CN110317258A - 一种索玛鲁肽的新多肽片段及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽药物合成领域，具体涉及一种用于制备索玛鲁肽的带有保护基的多肽片段。该新多肽片段在合成索玛鲁肽中减少片段的杂质，提高最终产品的纯度。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物合成领域，具体涉及一种用于制备索玛鲁肽的带有保护基的多肽片段。该多肽片段在合成索玛鲁肽中减少缺失肽片段杂质和消旋杂质，提高最终产品的纯度。
技术背景
胰高血糖素样肽1(GLP-1)是人体胃肠道黏膜天然分泌的一种“肠促胰素”，可以与胰岛细胞上的受体结合并刺激胰岛素分泌，进而产生降低血糖的作用。GLP-1受体激动剂类降糖药物的优点在于低血糖事件的发生率明显低于胰岛素，而且可以减少食物摄取和延缓胃排空，有利于控制体重，可以保护胰岛β细胞功能。
索玛鲁肽(Sermaglutide)是一种新的长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，每周皮下注射一次，可使II型糖尿病患者血糖水平大幅改善，并且低血糖风险较低。于此同时，索玛鲁肽还能够通过降低食欲和减少食物摄入量，诱导减肥。此外，索玛鲁肽还能够显著降低II型糖尿病患者重大心血管事件风险。
索玛鲁肽是继利拉鲁肽(诺和诺德，2010/1/25)、阿必鲁肽(GSK，2014/4/15)、度拉鲁肽(礼来，2014/9/18)、艾塞那肽(AZ，2015/4/28)、和利西拉来(赛诺菲，2016/7/28)5个上市药物之后又一广受关注的GLP-1药物，并于2017年12月7日FDA批准了诺和诺德索玛鲁肽的上市申请。
索玛鲁肽的肽序结构如下：
目前关于索玛鲁肽的合成方法主要是用固相法逐个氨基酸偶联获得主链序列，然后再在20位Lys的侧链上逐个氨基酸接入或者片段接入。而关于索玛鲁肽片段合成方法的文献报道较少。专利WO2016046753报道了利用片段[1-4]、[5-31]、[5-16]、[17-31]、[5-12]和[13-16]来合成索玛鲁肽的主链序列，专利WO2016046753并未报道片段[1-4]的合成方法，其它片段主要是在树脂上固相合成获得，然后再与其他片段进行偶联。固相合成带有保护基的多肽片段并不能降低固相多肽合成法天然存在的高成本因素；获得的片段纯度低，不经过纯化直接与其他片段反应，带入产品的杂质也增多；用固相法逐个缩合氨基酸获得片段，每一次的缩合和脱保护工序繁琐，而且都会增加氨基酸消旋的可能，产生消旋杂质。尤其是用固相多肽合成法来逐步偶联氨基酸合成索玛鲁肽，在引入大位阻的氨基酸Aib后，对后面的His的偶联带来极大的挑战，空间位阻导致偶联效率降低相伴而产生缺失His的片段杂质，同时偶联效率而产生的就是组氨酸的高消旋化。这些原因都会导致产品得纯度和收率的下降，甚至不能生产出合格的产品。
发明内容
鉴于现有的索玛鲁肽制备方法存在的上述不足，本发明的目的在于提供了一种用于制备索玛鲁肽的带有保护基的新多肽片段。
术语说明：
侧链保护基团：指与氨基酸的侧链(即氨基酸通式H2N-C(R)(H)-COOH中的R基)偶联的化学部分，其有助于防止侧链的一部分与多肽合成、加工等步骤中使用的化学物质反应。
缩合剂：能引起缩合反应的试剂，在多肽合成中，尤指能促进氨基与羧基偶联形成肽键的试剂。
活化助剂：在多肽缩合反应中，能够协助缩合剂更好的促进缩合反应的试剂，如：抑制缩合反应中消旋杂质的产生、催化加快反应速度等。
本发明第一方面提供一种用于制备索玛鲁肽的新多肽片段，该片段具有如下结构：
R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-R
其中，R1选自Fmoc、Boc、Dde或Cbz；R2选自H、Fmoc、Boc、Mmt或Mtt；R选自OH、F、Cl、Br、I、CN、-OSu。
优选地，上述多肽片段R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-R选自：
R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH
或R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl
或R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu
更优选地，所述多肽片段选自Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc-His-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu、Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl。
本发明第二方面提供一种多肽片段R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH的制备方法，其采用液相缩合的方法获得，具体包括以下步骤：
(1)将Cbz-Glu(OtBu)-OH和甘氨酸甲酯盐酸盐溶于四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺和活化助剂1-羟基苯并三氮唑(HOBt)，室温搅拌反应18小时。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe。
(2)取Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe溶于含少量HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应。反应结束，过滤除去催化剂，滤液直接进行下一步反应。
(3)向上一步滤液中加入Cbz-Aib-OH、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU)和N,N-二异丙基乙胺室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，柱层析后获得Cbz-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OMe。
(4)上述产物溶于含少量HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应。反应结束，过滤除去催化剂，滤液旋干。将残留物溶于四氢呋喃，然后加入1mol/L的NaOH溶液，冰浴下反应1小时，反应结束后用冰乙酸调节PH到中性，减压旋蒸，用甲苯减压蒸馏除水。
(5)将浓缩物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入R1-His(R2)-OH、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU)和N,N-二异丙基乙胺(室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，柱层析后获得R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH多肽片段。
本发明第三方面提供一种多肽片段R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu的制备方法，其采用液相缩合的方法获得，具体包括以下步骤：
将R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH和N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)溶于四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(DCC)，室温搅拌反应18小时。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，经柱层析后获得R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu。
