CN111153983B - 一种索玛鲁肽的半合成制备法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多肽合成的技术，属于药物化学技术领域。本发明提供了一种索玛鲁肽的制备方法，基于丝氨酸和苏氨酸的天然化学连接的方法(STL)，使得索玛鲁肽纯度高、收率高，反应步骤少，操作简单，有利于实现索玛鲁肽的规模化制备。

Description

一种索玛鲁肽的半合成制备法

技术领域

本发明涉及一种多肽合成的技术，属于药物化学技术领域。

背景技术

与其他上市的降糖药相比，索玛鲁肽在控制和维持血糖水平表现出更优的临床治疗效果，有望成为新一代主宰糖尿病药物市场的长效降糖药，所以找到一种高效、经济的索玛鲁肽的合成工艺尤其重要。

目前报道关于索玛鲁肽的合成方法主要采用固相合成(SPPS)的方法，固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应,便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。但是受保护氨基酸的使用与过量反应物的连续使用相结合，另外，固相多肽合成中每个氨基酸延长都需要充分的洗涤操作，使得该方法相对昂贵。另外，SPPS合成多肽期间二级结构的形成常常导致各个合成步骤的效率降低。杂质常常是在最终序列中失去一个或多个氨基酸的缺失肽。这些杂质由于和目标肽的极性相近可能难以与目标肽到达很好的分离，导致产物被缺失肽污染。

目前报道的合成索玛鲁肽的方法在脂肪链侧链合成过程中需要逐步偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸,由于侧链较长,致使空间位阻效应强，偶联反应难于进行,容易导致产品收率低的问题；另外，有报道的顺序偶联+片段合成索玛鲁肽的方法，虽然简化了连接脂肪链侧链的步骤，但是连接脂肪链侧链之前，索玛鲁肽26位Lys侧链需要特殊的保护剂基(Mmt、Alloc)进行保护，导致脱保护时也需要使用特殊的脱保护试剂(Pd(PPh₃)₄)或者多次重复的脱保护处理，导致收率大大降低，生产成本增加。

因此，目前需要对高效又经济的索玛鲁肽的制备方法进行深入研究。

发明内容

为了实现上述发明目的，本发明提供给以下技术方案：

一种索玛鲁肽的半合成制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，将下式化合物Ⅰ和Arg34GLP-1(11-37)(SEQNO:1)通过化学连接反应偶联、酸解得到化合物ⅡAib8,Arg34GLP-1(7-37)(SEQNO:2)；

步骤2，将化合物17-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七烷酸叔丁酯进行活化酯反应得到下列化合物Ⅲ；

步骤3，将化合物Ⅲ连接到化合物Ⅱ序列中26位Lys的侧链氨基，反应得到化合物Ⅳ；

步骤4，化合物Ⅳ进行脱保护、冰***沉淀、纯化、冻干、最终得到索玛鲁肽。

C端具有水杨醛酯(SAL)的肽片段与具有N端丝氨酸或苏氨酸残基(携带1,2-羟胺双官能团)的另一侧链未保护肽片段的化学选择性反应，以提供在连接位具有N，O-亚苄基缩醛结构的可分离中间体。无需纯化，N，O-亚苄基缩醛中间体可以通过简单的酸解转化为在连接位具有天然肽键的目标全长多肽产物。因此，本步骤使用的2个都是侧链未保护肽片段，却可专一性进行偶联反应产生目标化合物，无副反应物的产生。

在一种实施方案中，步骤1所述的化合物Ⅰ的合成步骤为：

步骤1-1，Boc-His(Trt)-Aib-Glu(otbu)-Gly-OH与水杨醛二甲缩醛在PyBOP、DIEA、0℃反应温度下偶联得到中间产物Boc-His(Trt)-Aib-Glu(otbu)-Gly-O-水杨醛二甲缩醛，即化合物0；

步骤1-2，对化合物0进行全脱保护、冰***沉淀、纯化后冻干，得到化合物Ⅰ。

在一种实施方案中，步骤1所述Arg34GLP-1(11-37)(SEQNO:1)来源于微生物发酵。

在一种实施方案中，步骤1所述的反应在醋酸吡啶的缓冲体系下进行，所述吡啶、醋酸摩尔比为1：0～120，优选为1：120；所述的反应温度在20-55℃进行，优选为40℃。

在一种实施方案中，步骤3所述反应在的硼酸缓冲体系中进行，pH范围为8～11，优选为pH为9.5；所述的缓冲体系中硼酸浓度为0.01mol/L～0.1mol/L，优选为0.05mol/L。

