明提供应用上述一种黄腐酸螯合锌生物肥在核桃种植中的应用。
通过利用短小芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、红假单胞菌、阿维链霉菌、酵母菌五种菌相配伍的混合菌剂与黄腐酸螯合锌溶液相混合制备的黄腐酸螯合锌生物肥，以及利用链嗜酸菌、短小芽孢杆菌、白腐菌、热纤维梭菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、木霉菌7种菌相配伍发酵黄腐酸混合原料制备的生化黄腐酸中，微生物菌种的特异性和复杂性，将各种不同的菌种能够复合配伍使用，考虑复合菌种的安全性，特别是应用于制备生化黄腐酸和制备中黄腐酸螯合锌生物肥都需要大量的基础实验验证，本发明基于前期基础研究积累，通过采用大量不同的菌种复配试验，证明本发明采用混合菌种与黄腐酸螯合锌溶液混合制备的黄腐酸螯合锌生物肥，应用于核桃种植中，在核桃叶面施用后微生物迅速大量繁殖，能够降解农药化肥残留，消除重金属污染，黄腐酸螯合锌生物肥利用了黄腐酸的强络合能力与锌离子螯合，更有利于核桃叶片的吸收，提高锌肥的利用率，提高核桃产品品质，降低农药残留，核桃果仁中锌含量较高，实现核桃富锌提升保健功效的目的。
本发明中，选用的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、酵母菌(saccharomyce)、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、阿维链霉菌(Streptomyces avermit ilis)、链嗜酸菌(Streptacidiphilus)、热纤维梭菌(Clostridium the rmocellum)、白腐菌(Phanerochaetc chrysosporium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉(Aspergillus)、木霉菌(Trichodermaspp.)十一种菌都为常见的公众熟知菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道购买获得，十一种菌的培养条件及培养基都可采用本领域常见报道获得。
本发明重点是通过实验证明采用此十一种菌按照本发明提供的技术方案进行复配，制备生化黄腐酸，或与黄腐酸螯合锌溶液相融合，再与菌体悬浮剂和保水剂混合，采用特定的配伍及制备工艺，制备获得黄腐酸螯合锌生物肥，虽然此十一种菌为常见的公众熟知菌种，但现有技术中未提供这十一种菌种进行复配，制备获得黄腐酸螯合锌生物肥，解决在核桃种植中使用，提高核桃可食部分硒含量，提高核桃产品品质，实现核桃富锌高产目的；而本发明利用微生物菌种的特异性和复杂性，将各种不同的菌种能够复合配伍使用，通过各种菌种的相融性、配伍性与各菌种属性结合，考虑的复合菌种的安全性与其他肥料的复配性需求，在黄腐酸螯合锌溶液和混合菌剂的制备中创造性的通过实验证实的工艺，制备的黄腐酸螯合锌生物肥具有显著增加核桃可食部分锌含量功效，核桃种植应用中获得显著突出的技术效果。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到具体以下有益效果：
(1)本发明制备的一种黄腐酸螯合锌生物肥，通过黄腐酸螯合锌溶液与混合菌剂混合制备的黄腐酸螯合锌生物肥，坐果期喷施于核桃叶叶片正、反面上，黄腐酸螯合锌生物肥1.5kg/亩喷施后核桃果实中锌含量为2.96mg/kg，与对照相比，核桃果实中锌含量提高44.6％，与市售土施肥料相比，核桃果实中锌含量提高37.5％，与市售喷施叶面肥相比，核桃果实中锌含量提高28.7％，黄腐酸螯合锌生物肥利用了黄腐酸的强络合能力与锌离子螯合，更有利于核桃叶片的吸收，提高锌肥的利用率，提高核桃产品品质，降低农药残留，核桃果仁中锌含量较高，实现核桃富锌提升保健功效的目的，获得良好的技术效果，具有广泛而现实的价值。
