CN107488591B - 一种高酶活、高耐盐的酱油菌株的选育方法及其应用方法 - Google Patents

一种高酶活、高耐盐的酱油菌株的选育方法及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株、选育方法及其在高盐稀态法酱油酿造工艺中的应用方法，米曲霉菌株保藏编号为CCTCC NO:M2017077。本发明的选育方法是以米曲霉3.951为出发菌株，经过60Co‑γ射线辐照及化学试剂联合诱变，高盐涂布初筛培养，优选培养获得高酶活、高耐盐的米曲霉菌株。本发明选育的菌株耐高盐、种曲孢子数多、发芽率高、酶活高、遗传性能稳定，能有效提高蛋白质利用率、淀粉糖化率，进而提高酱油出油率达到充分利用酿造原料的目的；且采用本发明菌株制备的酱油风味物质含量明显提高，有典型的酱香及特有的香味成分，从而使酱油风味更加丰富、醇美。

Description

一种高酶活、高耐盐的酱油菌株的选育方法及其应用方法
技术领域
本发明涉及微生物菌种选育方法的技术领域，更具体地，涉及一 种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株、选育方法及其应用方法。
背景技术
酱油是我国历史悠久、备受喜爱的传统调味品之一。我国酱油年 产量达500多万吨，占世界年产量60％以上。酱油发酵主要有低盐固态 法和高盐稀态法两种方法。目前我国酱油主要以低盐固态法为主，但 该法生产的酱油品质不及高盐稀态发酵法。随着人们生活水平提高， 对高品质酱油的需求也不断增加。由高盐稀态法酿制而成的酱油品质 高、风味佳，高浓度的盐不仅能起到防腐和抑菌的作用，还能赋予酱 油咸味和鲜味。但是酿造酱油所用关键菌种米曲霉的代谢活性和所产 生的蛋白酶、淀粉酶的酶活及其稳定性也会受到高盐因素的影响而降 低，从而导致分解蛋白质及淀粉类原料的速度和利用率降低，氨基酸 态氮出品率低，淀粉糖化率低。同时，发酵过程中酵母发酵糖类生成 酒精，乳酸菌发酵糖类生成乳酸以及美拉德反应等一系列生化反应带 来的酱油色泽、滋味的变化减缓或减少，发酵成熟较慢，发酵周期长 等问题也随之而来。日本酱油以其游离糖、总氮和有机酸含量较高等 优点占据了大量海外市场和高档酱油的市场份额，虽然其生产方法与 我国传统的生产方法相似，但其原料的蛋白质利用率以90％以上高居世 界第一，而我国传统高盐稀态酱油酿造中蛋白质利用率只有75％-80％， 这与日本先进的微生物菌种选育、复合菌种制曲及多菌种混合发酵等 技术密不可分。因此，通过人工诱变选育高产优质菌株，从而获得能 在高盐环境中耐受高渗透压，高产蛋白酶、淀粉酶且风味物质丰富、 品质高、遗传性状稳定的米曲霉菌株意义重大。
发明内容
本发明提供一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株、选育方法及其应 用方法，用于克服现有微生物菌种无法适用高盐稀态法酿制高品质酱 油的技术问题。
3、为实现上述目的，本发明提供一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌 株，保藏编号为CCTCC NO:M2017077。
所述的一种高酶活、高耐盐的米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株的形 态如下：菌落呈圆形，直径为35～40mm，质地疏松，菌丝较出发菌株 稍短，但生长旺盛，颜色为黄绿色，背面无色。分生孢子头呈放射状， 直径200～300μm，孢子梗2～3mm，近顶囊处直径10～20μm，壁薄且 粗糙，顶囊为球形，约25μm。
本发明采用的技术方案为：
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株的选育方法，包括如下步骤： (1)将出发菌株接种于酪蛋白琼脂平板培养基上培养60～90h，挑选长 势良好的平板进行60Co-γ射线辐照诱变，诱变剂量选取1～5kGy，辐 射完后放至无菌室中进行分离，继续培养60～90h，根据菌丝生长情况 和菌落透明圈大小，以出发菌株为对照组筛选出生长旺盛的菌株。
(2)将步骤(1)筛选出来的菌株接种于PDA斜面培养基上，在25～30℃ 培养至萌动期后，用生理盐水冲洗斜面培养基，离心收集菌体，加入 生理盐水得孢子数为106～107个/ml的孢子悬浮液；
(3)取诱变剂原液加入至缓冲液中配制成诱变剂母液，在步骤(1) 所述的孢子悬浮液中以体积比1：3～5加入诱变剂母液，在25～30℃处 理60～120min后离心分离，用缓冲液反复冲洗至反应终止；