本发明第四方面提供一种所述的多肽片段R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl的制备方法，其采用液相缩合的方法获得，具体包括以下步骤：
将式Ⅰ所示的化合物R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH溶于二氯甲烷中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺，冰浴下加入氯化亚砜，搅拌15分钟后撤掉冰浴升温至室温反应。反应结束，减压旋蒸蒸干二氯甲烷和氯化亚砜；经硅胶柱层析后得到产物R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl片段。
本发明所提供的新多肽片段，可以在每步合成中进行纯化和控制，减少片段的杂质，提高纯度，将片段引入索玛鲁肽后也可提高最终产品的纯度。其充分利用了不含手性的甘氨酸(Gly)中羧基的优势；将His、Glu与Aib液相偶联在一起后接入主链，降低了在固相中逐步偶联His和Glu的消旋化程度，保证了每批次间的重现性；在液相中偶联His比在固相上偶联消旋程度降低，提高大位阻氨基酸Aib之后His的偶联效率，降低了整个索玛鲁肽的生产成本。
本发明的片段缩合法引入索玛鲁肽分子氮端的四个氨基酸，就增加了一次对于易消旋氨基酸(组氨酸等)的中控机会，把固相缩合后对氨基酸消旋化的被动检测变成了固相缩合前对所使用的带有保护基的多肽片段纯度(包括消旋化程度)的主动质量控制，同时避免或降低了[D-His1]-索玛鲁肽、[Des His1]-索玛鲁肽、[Des Gly4]-索玛鲁肽、[+Gly4]-索玛鲁肽杂质的产生，这样对于提高糖尿病治疗药物索玛鲁肽的产品质量会有极大的帮助。
在本发明中，所述Cbz是指苄氧羰基；所使用的试剂均为常规试剂，所使的原料也均为常规化学原料，均可以通过商业购买或按照已公开的现有文献制备得到。例如Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂均可以从吉尔生化有限公司购买得到。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步说明。但是应当理解，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。在本文中，除非另外说明，其中：(i)温度以摄氏度(℃)表示，操作在室温环境下进行，所述室温一般是指15-30℃，优先15-25℃，更优选15-20℃。(ii)含量及收率“％”均为质量百分比。(iii)产物纯度％均为高效液相色谱纯度HPLC。
实施例1、Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH的制备
将Cbz-Glu(OtBu)-OH(67.5g，200mmol)和甘氨酸甲酯盐酸盐(25.1g，200mmol)溶于550ml四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(45.4g，220mmol)和HOBt(40.5g，300mmol)，室温搅拌反应18小时。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe(76.6g，93.8％)，Ms＝408.19(M+H+)。
取Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe(75g，183.6mmol)溶于600ml含11.4ml HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应。反应结束，过滤除去催化剂，滤液直接进行下一步反应。
向上一步滤液中加入Cbz-Aib-OH(43.6g，183.6mmol)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU，157.3g，367.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(71.2g，550.8mmol)室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，柱层析后获得Cbz-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OMe(84.3g，93％)Ms＝493.24(M+H+)。
取Cbz-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OMe(80g，162.1mmol)溶于800ml含10.1ml HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应。反应结束，过滤除去催化剂，滤液旋干。将残留物溶于800ml四氢呋喃，然后加入1mol/L NaOH溶液180ml，冰浴下反应1小时，反应结束后用冰乙酸调节PH到中性，减压旋蒸，用甲苯减压蒸馏除水，得到浓缩物Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH。
将上述浓缩物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入Fmoc-His(Boc)-OH(77.4g，162.1mmol)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU，146.6g，342.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(62.9g，486.3mmol)室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，柱层析后获得Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH(118.2g，收率90.6％)，Ms＝804.37(M+H+)。
实施例2、Boc-His-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu的制备
将Cbz-Glu(OtBu)-OH(50.6g，150mmol)和甘氨酸甲酯(18.8g，150mmol)溶于500ml四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(34g，165mmol)和HOBt(30.4g，225mmol)，室温搅拌反应18小时。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe(57.2g，93.3％)。Ms＝408.19(M+H+)。
取Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe(56g，137.1mmol)溶于500ml含8.5ml HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应。反应结束，过滤除去催化剂，滤液直接进行下一步反应。
向上一步滤液中加入Cbz-Aib-OH(32.5g，137.1mmol)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU，117.4g，274.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(53.2g，411.3mmol)室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，柱层析后获得Cbz-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OMe(63.3g，93.5％)Ms＝493.24(M+H+)。
