CN105779349B - 一种溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株jzbc1及其应用 - Google Patents

一种溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株jzbc1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1，该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏名称为蜡样芽孢杆菌JZBC1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2016年3月3日，保藏编号：CCTCC No：M 2016081。该菌株JZBC1具有较高的溶解池塘优势甲藻—甲藻锥状斯氏藻的能力，且专一性好。本发明还公开了上述蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1在溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻中的应用。

Description

一种溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株 JZBC1及其应用
技术领域
本发明属于采用微生物控制微藻技术领域，具体涉及一种溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1及其应用。
背景技术
微藻是养殖池塘水体环境重要的生物因子之一，它可吸收利用水体中的氮磷营养，并通过光合作用增加水体的溶解氧含量。因此，优良的微藻藻相对优化养殖水体质量，促进水体生态***的物质和能量循环具有重要作用(李卓佳，2005)。有研究指出在虾池环境中微藻优势种对整个微藻群落的结构与功能产生巨大影响(彭聪聪，2010)，就养殖生产需求而言，以绿藻为优势的藻相结构相对最好，水质稳定，病害较少，对虾生长良好，水体生态***稳定；以硅藻为优势的水体环境，对虾生长快，病害少，但容易因气候变化而发生优势种更迭，藻相剧烈变动，从而诱发对虾产生应激发应(黄翔鹄，2002；查广才，2004；申玉春，2004)；以甲藻、蓝藻等有害微藻为优势时，养殖水质恶化，对虾生长缓慢且易引发病害(刘孝竹，2011)，而且当养殖水体中的甲藻浓度达到104cells/L时，养殖对虾将出现行为异常并逐渐死亡(Linares，2009)。在华南对虾养殖主产区的养殖池塘环境中，养殖前50d容易形成甲藻优势的微藻藻相，诱发养殖对虾病害，严重影响了养殖生产效益(彭聪聪，2011；刘孝竹，2009)。因此，在生产中有必要严格防控甲藻、蓝藻等有害微藻形成优势，构建和维护以绿藻或硅藻为优势的微藻藻相。虽然有学者对赤潮微藻溶藻菌开展了一些研究，但其关注点主要集中在针对海湾赤潮(Mayali，2004；Mayali，2007；Rooney，2005)及相关有害藻特性与治理等方面(曹宾霞，2008；谢志浩，2008)，研究水域多为开放性的大面积水域环境。利用溶藻菌防控水产养殖池塘环境甲藻优势的研究还少见报道。
溶藻菌抑制微藻生长的主要方式包括：表面接触溶藻、进入藻细胞杀灭微藻等直接溶藻方式，分泌溶藻物质、与微藻竞争营养物质、形成菌胶膜等间接抑藻方式。近年来报道的溶藻菌主要有：海洋杆菌、芽孢杆菌、交替假单胞菌、黄杆菌、节杆菌、弧菌、葡萄球菌、噬胞菌、鞘氨醇单胞菌、屈挠细菌等。例如，史荣君(2013)、Shi(2013)、Yang(2013)等从赤潮水体环境中筛选了芽孢杆菌、海洋杆菌等多种菌株，通过表面接触作用或分泌活性物质的方式对硅藻和甲藻的赤潮种产生良好的溶藻效果。Kawamo等(1997)从菌株PK654分离的活性物质Thiotropicin可抑制中肋骨条藻及赤潮异弯藻。Jeong等(2003)发现Hahellachejuensis细菌可合成一种灵菌红素，该物质具有强烈的细胞溶解酶活性，能溶解多种赤潮微藻。
但目前并未有对养殖水体中优势甲藻—锥状斯氏藻具有明显的溶解和消除作用的菌株方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1，该菌株JZBC1具有较高的溶解池塘优势甲藻—甲藻锥状斯氏藻的能力，且专一性好。
本发明的目的还在于提供上述溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1在溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻中的应用。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1，该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏名称为蜡样芽孢杆菌JZBC1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2016年3月3日，保藏编号：CCTCC No：M 2016081。
本发明中养殖池塘环境与背景技术中的水体环境存在巨大差异，需控制的目标微藻种类、水体营养、人工技术措施等均不具可比性。因此，本发明通过分离、筛选的溶藻菌株JZBC1对养殖水体中优势甲藻—锥状斯氏藻具有明显的溶解和消除作用，对池塘中的优良绿藻和硅藻等，例如小球藻、栅藻、小环藻等没有明显不良影响。拓宽了人们对芽孢杆菌属(Bacillus sp.)在其功能方面的应用研究思路，也为溶藻细菌应用于养殖池塘提供了理论依据。