(4)将步骤(3)处理后的孢子悬浮液分别涂布在添加氯化钠溶液 的酪蛋白琼脂平板培养基上培养，根据菌丝生长情况和菌落透明圈大 小，以出发菌株为对照组筛选出生长旺盛的菌落，并随即转接至麦芽 汁琼脂斜面培养基上，于25～30℃培养至成熟得初筛菌株，然后置于4℃ 冷藏备用；
(5)用黄豆粉、次粉、麸皮、水按一定比例配制优选培养基，将 制备好的优选培养基分装至三角瓶，121℃灭菌25～30min，挑取1环 步骤(4)所述的初筛菌株接种至三角瓶内，混匀后于25～30℃堆积培 养60～90h，测定其孢子数、发芽率及酶活性，孢子数最高、发芽率及 酶活最高的菌株即为高酶活、高耐盐的米曲霉菌株。
优选地，步骤(1)所述的出发菌株是米曲霉3.951。
优选地，步骤(3)所述的诱变剂是甲基磺酸乙酯，所述的缓冲液 是pH为7.0～8.0的磷酸缓冲液。
优选地，步骤(4)所述的氯化钠溶液的初始质量分数为10～14％， 递增梯度为2％，最终质量分数为22～26％。
优选地，步骤(1)、(4)所述的酪蛋白琼脂平板培养基的配方组 分以重量计为15份酪蛋白胰酶消化物、5份大豆粉木瓜蛋白酶消化物、 5份氯化钠、15份琼脂、1000份蒸馏水；所述的麦芽汁琼脂斜面培养 基的配方组分以重量计为130份麦芽浸粉、0.1份氯霉素、5份氯化钠、 15份琼脂、1000份蒸馏水。
优选地，步骤(5)所述的优选培养基的配方组分以重量计为7.2 份黄豆粉、2份次粉、0.8份麸皮、30份蒸馏水。
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株应用于高盐稀态发酵酱油酿造 工艺。
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株的应用方法是：
a、以重量份计称取7.2份大豆、2份次粉、0.8份麸皮，将大豆 加水浸泡3～5小时后将水放净，取出黄豆，加入已称好的麸皮，装入 常压蒸锅内蒸煮，以蒸至熟透而不烂，豆瓣分开为适宜，再与次粉进 行混匀，摊开进行冷却至25～30℃，接入高酶活、高耐盐的米曲霉菌株， 接种量为0.2％，混匀，于30℃堆积培养72h，则制成成曲。
b、将制作的成曲与盐水按照1：2～5的质量比添加至酱油发酵 工艺中即可，进一步优选的质量比为1：3。
本发明生物材料样品已按照专利法实施细则的规定在国家知识产 权局指定的保藏单位——中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国. 武汉.武汉大学,保藏日期2017年3月1日；保藏编号为CCTCC NO:M2017077；分类命名：米曲霉HNCC 6.189，拉丁文学名：Asporgillus orgzoe HNCC6.189；生物样本存活性于2017年3月11日检测完成，结 果是存活。
本发明的有益效果在于：
1、本发明采用诱变育种法，通过60Co-γ射线辐照及化学试剂甲 基磺酸乙酯联合诱变，对米曲霉3.951菌株进行人工诱变选育高产优质 菌株，成功培育了一种具有耐高盐、种曲孢子数多、发芽率高、酶活 高、遗传性能稳定以及易于扩大培养等众多优良特性的米曲霉菌株 (Aspergillus oryzae)HNCC 6.189。
2、本发明选育的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)HNCC 6.189将出 发菌株的蛋白质利用率从80％提高到89％，提高效果明显，则通过提 高蛋白质利用率、淀粉糖化率，进而提高酱油出油率达到充分利用酿 造原料的目的；其次，本发明选育的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae) HNCC 6.189将高盐稀态酱油生产周期从原来的6个月缩短到5个月， 能适应大规模工业化生产，其应用前景广阔。
3、本发明选育的米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株HNCC 6.189制 得酱油与出发菌株发酵制得的酱油相比，其氨基酸态氮、总酸以及风 味物质的含量都远远高于出发菌株发酵制得的酱油，其中风味物质的 含量方面醇类物质相对含量增加了1.17％的香茅醇及0.63％的乙醇，酚 类物质增加了0.19％的4-乙基愈创木酚，酸类物质增加了0.25％的2,4-己二酸、1.11％的己酸及1.57％的丁香酸，酯类物质增加了3.75％的乙 酸乙酯、0.06％的硬脂酸甲酯，醛酮类物质增加了1.53％的5-甲基-2- 糠醛、5.66％4-羟基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮、1.09％的2,5-二甲基 -吡嗪及0.23％的2-糠醛，以上风味物质大都具有典型的酱香及特有的 香味成分，使酱油风味更加丰富、醇美。