取Cbz-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OMe(60g，121.6mmol)溶于600ml含7.6ml HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应。反应结束，过滤除去催化剂，滤液旋干。将残留物溶于600ml四氢呋喃，然后加入1mol/L NaOH溶液135ml，冰浴下反应1小时，反应结束后用冰乙酸调节PH到中性，减压旋蒸蒸干，得到浓缩物Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH。
将上述浓缩物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入Boc-His-OH(31g，121.6mmol)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU，104.2g，243.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(47.2g，486.3mmol)室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸后经硅胶柱层析获得Boc-His-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH(64.6g，91.1％)Ms＝583.31(M+H+)。
将上述的Boc-His-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH(60g，102.8mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(HOSu，11.8g，102.8mmol)溶于550ml四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(DCC，21.2g，102.8mmol)，室温搅拌反应18小时。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Boc-His-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu(62.2g，收率89.4％)。Ms＝676.34(M+H+)。
实施例3、Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH的制备
称取Cbz-Glu(OtBu)-OH(16.9g，50mmol)和甘氨酸甲酯(6.3g，50mmol)溶于150ml四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(11.4g，55mmol)和HOBt(10.1g，75mmol)，室温搅拌反应18小时。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe(18.9g，92.4％)。Ms＝408.19(M+H+)。
取Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe(16g，39.2mmol)溶于150ml含2.4ml HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应。反应结束，过滤除去催化剂，滤液直接进行下一步反应。
向上一步滤液中加入Cbz-Aib-OH(9.3g，39.2mmol)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU，33.6g，78.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(15.2g，117.6mmol)室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾水溶液、5％的碳酸钠水溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，柱层析后获得Cbz-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OMe(18.1g，93.4％)Ms＝493.24(M+H+)。
取Cbz-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OMe(17g，34.5mmol)溶于200ml含2.1ml HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应。反应结束，过滤除去催化剂，滤液旋干。将残留物溶于200ml四氢呋喃，然后加入1mol/L NaOH溶液38ml，冰浴下反应1小时，反应结束后用冰乙酸调节PH到中性，减压旋蒸，用甲苯减压蒸馏除水，得到浓缩物Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH。
将上述浓缩物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入Fmoc-His(Fmoc)-OH(20.1g，34.5mmol)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU，31.1g，34.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(13.4g，103.5mmol)室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，硅胶柱层析后获得Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH(28.8g，收率90％)。Ms＝926.39(M+H+)。
实施例4、Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl的制备
称取Cbz-Glu(OtBu)-OH(33.8g，100mmol)和甘氨酸甲酯(12.6g，100mmol)溶于300ml四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(22.8g，110mmol)，室温搅拌反应18小时。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得CbZ-Glu(OtBu)-Gly-OMe(36.9g，90.4％)。Ms＝408.19(M+H+)。
取Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe(35g，85.8mmol)溶于350ml含5.3ml HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应。反应结束，过滤除去催化剂，滤液直接进行下一步反应。
向上一步滤液中加入Cbz-Aib-OH(20.4g，85.8mmol)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU，73.6g，171.6mmol)和N,N-二异丙基乙胺(33.3g，257.4mmol)室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，柱层析后获得Cbz-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OMe(39.9g，94.1％)Ms＝493.24(M+H+)。