本发明中的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1的筛选分离鉴定过程为：在爆发甲藻赤潮的池塘，用浮游植物网收集浓缩微藻群落样品；同时，采集池塘水体进行高压灭菌，用以培养浓缩的池塘微藻样品，培养温度21～25℃，光照强度2500～4000lx、光暗周期为12h：12h，培养7～8d，再将培养的藻液样品在2216E固体培养基进行划线培养，25～28℃培养24～36h，分离纯化获得生长性能好的菌株。
从对虾养殖池塘分离获得池塘水体中的优势甲藻—锥状斯氏藻，并进行纯培养。分离获得的菌株经纯培养后，将菌液放入锥状斯氏藻的培养***中，分析菌株对池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的溶藻效果；同时分析菌株对池塘养殖水体其他优良微藻—蛋白核小球藻、条纹小环藻的影响，获得仅对池塘优势甲藻—锥状斯氏藻有良好溶藻效果的菌株，并确定该菌株的应用条件。
该蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1在温度18～35℃、盐度0～35、pH6.8～9.0均可正常生长，最佳条件为温度20～32℃，盐度5～28，pH7.0～8.5。在养殖水环境中生长10～20h可达到峰值，24～120h期间维持在108～109cfu/ml数量水平。该菌株适宜在大部分池塘应用。
通常蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1可按菌浓度104cfu/mL～105cfu/mL使用，使用后10d内不使用消毒剂；根据池塘甲藻数量可适当增大用菌量，或连续多次使用。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1在溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻中的应用。
该蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1的菌浓度为106cfu/mL～107cfu/mL时，对锥状斯氏藻(藻细胞密度104cell/mL～105cell/mL)具有良好溶藻效果，2～6d可完全溶解锥状斯氏藻。
且该蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1溶藻专一性强，其只溶解锥状斯氏藻的藻细胞，对蛋白核小球藻和条纹小环藻没有明显的不良影响。
该蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1可用于抑制甲藻生态优势，促进水体形成以绿藻或硅藻为优势的微藻群落环境，在以锥状斯氏藻、蛋白核小球藻和条纹小环藻为优势种的微藻群落环境中，施用该蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1浓度105cfu/mL～107cfu/mL，用菌5d后对锥状斯氏藻的去除率90％～97％以上，10d后锥状斯氏藻基本完全被溶解；蛋白核小球藻数量由初始的1×104cell/mL～3×104cell/mL大幅升高至1×107cell/mL～3×107cell/mL，条纹小环藻数量则略有降低，由初始的1×104cell/mL～3×104cell/mL降低至3×103cell/mL～5×103cell/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明中的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1溶藻效果明显，可对养殖水体中优势的有害甲藻—锥状斯氏藻具有明显的溶解和消除作用；
(2)本发明中的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1专一性好，对优势养殖水体优势有害甲藻——锥状斯氏藻有较好的溶解效果，但对绿藻和硅藻——蛋白核小球藻、条纹小环藻没有明显的不良影响；
(3)本发明中的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1应用于溶解池塘甲藻优势种可取得较好的生态效益，用以防控甲藻优势可取得良好的效果，同时，也可避免过量使用化学杀藻剂而带来的养殖产品质量安全和水域生态安全的潜在危害；
(4)本发明中的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1应用于消除或抑制池塘中的有害甲藻，可避免水体形成以甲藻为优势的微藻群落环境，促进水体优良绿藻和硅藻的生长，达到优化微藻藻相的效果。这可为运用菌藻技术实施养殖水环境定向调控提供技术储备。
附图说明
图1是实施例3中菌株JZBC1的生长曲线；
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1的筛选与培养
1、材料准备
1.1、菌源
在爆发甲藻赤潮的池塘，用浮游植物网收集浓缩微藻群落样品，再由微藻藻际环境中进行分离培养。
1.2、培养基
(1)f/2培养基；
(2)灭菌池塘水添加NH4Cl 1.0～1.5g/L和Na2HPO4 30～40mg/L；
(3)微生物2216E固体培养基和营养肉汤培养基。
2、菌株的筛选培养
选取茂名某对虾养殖池塘，该池塘爆发了甲藻赤潮，水体颜色呈暗红色，形成了以甲藻为优势的微藻群落结构。用浮游植物网浓缩收集池塘微藻群落样品，同时采集池塘水体灭菌处理后用以培养浓缩的池塘微藻样品。培养温度21～25℃，光照强度2500～4000lx、光暗周期为12h：12h，培养7～8d。再将培养的藻液在2216E固体培养基上进行划线培养，25～28℃培养24～36h，挑选不同形态的单菌落，分离纯化获得生长性能好的菌株。然后把菌株接种至营养肉汤培养基，28～30℃，180rpm进行摇床扩大培养24～36h。