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的表1-4，对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普 通技术人在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株，保藏单位为中国典型培养物保 藏中心保藏，地址：中国.武汉.武汉大学,保藏日期2017年3月1日； 保藏编号为CCTCC NO:M2017077；分类命名：米曲霉HNCC 6.189，拉 丁文学名：Asporgillus orgzoeHNCC 6.189；生物样本存活性于2017年3 月11日检测完成，结果是存活。
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株的选育方法，包括如下步骤：
(1)将出发菌株接种于酪蛋白琼脂平板培养基上培养72h，挑选长 势良好的平板，送于湖南省核农学与航天育种研究所进行60Co-γ射线 辐照诱变，选取1kGy、2kGy、3kGy作为诱变剂量，每个剂量辐照10 个平板，共30个平板。辐射完后，用黑布将经60Co-γ射线辐照诱变 处理后的平板包好拿回，放至无菌室中进行分离，继续培养72h，根据 菌丝生长情况和菌落透明圈大小，以出发菌株为对照组筛选出生长旺 盛的菌株。
(2)将步骤(1)筛选出来的菌株接种于PDA斜面培养基上，在 25～30℃培养至萌动期后，用生理盐水冲洗斜面培养基，离心收集菌体， 加入生理盐水得孢子数为106～107个/ml的孢子悬浮液；
(3)取甲基磺酸乙酯原液加入至pH为7.2的磷酸缓冲液中配制成 甲基磺酸乙酯母液，在2ml的所述的孢子悬浮液中加入8ml的甲基磺酸 乙酯母液，在25～30℃处理90min后离心分离，用磷酸缓冲液反复冲洗 至反应终止；
(4)将步骤(3)处理后的孢子悬浮液分别涂布在氯化钠溶液质 量分数为12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％的酪蛋白琼脂平板 培养基上培养，并对菌种进行编号，编号分别为Lp001、Lp002、Lp003、 Lp004、Lp005、Lp006、Lp007(其中，酪蛋白琼脂平板培养基的配方 组分以重量计为15份酪蛋白胰酶消化物、5份大豆粉木瓜蛋白酶消化 物、5份氯化钠、15份琼脂、1000份蒸馏水)；然后根据菌丝生长情况 和菌落透明圈大小，以出发菌株米曲霉3.951为对照组筛选出生长旺盛 的菌落，并随即转接至麦芽汁琼脂斜面培养基上，于25～30℃培养4天 后成熟得初筛菌株，然后置于4℃冷藏备用。(其中，麦芽汁琼脂斜面培养基的配方组分以重量计为130份麦芽浸粉、0.1份氯霉素、5份氯化 钠5.0、15份琼脂15.0、1000份蒸馏水)
(5)以重量计称取7.2份黄豆粉、2份次粉、0.8份麸皮、30份蒸馏 水配制优选培养基，将制备好的培养基分装至7个三角瓶，121℃灭菌 30min，分别挑取1环不同编号的初筛菌株接种至三角瓶内，混匀后于 25～30℃堆积培养72h，测定每个编号的孢子数、发芽率及酶活性(碱 性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力、中性蛋白酶活力及淀粉酶活力)， 测定的结果见表1。
表1各编号种曲测定结果
Figure BDA0001295738250000071
从表1可以看出，孢子数最高、发芽率及酶活最高的菌株是编 号为Lp001的菌株，将其冷冻保藏至中国典型培养物保藏中心保藏， 地址：中国.武汉.武汉大学,保藏日期2017年3月1日；保藏编号为 CCTCC NO:M2017077；分类命名：米曲霉HNCC 6.189，拉丁文学名： Asporgillus orgzoeHNCC 6.189；生物样本存活性于2017年3月11日检 测完成，结果是存活。
实施例2：
将黄豆粉、次粉、麸皮、水按7.2:2:0.8:30的比例配制，并添加 梯度质量浓度的氯化钠溶液，制备成不同盐浓度12％、14％、16％、18％、 20％、22％、24％质量分数的培养基，于121℃灭菌30min，将实施例1中 的LP001菌株和米曲霉3.951分别挑取1环孢子接种于培养基中，在30℃ 下培养72h。本实施例中LP001菌株和米曲霉3.951的种曲孢子数，发 芽率及酶活性、渗透压的检测结果对比见表2。
表2：不同盐浓度下LP001菌株和米曲霉3.951的对比检测结果
Figure BDA0001295738250000081