取Cbz-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OMe(36g，73.1mmol)溶于400ml含4.5ml HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应。反应结束，过滤除去催化剂，滤液旋干。将残留物溶于400ml四氢呋喃，然后加入1mol/L NaOH溶液80.6ml，冰浴下反应1小时，反应结束后用冰乙酸调节PH到中性，减压旋蒸，用甲苯减压蒸馏除水，得到浓缩物Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH。
将上述浓缩物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入Fmoc-His(Fmoc)-OH(42.6g，73.1mmol)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU，62.6g，146.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(28.3g，219.3mmol)室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸后经硅胶柱层析获得Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH(60.5g，收率89.3％)。Ms＝926.39(M+H+)。
将上述Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH(50g，53.9mmol)溶于500ml二氯甲烷中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺，冰浴下加入氯化亚砜(4.3ml，59.3mmol)，搅拌十五分钟后撤掉冰浴，升温至室温反应。反应结束，减压旋蒸蒸干二氯甲烷和氯化亚砜。纯化后得到产物Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl(45.1g，收率88.4％)。Ms＝945.36。
实施例5、侧链全保护索玛鲁肽[5-31]肽-树脂的制备
称取Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂33.3g(荷载量0.3mmol/g,10mmol)加入固相反应器中，加入20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(分子量：648.8,30mmol)19.5g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1,30mmol)3.9g溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2,30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤3次。重复以上步骤，按照索玛鲁肽序逐一与相应Fmoc保护氨基酸偶联，保护氨基酸和缩合剂当量与前述Fmoc-Arg(Pbf)-OH相同；依次连接的保护氨基酸为：
Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH制得侧链全保护索玛鲁肽[5-31]肽-树脂，其结构如下：
Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(EAAE-AEEA-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-2-chlorotrityl树脂。
实施例6、侧链全保护索玛鲁肽[5-31]肽-树脂的制备
称取Fmoc-Gly-Wang树脂25.0g(荷载量0.4mmol/g,10mmol)加入固相反应器中，加入20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(分子量：648.8,30mmol)19.5g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1,30mmol)3.9g溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2,30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤3次。重复以上步骤，按照索玛鲁肽序逐一与相应Fmoc保护氨基酸偶联，保护氨基酸和缩合剂当量与前述Fmoc-Arg(Pbf)-OH相同；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH，制得侧链全保护索玛鲁肽[5-31]肽-树脂，其结构如下：
Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-EAAE-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂。
实施例7、侧链全保护索玛鲁肽前体2肽树脂的制备
取实施例5制备的索玛鲁肽[5-31]肽-树脂，加入固相反应器中，加入20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将实施例1制备的Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH(分子量：805.89,30mmol)24.2g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1,30mmol)3.9g溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2,30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤3次。制得侧链全保护索玛鲁肽前体2肽树脂，其结构如下：
Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-EAAE-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-2-chlorotrityl树脂。
实施例8、侧链全保护索玛鲁肽前体2肽树脂的制备
取实施例6制备的索玛鲁肽[5-31]肽-树脂，加入固相反应器中，加入20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将实施例2制备的Boc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu(分子量：780.84,30mmol)23.4g溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺，再加入N,N-二异丙基乙胺(N,N-二异丙基乙胺)(分子量：129.25，30mmol)5ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤3次。制得侧链全保护索玛鲁肽前体2肽树脂，其结构如下：
Boc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-EAAE-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂。
实施例9、侧链全保护索玛鲁肽前体2肽树脂的制备