从以上池塘分离获得优势甲藻—锥状斯氏藻。将之分别纯培养于两种培养液，一种为f/2培养基；另一种为池塘水灭菌后添加NaNO3 1.0～1.5g/L和K2HPO4 30～40mg/L配制而成。培养条件基本相同，温度21～28℃、光照强度2500～4000lx、光暗周期为12h：12h，培养7～10d。
把不同的菌液分别添加到锥状斯氏藻的纯培养藻液中，菌藻共培养10d，初始藻细胞密度为2×104cell/mL，菌浓度107cfu/mL。显微镜检测和计数藻细胞的动态变化情况，筛出可使藻细胞破碎的高效菌株JZBC1，它在第6～10d时完全溶解锥状斯氏藻。经分子生物学方法和生化方法鉴定菌株JZBC1为蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1。
实施例2 溶解池塘甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1的鉴定
本发明对具有溶解颤藻作用的藻际溶藻菌株JZBC1进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平，并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。16S rDNA序列分析主要按照以下步骤：
1、细菌基因组DNA的提取：
(1)用无菌牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养；
(2)取细菌培养液1.5mL，10000rpm(11,500×g)离心1分钟，尽量吸净上清；
(3)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，加入180μL终浓度为20mg/mL的溶菌酶，37℃处理30分钟以上；
(4)向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；
(5)加入220μL缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
(6)加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
(7)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(8)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(9)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；
(10)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(11)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中；
(13)DNA浓度及纯度检测
回收得到的DNA片段用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
2、16S rDNA基因的PCR扩增
16S rDNA的扩增所采用的细菌通用引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司公司合成，正向引物(8f)为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物(1492r)为：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。50μL PCR反应体系包括：灭菌双蒸水37μL，引物各1μL，dNTPs(2.5mmol/L)，Tap酶1μL，10×PCR buffer 5μL，DNA模板1μL。PCR反应条件：95℃3min，95℃1min，48℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃10min。
3、16S rDNA序列测定
扩增结束，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，送英潍捷基(上海)贸易有限公司公司测序。测得其序列：
4、甲藻溶藻菌JZBC1的菌落形态、生理特征
甲藻溶藻菌株JZBC1的菌落形态、生理特征见下表1。
表1 甲藻溶藻菌株JZBC1菌落形态、生理特征
4、甲藻溶藻菌株JZBC1的鉴定
将溶藻菌株JZBC1长度为1381bp的16S rDNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对分析，溶藻菌株JZBC1为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。利用梅里埃VITEK2Compact全自动细菌鉴定***鉴定和Biolog MicroStation TM System细菌鉴定***分别进行菌株生化特性鉴定，结果均显示该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)或苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)。