(2)本发明制备的一种黄腐酸螯合锌生物肥，其混合菌剂由短小芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、红假单胞菌、阿维链霉菌和酵母菌五种菌相配伍，检测活菌数达到8.6×1010cfu/ml，当腐酸螯合锌肥在核桃叶面施用后肥料中的微生物迅速大量繁殖，能够降解农药化肥残留，消除重金属污染，间接提高核桃叶面对锌元素吸收的积极作用。
(3)本发明制备的一种黄腐酸螯合锌生物肥，制备过程中通过添加黄原胶和甲壳素，起到菌体悬浮和保水作用，施用后在叶片可流延成膜，一方面利于黄腐酸螯合锌生物肥在叶面上长时间的保持，另一方面通过空气流动增加叶片吸收及吸附尘埃的能力，用于植物生长全周期叶片的保护。
(4)本发明制备的一种黄腐酸螯合锌生物肥，其生化黄腐酸由链嗜酸菌、短小芽孢杆菌、白腐菌、热纤维梭菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、木霉菌分批次的投入混合原料中发酵，制备的生化黄腐酸的黄腐酸含量为65％，调节pH为6.0，易于和硫酸锌、磷酸二氢钾进行螯合，制备的生化黄腐酸可直接为核桃作物提供丰富的有机肥料，为微生物提供有效载体和营养物质，使桃专用黄腐酸螯合锌生物肥中的养分稳定释放，提高核桃可食部分锌含量，改善核桃品质。
附图说明
无
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
实施例一：黄腐酸螯合锌生物肥的制备
本发明具体提供一种黄腐酸螯合锌生物肥的制备方法，具体制备方法步骤如下：
(1)黄腐酸螯合锌溶液制备：按照重量份数比计，将生化黄腐酸1-2份，硫酸锌4-6份，磷酸二氢钾9-11份，水45-55份混合均匀，投入到一级反应釜中，调整pH6.0-7.0，反应温度为30-40℃，反应时间为40-60min，一级反应结束后转入二级反应釜中，反应温度为50-70℃，反应时间为20-30min，二级反应结束后转入三级反应釜中，反应温度为75-85℃，反应时间为15-25min，经过三级反应釜的螯合反应，获得黄腐酸螯合锌溶液；
(2)混合菌剂制备：选用短小芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、红假单胞菌、阿维链霉菌和酵母菌进行混合，制备获得混合菌剂，检测活菌数达到8.6×1010cfu/ml；
(3)黄腐酸螯合锌生物肥的制备：按照重量份数比计，将步骤(1)制备的黄腐酸螯合锌溶液6-8份和步骤(2)制备的混合菌剂1-2份，混合均匀后，制得螯合锌肥混合液，按重量百分比计，向螯合锌肥混合液中加入1-3％黄原胶、1-2％甲壳素，起到菌体悬浮和保水作用，混合搅拌均匀，制备获得黄腐酸螯合锌生物肥。
优选的，本发明，所述黄腐酸螯合锌溶液制备，按照重量份数比计，将生化黄腐酸1份，硫酸锌5份，磷酸二氢钾10份，水60份混合均匀，投入到一级反应釜中，调整pH 6.0，反应温度为35℃，反应时间为50min，一级反应结束后转入二级反应釜中，反应温度为60℃，反应时间为25min，二级反应结束后转入三级反应釜中，反应温度为80℃，反应时间为20min，经过三级反应釜的螯合反应，获得黄腐酸螯合锌溶液。
优选的，本发明，所述混合菌剂制备，按照体积比计，选用短小芽孢杆菌：红假单胞菌：甲基营养型芽孢杆菌：阿维链霉菌：酵母菌＝4:5:5:2:4，进行混合，制备获得混合菌剂，检测活菌数达到8.6×1010cfu/ml。