取实施例5制备的索玛鲁肽[5-31]肽-树脂，加入固相反应器中，加入20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将实施例3制备的Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH(分子量：928.02,30mmol)27.8g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1,30mmol)3.9g溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2,30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤3次。制得侧链全保护索玛鲁肽前体2肽树脂，其结构如下：
Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-EAAE-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-2-chlorotrityl树脂。
实施例10、侧链全保护索玛鲁肽前体2肽树脂的制备
取实施例6制备的索玛鲁肽[5-31]肽-树脂，加入固相反应器中，加入20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将实施例4制备的Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl(分子量：946.46,30mmol)28.4g、溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺，再加入N,N-二异丙基乙胺(N,N-二异丙基乙胺)(分子量：129.25，30mmol)5ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤3次。制得侧链全保护索玛鲁肽前体2肽树脂，其结构如下：
Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-EAAE-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂。
实施例11、侧链全保护索玛鲁肽-树脂的制备
配制脱保护试剂：称取3.47g Pd(PPh3)4(分子量：1155.6,3mmol)溶于150ml二氯甲烷中，再加入PhSiH3 12.3ml(分子量：108.2,100mmol)，混合均匀。
将配制好的脱保护试剂加入实施例7制备的前体2肽树脂中，室温反应30min，然后抽滤，重复加脱保护试剂反应30min。反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。将十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu(分子量：555.8,30mmol)16.7g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1,30mmol)3.9g溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2,30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准。抽滤反应液，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。加入20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，脱除His的保护基，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂。
实施例12、侧链全保护索玛鲁肽-树脂的制备
配制脱保护试剂：称取3.47g Pd(PPh3)4(分子量：1155.6,3mmol)溶于150ml二氯甲烷中，再加入PhSiH3 12.3ml(分子量：108.2,100mmol)，混合均匀。
将配制好的脱保护试剂加入实施例8制备的前体2肽树脂中，室温反应30min，然后抽滤，重复加脱保护试剂反应30min。反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。将十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu(分子量：555.8,30mmol)16.7g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1,30mmol)3.9g溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2,30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准。抽滤反应液，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂。
实施例13、侧链全保护索玛鲁肽-树脂的制备
配制脱保护试剂：称取3.47g Pd(PPh3)4(分子量：1155.6,3mmol)溶于150ml二氯甲烷中，再加入PhSiH3 12.3ml(分子量：108.2,100mmol)，混合均匀。
将配制好的脱保护试剂加入实施例9制备的前体2肽树脂中，室温反应30min，然后抽滤，重复加脱保护试剂反应30min。反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。将十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu(分子量：555.8,30mmol)16.7g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1,30mmol)3.9g溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2,30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准。抽滤反应液，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。加入20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，脱除His的保护基，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂。
实施例14、侧链全保护索玛鲁肽-树脂的制备
配制脱保护试剂：称取3.47g Pd(PPh3)4(分子量：1155.6,3mmol)溶于150ml二氯甲烷中，再加入PhSiH3 12.3ml(分子量：108.2,100mmol)，混合均匀。
将配制好的脱保护试剂加入实施例10制备的前体2肽树脂中，室温反应30min，然后抽滤，重复加脱保护试剂反应30min。反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。将十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu(分子量：555.8,30mmol)16.7g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1,30mmol)3.9g溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2,30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准。抽滤反应液，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。加入20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，脱除His的保护基，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂。