在一种实施方案中，步骤3所述化合物Ⅲ匀速滴加到化合物Ⅱ中。

在一种实施方案中，步骤3所述化合物Ⅲ在0.1～1小时内匀速滴加到化合物Ⅱ中，优选滴加时间为0.5小时。

当滴加速度过快，容易生成N端和26位Lys侧链氨基同时连上脂肪链侧链的副产物，不利于反应的转化；当滴加速度过慢，滴加时间增加，导致生产周期延长，增加生产成本。

在一种实施方案中，步骤4所述脱保护的方法为使用切割试剂处理，所述切割试剂为TFA、H₂O与TIPS一组或者TFA、TIS、H₂O与DODT一组。

在一种实施方案中，所述切割试剂TFA、H₂O与TIPS的体积比为95:2.5:2.5；所述切割试剂TFA、TIS、H₂O与DODT的体积比为92.5:2.5:2.5:2.5。

有益效果

实验结果证实，本发明提供的一种半合成工艺路线制备获得的索玛鲁肽纯度高，收率高，反应步骤少，操作简单，有利于实现索玛鲁肽的规模化制备。

1.本发明提供一种基于丝氨酸和苏氨酸的天然化学连接的方法(STL)，将C端为水杨醛(SAL)的四肽与N端为苏氨酸残基的肽骨架Arg34GLP-1(11-37)进行化学选择性连接，得到连接位具有N，O-亚苄基缩醛结构的中间体，通过简单的酸解可以转化为在连接位具有天然肽键的目标全长多肽产物[Aib8,Arg34GLP-1(7-37)]。这两步在同一容器体系中进行，无需纯化中间体，在最佳反应条件下两步反应产物转化率可达到85％。所述方法的特征在于其使用侧链未保护的肽片段，反应过程中不会导致氨基酸差向异构化、易于操作、转化迅速，并且在连接位形成Xaa-Ser和Xaa-Thr形式的天然肽键。该反应过程也不会产生失去一个或多个氨基酸的缺失肽，解决了产物被缺失肽污染的问题。

2.本发明中侧链活化酯在pH＝9.5的0.05mol/L硼酸缓冲溶液下化学选择性偶联到肽骨架[Aib8,Arg34GLP-1(7-37)](SEQNO:2)中氨基酸序列26位Lys的侧链氨基上。反应时间为0.5小时，产物转化率为95％。此步骤无需对Lys侧链氨基进行特殊的化学试剂保护以及多次重复的脱保护处理，解决了逐步偶联侧链上的每个基团，致使空间位阻效应强,偶联反应难于进行,导致产品收率低的问题。该方法大大简化了工艺流程,缩短合成周期,减少废液的产生,副产物少,产品收率高,降低生产成本,有利于索玛鲁肽的大规模工业化生产。

3.本发明的策略可促进多肽蛋白类药物的化学合成。丝氨酸和苏氨酸在蛋白中丰度共占据12.7％的含量，许多多肽蛋白类药物内部也含有丰富的丝氨酸和苏氨酸残基。使用重组基因技术或者线性SPPS技术制备得到小肽片段(＜20个氨基酸)，然后将本发明中丝氨酸和苏氨酸的化学连接(STL)策略应用于2个甚至更多肽片段的偶联，合成步骤少，产物转化率高，因此可以显著降低中等大小(20～100个氨基酸)的多肽蛋白类药物的生产成本，从而有利于多肽蛋白类药物的规模化生产。