优选的，本发明，所述黄腐酸螯合锌生物肥，按照重量份数比计，将黄腐酸螯合锌溶液7份和混合菌剂1份，混合均匀后，制得螯合锌肥混合液，按重量百分比计，向螯合锌肥混合液中加入2％黄原胶、1.5％甲壳素，起到菌体悬浮和保水作用，混合搅拌均匀，制备获得黄腐酸螯合锌生物肥。
实施例二：生化黄腐酸的制备
生化黄腐酸，具体制备方法步骤如下：
(1)原料处理：按照重量份数比计，将秸秆11-13份、麸皮4-6份、木屑2-4份、核桃青皮2-4份、薄皮核桃壳1-2份、尿素1-2份，混合均匀，机械破碎，后加入清水30-40份混合，获得混合原料；
(2)第一阶段发酵：按重量百分比计，向步骤(1)获得的混合原料中，加入第一阶段发酵混合菌剂5％，当料温上升至65℃以上时，维持48h，期间翻拌2次，获得第一阶段发酵物；
(3)第二阶段发酵：按重量百分比计，向步骤(2)获得的第一阶段发酵物中，加入步骤(1)制备的加入混合原料20％，和第二阶段发酵混合菌剂5％，混合均匀发酵96h，期间翻拌4次，获得第二阶段发酵物；
(4)生化黄腐酸的制备：将步骤(3)制备的第二阶段发酵物挤压过滤得到的悬浮液，经浓缩精制，可得到浓度为65％的生化黄腐酸。
本发明，所述第一阶段发酵混合菌剂，按照体积比计，链嗜酸菌：短小芽孢杆菌：白腐菌：热纤维梭菌＝1:2:1:1。
本发明，所述第二阶段发酵混合菌剂，按照体积比计，枯草芽孢杆菌：黑曲霉：木霉菌＝2:2:1。
优选的，本发明，所述生化黄腐酸原料，按照重量份数比计，将秸秆12份、麸皮5份、木屑3份、核桃青皮3份、薄皮核桃壳1份、尿素1份，混合均匀，机械破碎，后加入清水35份混合，获得混合原料。
本发明，所述短小芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、红假单胞菌、阿维链霉菌、酵母菌、白腐菌、热纤维梭菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和木霉菌，其发酵液检测活菌数均不低于1×109cfu/ml。
实施例三：生化黄腐酸制备条件优化实验
(1)生化黄腐酸原料优化
将秸秆、麸皮、木屑、核桃青皮、薄皮核桃壳、尿素，按照不同配比进行混合，机械破碎，后加入35kg清水，向混合原料中加入第一阶段发酵混合菌剂3％，当料温上升至65℃以上时，维持48h，期间翻拌2次，第一阶段发酵结束后再向料液加入混合原料20％和第二阶段发酵混合菌剂3％，混合均匀发酵96h，期间翻拌4次，获得第二阶段发酵物；第一阶段发酵混合菌剂比例为链嗜酸菌：短小芽孢杆菌：白腐菌：热纤维梭菌＝1:1:1:1，第二阶段发酵混合菌剂为枯草芽孢杆菌：黑曲霉：木霉菌＝1:1:1。检测第二阶段发酵物中黄腐酸含量。
黄腐酸含量的测定：从第二阶段发酵物中抽提黄腐酸，在强酸性溶液中用重铬酸钾将黄腐酸中的碳氧化成二氧化碳，用水作为提取溶剂，根据重铬酸钾消耗量和黄腐酸的碳系数计算含量。
表1：不同原料配比对第二阶段发酵物中黄腐酸含量的影响
黄腐酸发酵原料优化实验中，结果参见表1所示，将秸秆、麸皮、木屑、核桃青皮、薄皮核桃壳、尿素，按照不同配比进行混合，其中F组原料组合配比的原料发酵后获得的黄腐酸含量最高，为20.67％，因此选用较优组合：秸秆12kg、麸皮5kg、木屑3kg、核桃青皮3kg、薄皮核桃壳1kg、尿素1kg，作为原料进行黄腐酸发酵。
(2)发酵混合菌剂优化
将秸秆12kg、麸皮5kg、木屑3kg、核桃青皮3kg、薄皮核桃壳1kg、尿素1kg，进行混合，机械破碎，后加入35kg清水，向混合原料中加入第一阶段发酵混合菌剂3％，当料温上升至65℃以上时，维持48h，期间翻拌2次，第一阶段发酵结束后再向料液加入混合原料20％和第二阶段发酵混合菌剂3％，混合均匀发酵96h，期间翻拌4次，获得第二阶段发酵物，检测生化黄腐酸含量；第一阶段及第二阶段发酵混合菌剂按照表2所示比例进行配比。