从上表2中可以看出，本发明制得的LP001菌株最高耐受盐浓度 可达20％，当盐浓度增大到22％时，其种曲孢子数、发芽率、酶活力 开始下降，但都远远高于出发菌株米曲霉3.951的测定结果。结果表明， 本发明LP001菌株的耐盐性能远大于出发菌株米曲霉3.951的耐盐性。
实施例3：
将实施例1中的LP001菌株在麦芽汁斜面培养基上连续传代培养 10代，并将第1代、第3代、第5代、第8代、第10代的斜面菌种制 作三角瓶种曲，测定其孢子数、发芽率及酶活性，判断其遗传稳定性， 具体数据见表3。
表3：LP001菌株传代稳定性测试结果
Figure BDA0001295738250000091
从表3可以看出，从种曲孢子数、发芽率及酶活性检测结果来看， LP001菌株的遗传稳定性良好。
实施例4：
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株的应用方法是：
以重量份计称取7.2份大豆、2份次粉、0.8份麸皮，将大豆加 水浸泡4小时后将水放净，取出黄豆，加入已称好的麸皮，装入常压 蒸锅内蒸煮，以蒸至熟透而不烂，豆瓣分开为适宜，再与次粉进行混 匀，摊开进行冷却至25～30℃，接入高酶活、高耐盐的米曲霉LP001 菌株，接种量为0.2％，混匀，于30℃堆积培养72h，则制成成曲。将 制作的成曲与盐水按照1：3的质量比添加至酱油发酵工艺中，其后的 发酵工艺与原发酵法保持一致，发酵时间150天，过滤头油，利用蒸 馏萃取处理酱油样品，气相色谱-质谱(SDE/GC-MS)方法检测其与出 发菌株米曲霉3.951制得的酱油的各项酱油风味含量变化，同时测定原 料及酱渣的全氮含量，推算蛋白质利用率，结果见表4。
表4：LP001菌株与米曲霉3.951制得的酱油样品的指标检测结果
Figure BDA0001295738250000101
Figure BDA0001295738250000111
Figure BDA0001295738250000121
Figure BDA0001295738250000131
Figure BDA0001295738250000141
从表4可以看出，本发明制得的米曲霉LP001菌株制得酱油与出 发菌株米曲霉3.951发酵制得的酱油相比，在发酵周期缩短一个月的条 件下，其氨基酸态氮、总酸、蛋白质利用率从80.02％提高到89％，提 高效果明显；风味物质的含量远高于出发菌株米曲霉3.951发酵制得的 酱油，其中醇类物质相对含量增加了1.17％的香茅醇及0.63％的乙醇，酚类物质增加了0.19％的4-乙基愈创木酚，酸类物质增加了0.25％的 2,4-己二酸、1.11％的己酸及1.57％的丁香酸，酯类物质增加了3.75％ 的乙酸乙酯、0.06％的硬脂酸甲酯，醛酮类物质增加了1.53％的5-甲基 -2-糠醛、5.66％4-羟基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮、1.09％的2,5-二甲 基-吡嗪及0.23％的2-糠醛，以上风味物质大都具有典型的酱香及特有的香味成分，使酱油风味更加丰富、醇美。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而 非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领 域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技 术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修 改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方 案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种高酶活、高耐盐的米曲霉(Asporgillus orgzoe)菌株，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO:M2017077。
2.一种权利要求1所述的高酶活、高耐盐的米曲霉菌株的应用方法，其特征在于，包括：a、以重量份计称取7.2份大豆、2份次粉、0.8份麸皮，将大豆加水浸泡3～5小时后将水放净，取出黄豆，加入已称好的麸皮，装入常压蒸锅内蒸煮，以蒸至熟透而不烂，豆瓣分开为适宜，再与次粉进行混匀，摊开进行冷却至25～30℃，接入高酶活、高耐盐的米曲霉菌株，接种量为0.2％，混匀，于30℃堆积培养72h，则制成成曲；b、将制作的成曲与盐水按照1:2～5的质量比添加至酱油发酵工艺中即可。
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