综合16S rDNA基因序列分析、生化鉴定，以及形态特质等各项结果，认定JZBC1菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。查阅有关资料，尚无蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)对虾池优势甲藻—锥状斯氏藻具有溶藻作用的研究报道，它属于新的甲藻溶藻菌菌株。该菌株已于2016年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号：CCTCC No：M 2016081，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心。
实施例3 溶解池塘甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1的小规模应用
1、菌株的生长
将实施例1获得的菌株JZBC1按106CFU/mL接种至灭菌养殖池塘水中，12～120h期间的菌浓度稳定在108CFU/mL～109CFU/mL数量水平，菌株JZBC1的生长曲线如图1中所示。
2、菌株对锥状斯氏藻的影响
将无菌锥状斯氏藻按1.0×104cell/mL接种至f/2培养基培养，加菌组的JZBC1初始菌浓度为105CFU/mL～107CFU/mL，对照组不加JZBC1菌液。置于23℃、光照强度2 500lx、光暗周期12h:12h下培养，每天定时摇动培养瓶防止藻细胞贴壁。每2d取样监测藻细胞数量。结果显示，加菌组藻细胞死亡率第2d时达到73.8％，第6d时为98.2％，第10d藻细胞完全被溶解；对照组的藻细胞数量未受任何影响，第10d时数量为2.9×104cell/mL。
3、菌株对锥状斯氏藻—蛋白核小球藻、锥状斯氏藻—条纹小环藻共培养藻环境的影响
将锥状斯氏藻分别与条纹小环藻、蛋白核小球藻进行混合置于f/2培养基中培养，三种微藻的初始藻细胞数量均为104cell/mL。培养条件为温度23℃、光照强度2 000lx、光暗周期12h:12h，每天定时摇动培养瓶防止藻细胞贴壁。起始时JZBC1的菌浓度为105CFU/mL～107CFU/mL，对照组不加JZBC1。每2d取样监测藻细胞数量。结果显示：培养10d后，锥状斯氏藻—蛋白核小球藻的加菌组中锥状斯氏藻细胞数量为10cell/mL～40cell/mL，蛋白核小球藻的细胞数量大幅升高至1.0×107cell/mL～1.2×107cell/mL，而对照组的锥状斯氏藻细胞数量依然稳定在104cell/mL水平，蛋白核小球藻的细胞数量升高至9.8×106cell/mL～1.1×107cell/mL.。
培养10d后，锥状斯氏藻—条纹小环藻的加菌组中锥状斯氏藻细胞数量为10～60cell/mL，条纹小环藻的数量为3.3×103cell/mL～8.5×103cell/mL，而对照组的锥状斯氏藻细胞数量升高至5.3×104cell/mL～7.8×104cell/mL，条纹小环藻的数量升高至1.5×104cell/mL～6.0×104cell/mL。
可见，JZBC1菌的甲藻溶藻专一性较强，对锥状斯氏藻具有极好的溶解杀灭作用，对蛋白核小球藻、条纹小环藻等优良绿藻和硅藻没有明显的影响。
4、在锥状斯氏藻、蛋白核小球藻、条纹小环藻为优势种的条件下菌株对微藻群落环境的影响
在茂名电白对虾养殖基地，以对虾集约化养殖初期的池塘水体为本底，利用纯培养的锥状斯氏藻、蛋白核小球藻、条纹小环藻藻液调配水体微藻群落结构，将以上三种微藻的初始数量水平控制在1.0×104cell/mL～6.0×104cell/mL。加菌组的JZBC1(实施例1获得)初始菌浓度为104CFU/mL～105CFU/mL，对照组不加JZBC1。置于23℃、光照强度2 000lx、光暗周期12h:12h下培养，每天定时摇动培养瓶防止藻细胞贴壁。每2d取样监测藻细胞数量。结果显示，加菌组的锥状斯氏藻数量大幅降低至32cell/mL～50cell/mL，蛋白核小球藻的数量升高至7.9×106cell/mL～1.0×107cell/mL，条纹小环藻基本稳定在103cell/mL～104cell/mL数量水平。而对照组的锥状斯氏藻、蛋白核小球藻、条纹小环藻等优势种微藻数量均有不同程度的升高，分别为1.3×105cell/mL、1.2×107cell/mL、8.9×104cell/mL。
可见，科学应用JZBC1菌可有效抑制甲藻—锥状斯氏藻的生长，进而提高微藻群落环境中的小球藻、小环藻等优良绿藻和硅藻的生态优势，达到优化养殖水体微藻环境的效果。
本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

Claims (2)

1.一种溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1，其特征是：该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏名称为蜡样芽孢杆菌JZBC1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2016年3月3日，保藏编号：CCTCC No：M2016081。
2.权利要求1所述的溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1在溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻中的应用。
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溶藻细菌CZBC1调控虾池有害蓝藻优势度优化微藻群落的研究;王善龙;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20160215(第2期);全文 *

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