表2：发酵混合菌剂不同配比发酵获得生化黄腐酸含量
通过对第一阶段混合菌剂和第二阶段混合菌剂间按照不同比例进行混合，发酵获得的黄腐酸，实验结果参见表2所示，其中按C组比例混合制备的第一阶段混合菌剂和第二阶段混合菌剂发酵获得的黄腐酸中黄腐酸含量最高，为22.34％，明显高于其他组合菌剂配比，通过该实验，选择最优菌剂一阶段发酵混合菌剂为链嗜酸菌：短小芽孢杆菌：白腐菌：热纤维梭菌＝1:2:1:1，第二阶段发酵混合菌剂为枯草芽孢杆菌：黑曲霉：木霉菌＝2:2:1进行黄腐酸发酵。
(4)正交实验优化
本实验分别探究第一阶段发酵菌剂添加量、第一阶段发酵时间、第二阶段发酵菌剂添加量、第二阶段发酵时间对生化黄腐酸中黄腐酸含量的影响。在单因素实验的基础上进行四因素三水平正交实验，正交试验因素与水平表见表3。
表3：正交试验因素与水平表
正交优化不同发酵条件对生化黄腐酸中黄腐酸含量试验结果及分析参见表4所示。
表4：正交试验结果及分析
从表4可以看出，在试验设计的范围内，第一阶段发酵菌剂添加量、第一阶段发酵时间对生化黄腐酸中黄腐酸含量的影响最大。结合表3和表4得到最佳优化条件为A2B2C2D2，即第一阶段发酵菌剂添加量5％、第一阶段发酵时间48h、第二阶段发酵菌剂添加量5％、第二阶段发酵时间时96h时，生化黄腐酸中黄腐酸含量最高。
通过以上实验优化获得生化黄腐酸制备方法为：将秸秆12kg、麸皮5kg、木屑3kg、核桃青皮3kg、薄皮核桃壳1kg、尿素1kg，后加入清水35kg混合，获得混合原料，混合原料中，加入第一阶段发酵混合菌剂5％，第一阶段发酵混合菌剂为链嗜酸菌：短小芽孢杆菌：白腐菌：热纤维梭菌＝1:2:1:1，当料温上升至65℃以上时，维持48h，期间翻拌2次，获得第一阶段发酵物，再向第一阶段发酵物加入混合原料20％和第二阶段发酵混合菌剂5％，二阶段发酵混合菌剂为枯草芽孢杆菌：黑曲霉：木霉菌＝2:2:1，混合均匀发酵96h，期间翻拌4次，获得第二阶段发酵物；将第二阶段发酵物挤压过滤得到的悬浮液，调整pH至2.5-3.0，经浓缩精制，可得到浓度为65％的生化黄腐酸。
实施例四：黄腐酸螯合锌生物肥的制备方法优化
(1)螯合条件优化
将生化黄腐1kg，硫酸锌4kg，磷酸二氢钾9kg，与55kg水混合均匀，调整pH7.0投入到一级反应釜中，分三级进行分段式螯合反应，获得黄腐酸螯合锌溶液，不同实验组螯合时间螯温度及螯合时间参数参见表5所示；检测制备的黄腐酸螯合锌溶液中螯合率。
表5：不同螯合阶段螯合条件对黄腐酸螯合锌的影响
第一阶段 第二阶段 第三阶段 螯合率(％)
A组 30℃，60min 50℃，30min 75℃，25min 92.5
B组 30℃，50min 50℃，25min 75℃，20min 89.5
C组 30℃，40min 50℃，20min 75℃，15min 82.7
D组 35℃，60min 60℃，30min 80℃，25min 93.2
E组 35℃，50min 60℃，25min 80℃，20min 93.7
F组 35℃，40min 60℃，20min 80℃，15min 87.4
G组 40℃，60min 70℃，30min 85℃，25min 92.1
H组 40℃，50min 70℃，25min 85℃，20min 90.3
I组 40℃，40min 70℃，20min 85℃，15min 90.6
螯合温度和反应时间是影响螯合率的重要因素。由表5中结果可以看出，当螯合时间一致时，随着温度的升高，螯合率逐渐增加，当螯合温度一定时，随着螯合率并不是随螯合时间的增长而增加，可明显看出在E组的实验条件下，黄腐酸螯合锌溶液中螯合率最高为93.7％，虽然D组条件下螯合率也较高，为93.2％，但是螯合时间比较长，增加时间成本。综合考虑选择E组，即第一阶段螯合温度35℃，螯合时间50min，第二阶段螯合温度60℃，螯合时间25min，第三阶段螯合温度80℃，螯合时间20min，为最优螯合条件。