实施例15、索玛鲁肽粗品的制备
将实施例11制备的侧链全保护索玛鲁肽-树脂20g加入到500ml圆底烧瓶中；配制裂解试剂200ml，其中三氟乙酸192ml，三异丙基硅烷2ml，苯甲硫醚2ml，1,2-乙二硫醇2ml，水2ml，预冷至0℃；将裂解试剂加入所索玛鲁肽-树脂中，酸解反应温度在20分钟内升至25℃，并在此温度下反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液。在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入2L预冷却的***内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰***洗涤滤饼5次，真空干燥得到粗肽5.74g。粗肽收率92.6％。
实施例16、索玛鲁肽粗品的制备
将实施例13制备的侧链全保护索玛鲁肽-树脂40g加入到500ml圆底烧瓶中；配制裂解试剂400ml，其中三氟乙酸384ml，三异丙基硅烷4ml，苯甲硫醚4ml，1,2-乙二硫醇4ml，水4ml，预冷至0℃；将裂解试剂加入所索玛鲁肽-树脂中，酸解反应温度在20分钟内升至25℃，并在此温度下反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液。在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入4L预冷却的***内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰***洗涤滤饼5次，真空干燥得到粗肽11.5g。粗肽收率93％。
实施例17、索玛鲁肽粗品的纯化
称取实施例16制备的索玛鲁肽粗品粉末10.0g，采用适量水溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
高效液相色谱法进行纯化时的条件，色谱柱：以10um的八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子直径和长度为：50mm×250mm；流动相：0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液；洗脱的流速60ml/min；采用梯度洗脱，循环进样方式上样。将上述处理的样品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得索玛鲁肽三氟乙酸盐溶液。冷冻干燥得索玛鲁肽纯品3.25g，纯化收率32.5％，产品纯度为99.7％，[D-His1]-索玛鲁肽杂质小于0.1％。
Claims (6)
1.一种多肽片段，该片段具有如下结构：
R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-R
其中，R1选自Fmoc、Boc、Dde或Cbz；R2选自H、Fmoc、Boc、Mmt或Mtt；R选自OH、F、Cl、Br、I、CN、-Osu。
2.根据权利要求1所述的多肽片段，其特征在于，所述多肽片段选自：
R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH
或R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl
或R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu
3.根据权利要求1所述的多肽片段，其特征在于，所述多肽片段选自Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc-His-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu、Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl。
4.一种多肽片段R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将Cbz-Glu(OtBu)-OH和甘氨酸甲酯盐酸盐溶于四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺和活化助剂1-羟基苯并三氮唑，室温搅拌反应18小时；反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe；
(2)取Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe溶于含少量HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应；反应结束，过滤除去催化剂，滤液直接进行下一步反应；
(3)向上一步滤液中加入Cbz-Aib-OH、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，柱层析后获得Cbz-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OMe；
(4)上述产物溶于含少量HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应；反应结束，过滤除去催化剂，滤液旋干；将残留物溶于四氢呋喃，然后加入1mol/L的NaOH溶液，冰浴下反应1小时，反应结束后用冰乙酸调节PH到中性，减压旋蒸，用甲苯减压蒸馏除水；
(5)将浓缩物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入R1-His(R2)-OH、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺(室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，柱层析后获得R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH多肽片段。
5.一种多肽片段R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu的制备方法，其采用液相缩合的方法获得，具体包括以下步骤：
将R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH和N-羟基丁二酰亚胺溶于四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应18小时；反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，经柱层析后获得R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu。
6.一种所述的多肽片段R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl的制备方法，其采用液相缩合的方法获得，具体包括以下步骤：
将式Ⅰ所示的化合物R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH溶于二氯甲烷中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺，冰浴下加入氯化亚砜，搅拌十五分钟后撤掉冰浴升温至室温反应；反应结束，减压旋蒸蒸干二氯甲烷和氯化亚砜；经硅胶柱层析后得到产物R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl片段。
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