(2)螯合pH条件优化
将生化黄腐1kg，硫酸锌4kg，磷酸二氢钾9kg，与55kg水混合均匀，调整pH，投入到一级反应釜中，分三级进行分段式螯合反应，第一阶段螯合温度35℃，螯合时间50min，第二阶段螯合温度60℃，螯合时间25min，第三阶段螯合温度80℃，螯合时间20min，获得黄腐酸螯合锌溶液，实验各组设置不同的pH至进行螯合，检测制备的黄腐酸螯合锌溶液中螯合率。
表6：不同螯合阶段螯合条件对黄腐酸螯合锌的影响
pH值 螯合率(％)
A组 4.0 81.4
B组 5.0 90.7
C组 6.0 94.2
D组 7.0 93.9
E组 8.0 94.2
F组 9.0 94.4
由表6中结果可以看出，螯合pH明显影响黄腐酸螯合锌溶液的螯合率，当pH低于6.0时，螯合率较低，当pH高贵6.0时，螯合率增加幅度并明显，基本保持稳定，可明显看出在C组的实验条件下，pH值为6.0时，黄腐酸螯合锌溶液中螯合率较最高为94.2％。综合考虑选择C组条件，即螯合pH为6.0时，为最优螯合pH条件。
(3)正交优化
在单因素试验结果基础上，根据正交实验分别根据生化黄腐酸：硫酸锌：磷酸二氢钾比例(A)、混合菌剂比例(B)、黄腐酸螯合锌溶液：混合菌剂(C)、黄原胶添加量(D)和甲壳素添加量(E)，制备后获得黄腐酸螯合锌生物肥，稀释1倍后，叶面喷施该肥料，测定对核桃果实中锌含量的影响，根据正交实验组合设计进行五因素三水平实验。试验的因素和水平编码值参见表7所示。
表7：试验的因素和水平编码值
正交优化不同制备条件对核桃果实中锌含量的影响试验结果及分析参见表8所示。
表8：正交试验结果及分析
从表8可以看出，在试验设计的范围内，生化黄腐酸：硫酸锌：磷酸二氢钾比例对核桃果实中锌含量的影响最大。结合表7和表8得到最佳优化条件为A3B2C3D2E2，即黄腐酸螯合锌溶液制备中原料按照生化黄腐酸:硫酸锌:磷酸二氢钾＝1:5:10混合，混合菌剂按照短小芽孢杆菌:红假单胞菌:甲基营养型芽孢杆菌:阿维链霉菌:酵母菌＝4:5:5:2:4混合制备、黄腐酸螯合锌溶液:混合菌剂＝7:1比例混合、黄原胶添加量为2％和甲壳素添加量为1.5％，制备获得的黄腐酸螯合锌生物肥，稀释1倍后施用与核桃叶面上和叶面下，获得的核桃果实中锌含量最高。
利用单因素和正交试验得出，采用本发明提供的黄腐酸螯合锌生物肥最佳制备条件为：按照重量份数比计，将生化黄腐酸1份，硫酸锌5份，磷酸二氢钾10份，水50份混合均匀，投入到一级反应釜中，调整pH 6.0，反应温度为35℃，反应时间为50min，一级反应结束后转入二级反应釜中，反应温度为60℃，反应时间为25min，二级反应结束后转入三级反应釜中，反应温度为80℃，反应时间为20min，经过三级反应釜的螯合反应，获得黄腐酸螯合锌溶液；混合菌剂按照短小芽孢杆菌:红假单胞菌:甲基营养型芽孢杆菌:阿维链霉菌:酵母菌＝4:5:5:2:4，进行混合，制备获得混合菌剂，检测活菌数达到8.6×1010cfu/ml；将的黄腐酸螯合锌溶液7份和混合菌剂1份，混合均匀后，制得螯合锌肥混合液，按重量百分比计，向螯合锌肥混合液中加入2％黄原胶、1.5％甲壳素，起到菌体悬浮和保水作用，混合搅拌均匀，制备获得黄腐酸螯合锌生物肥，按1倍稀释后，施用与核桃叶面后，获得的核桃果实中锌含量最高为2.95mg/kg。
实施例四：黄腐酸螯合锌生物肥在核桃种植中应用
通过采用实施例一、实施例二的方法制备获得黄腐酸螯合锌生物肥，并在温宿核桃林场进行试验，通过设置7个试验组，将本申请制备黄腐酸螯合锌生物肥用水稀释为五种不同浓度的肥料，核桃坐果-果实膨大期进行锌肥喷施试验，经细雾均匀喷布在叶片正、反面上，每亩用量15公斤进行稀释液。坐果期喷第一次，每隔15天后再喷施一次，连喷3次。一般选择在晴天无风的上午10点以前和下午的7点以后喷施，筛选出经济、高效、节能的黄腐酸螯合锌生物肥施用方法。
表9：不同稀释度螯合肥施用后对核桃果实中锌含量的影响
通过对核桃坐果期进行黄腐酸螯合锌生物肥喷施试验，结果参见表9所示，通过将黄腐酸螯合锌生物肥进行稀释喷施，可以看出，黄腐酸螯合锌生物肥稀释8倍与稀释10倍喷施后，核桃果实中锌含量差别不大，但当稀释倍数大于10倍，核桃果实中锌含量明显降低，黄腐酸螯合锌生物肥稀释10倍，相当于1.5kg/亩喷施后核桃果实中锌含量为2.96mg/kg，与对照相比，核桃果实中锌含量提高44.6％，与市售土施肥料相比，核桃果实中锌含量提高37.5％，与市售喷施叶面肥相比，核桃果实中锌含量提高28.7％。
通过实施例一、实施例二中的优选配比制备的黄腐酸螯合锌生物肥进行喷施试验，制备条件为：生化黄腐酸，按照重量份数比计，将秸秆12份、麸皮5份、木屑3份、核桃青皮3份、薄皮核桃壳1份、尿素1份，混合均匀，机械破碎，后加入清水35份混合，获得混合原料，接入5％第一阶段发酵混合菌剂，第一阶段发酵混合菌剂按照体积比计，链嗜酸菌：短小芽孢杆菌：白腐菌：热纤维梭菌＝1:2:1:1，进行发酵后，接入5％第二阶段发酵混合菌剂，第二阶段发酵混合菌剂按照体积比计，枯草芽孢杆菌：黑曲霉：木霉菌＝2:2:1，发酵获得生化黄腐酸；按照重量份数比计，将生化黄腐酸1份，硫酸锌5份，磷酸二氢钾10份，水60份混合均匀，投入到一级反应釜中，调整pH 6.0，反应温度为35℃，反应时间为50min，一级反应结束后转入二级反应釜中，反应温度为60℃，反应时间为25min，二级反应结束后转入三级反应釜中，反应温度为80℃，反应时间为20min，经过三级反应釜的螯合反应，获得黄腐酸螯合锌溶液；按照体积比计，选用短小芽孢杆菌：红假单胞菌：甲基营养型芽孢杆菌：阿维链霉菌：酵母菌＝4:5:5:2:4，进行混合，制备获得混合菌剂，检测活菌数达到8.6×1010cfu/ml；按照重量份数比计，将黄腐酸螯合锌溶液7份和混合菌剂1份，混合均匀后，制得螯合锌肥混合液，按重量百分比计，向螯合锌肥混合液中加入2％黄原胶、1.5％甲壳素，起到菌体悬浮和保水作用，混合搅拌均匀，制备获得黄腐酸螯合锌生物肥，进行核桃叶面喷施试验，按照1.5kg/亩喷施后，核桃果实中锌含量为高于2.96mg/kg，核桃果仁中锌含量更高，黄腐酸螯合锌生物肥的施肥效果更好，实现核桃富锌提升保健功效的目的。
通过一系列的筛选和效果验证试验表明，本发明通过利用混合菌剂与黄腐酸螯合锌溶液相融合制备黄腐酸螯合锌生物肥，黄腐酸螯合锌生物肥在核桃叶面施用后微生物迅速大量繁殖，能够降解农药化肥残留，消除重金属污染，黄腐酸螯合锌生物肥利用了黄腐酸的强络合能力与锌离子螯合，更有利于核桃叶片的吸收，提高锌肥的利用率，提高核桃产品品质，降低农药残留，核桃果仁中锌含量较高，实现核桃富锌提升保健功效的目的。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种黄腐酸螯合锌生物肥的制备方法，其特征在于，通过如下制备方法获得：
（1）黄腐酸螯合锌溶液制备：按照重量份数比计，将生化黄腐酸1-2份，硫酸锌4-6份，磷酸二氢钾9-11份，水45-55份混合均匀，投入到一级反应釜中，调整pH6.0-7.0，反应温度为30-40℃，反应时间为40-60min，一级反应结束后转入二级反应釜中，反应温度为50-70℃，反应时间为20-30min，二级反应结束后转入三级反应釜中，反应温度为75-85℃，反应时间为15-25min，经过三级反应釜的螯合反应，获得黄腐酸螯合锌溶液；
（2）混合菌剂制备：选用短小芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、红假单胞菌、阿维链霉菌和酵母菌进行混合，制备获得混合菌剂，检测活菌达到8.6×1010cfu/ml；
（3）黄腐酸螯合锌生物肥的制备：按照重量份数比计，将步骤（1）制备的黄腐酸螯合锌溶液6-8份和步骤（2）制备的混合菌剂1-2份，混合均匀后，制得螯合锌肥混合液，按重量百分比计，向螯合锌肥混合液中加入1-3%黄原胶、1-2%甲壳素，起到菌体悬浮和保水作用，混合搅拌均匀，制备获得黄腐酸螯合锌生物肥。
2.如权利要求1所述一种黄腐酸螯合锌生物肥的制备方法，其特征在于，所述黄腐酸螯合锌溶液制备，按照重量份数比计，将生化黄腐酸1份，硫酸锌5份，磷酸二氢钾10份，水60份混合均匀，投入到一级反应釜中，调整pH 6.0，反应温度为35℃，反应时间为50min，一级反应结束后转入二级反应釜中，反应温度为60℃，反应时间为25min，二级反应结束后转入三级反应釜中，反应温度为80℃，反应时间为20min，经过三级反应釜的螯合反应，获得黄腐酸螯合锌溶液。
3.如权利要求1所述一种黄腐酸螯合锌生物肥的制备方法，其特征在于，所述混合菌剂制备，按照体积比计，选用短小芽孢杆菌：红假单胞菌：甲基营养型芽孢杆菌：阿维链霉菌：酵母菌=4:5:5:2:4，进行混合，制备获得混合菌剂，检测活菌达到8.6×1010cfu/g。
4.如权利要求1所述一种黄腐酸螯合锌生物肥的制备方法，其特征在于，按照重量份数比计，将黄腐酸螯合锌溶液7份和混合菌剂1份，混合均匀后，制得螯合锌肥混合液，按重量百分比计，向螯合锌肥混合液中加入2%黄原胶、1.5%甲壳素，起到菌体悬浮和保水作用，混合搅拌均匀，制备获得黄腐酸螯合锌生物肥。
5.一种黄腐酸螯合锌生物肥中的生化黄腐酸的制备方法，其特征在于，通过如下制备方法获得：
（1）原料处理：按照重量份数比计，将秸秆11-13份、麸皮4-6份、木屑2-4份、核桃青皮2-4份、薄皮核桃壳1-2份、尿素1-2份，混合均匀，机械破碎，后加入清水30-40份混合，获得混合原料；
（2）第一阶段发酵：按重量百分比计，向步骤（1）获得的混合原料中，加入第一阶段发酵混合菌剂5%，当料温上升至65℃以上时，维持48h，期间翻拌2次，获得第一阶段发酵物；
（3）第二阶段发酵：按重量百分比计，向步骤（2）获得的第一阶段发酵物中，加入步骤（1）制备的加入混合原料20%，和第二阶段发酵混合菌剂5%，混合均匀发酵96h，期间翻拌4次，获得第二阶段发酵物；
（4）生化黄腐酸的制备：将步骤（3）制备的第二阶段发酵物挤压过滤得到的悬浮液，经浓缩精制，可得到浓度为65％的生化黄腐酸。
6.如权利要求5所述一种黄腐酸螯合锌生物肥中的生化黄腐酸的制备方法，其特征在于，所述生化黄腐酸，第一阶段发酵混合菌剂，按照体积比计，链嗜酸菌：短小芽孢杆菌：白腐菌：热纤维梭菌=1:2:1:1。
7.如权利要求5所述一种黄腐酸螯合锌生物肥中的生化黄腐酸的制备方法，其特征在于，所述生化黄腐酸，第二阶段发酵混合菌剂，按照体积比计，枯草芽孢杆菌：黑曲霉：木霉菌=2:2:1。
8.如权利要求5所述一种黄腐酸螯合锌生物肥中的生化黄腐酸的制备方法，其特征在于，所述生化黄腐酸原料，按照重量份数比计，将秸秆12份、麸皮5份、木屑3份、核桃青皮3份、薄皮核桃壳1份、尿素1份，混合均匀，机械破碎，后加入清水35份混合，获得混合原料。
9.一种如权利要求1或5任意一项制备方法获得的黄腐酸螯合锌生物肥。
10.如权利要求9所述的黄腐酸螯合锌生物肥在核桃种植中的应用。
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