附图说明

图1本发明索玛鲁肽的半合成工艺路线；

图2实施例2制备的化合物Ⅰ的MAIDI-TOF质谱图；

图3实施例2制备的化合物Ⅰ的分析型液相图；

图4实施例3中反应液酸解的分析型液相图；

图5实施例4制备的化合物Ⅱ的MAIDI-TOF质谱图；

图6实施例4制备的化合物Ⅱ的分析型液相图；

图7实施例6中反应液的分析型液相液图；

图8实施例7制备的化合物Ⅳ的MAIDI-TOF质谱图；

图9实施例7制备的化合物Ⅳ的分析型液相图；

图10实施例9制备的索玛鲁肽的MAIDI-TOF质谱图；

图11实施例9制备的索玛鲁肽的分析型液相图；

具体实施方式

本发明中一些常用的缩写具有以下含义：

(1)NCL：天然化学连接

(2)STL:丝氨酸/苏氨酸结扎反应

(3)Pyridine:吡啶

(4)AcOH:乙酸

(5)mol:摩尔

(6)TFA:三氟乙酸

(7)MeCN:乙腈

(8)H₂O:水

(9)TIPS:三异丙基硅烷

(10)Boc:叔丁基氧基羰基

(11)Trt:三苯甲基、三苯基甲基

(12)Otbu:叔丁基酯

(13)PyBOP:六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷

(14)DIEA/DIPEA:N,N-二异丙基乙胺

(15)Aib:2-甲基丙氨酸

(16)SAL:水杨醛

(17)GLP-1:胰高血糖素样肽

(18)Lys:赖氨酸

(19)Arg：精氨酸

(20)Mmt：对苯二甲酸单甲酯

(21)Alloc：烯丙基羧基

(22)Pd(PPh3)：四(三苯基膦)钯

(23)DMF：N,N-二甲基甲酰胺

(24)DCM：二氯甲烷

(25)HSTU：N,N,N',N'-四甲基脲-O-(N-琥珀酸亚胺基)六氟磷酸盐

(26)THF：四氢呋喃

根据权利要求所包含的内容举例说明

为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案,下面结合实施例,进一步阐述本发明。

图1为本发明索玛鲁肽的半合成工艺路线。

实施例1化合物Ⅰ粗品的制备

分别称取Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-OH(商业化购买：购买自吉尔生化(上海)，1g，1.213mmol),水杨醛二甲缩醛(407.8mg,，2.426mmol),PyBOP(946.8mg，1.8195mmol),用50mLDMF进行溶解，冰水浴的条件下加入600uLDIEA(3.639mmol)，0℃磁力搅拌20小时。通过液相检测反应是否完全转化。反应结束后，对反应溶液进行减压下浓缩，加入DCM重新溶解，用饱和盐水洗涤三次，将收集的DCM溶液放入一定量无水硫酸钠进行干燥，静置0.5小时，抽滤，收集滤液抽干，得1.89g化合物0粗品，待用。

取上述化合物0全部样品，加入50mL切割试剂(TFA/H₂0/TIPS，95:2.5:2.5，v/v/v)，室温磁力搅拌2小时。反应结束后，将反应液浓缩到15mL体积，缓慢滴加到100ml冰***中进行沉淀，离心，无水***洗涤2次，真空干燥，得到固体1.12g，即化合物Ⅰ。

实施例2化合物Ⅰ粗品的纯化

称取实施例1制得的化合物Ⅰ粗品500mg，加入15mL蒸馏水进行溶解，采用Water1525***进行半制备纯化，波长为214nm，色谱柱为20×250mm反相C₁₈柱，柱温为37℃，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和含有0.1％TFA的乙腈(B相)，流速为8ml/min，梯度：B％：20％-60％，30min，收集目的组分，对收集液进行减压浓缩。

采用MAIDI-TOFMS进行检测，结果见图2，MAIDI-TOFMS计算C₂₄H₃₀N₆O₈理论分子量[M+H]⁺m/z＝531.220,[M+Na]⁺＝553.202，观察到:531.098，553.081。对上述浓缩液进行冻干，得到195mg化合物Ⅰ，形状为白色固体粉末，收率为80％。对纯品进行分析型液相分析(使用液相条件1)，结果如图3所示，经解析，其纯度为90％。

实施例3化合物Ⅱ的合成

分别称取化合物Ⅰ(50mg，0.094mmol)，Arg34GLP-1(11-37)(150mg，0.05mmol)，用100ul醋酸吡啶缓冲溶液(醋酸：吡啶，mol:mol，120：1)进行溶解，35℃磁力搅拌反应20小时。通过吹干除去溶剂，然后使用10mL酸解液(TFA/水，75/25，v/v)对残余物进行酸解，室温下磁力搅拌2小时。通过吹干除去溶剂，冻干，得到反应混合物230mg。对反应混合物进行分析型液相分析(使用液相条件：采用安捷伦1260***进行液相分析，波长214nm，色谱柱为4.6×250mm的反相C18柱，柱温为35℃，流动相为0.1％的水(A相)和0.1％的乙腈(B相)，流速为1mL/min，梯度：B％：30％-45％，0-20min。)，结果如图4所示，经解析，反应液混合物中产物的保留时间为14.936min，产物转化率为85％。产物即为化合物Ⅱ[Aib8,Arg34GLP-1(7-37)]粗品。

实施例4化合物Ⅱ[Aib8,Arg34GLP-1(7-37)]粗品的纯化

称取实施例3制备得到的直链肽[Aib8,Arg34GLP-1(7-37)]化合物Ⅱ(SEQNO:2)粗品40mg，用乙腈和水混合溶液(1/1，v/v)进行溶解，采用Water1525***进行半制备纯化，波长214nm，色谱柱为20×250mm反相C18柱，柱温为37℃，流动相为0.1％的水(A相)和0.1％的乙腈(B相)，流速为8ml/min，梯度：B％：36％-54％，30min，收集目的组分，对收集液进行减压浓缩。

采用MAIDI-TOFMS进行检测，结果见图5，MAIDI-TOFMS计算C₁₅₂H₂₃₀N₄₂O₄₇理论分子量[M+H]⁺m/z＝3,396.698，观察到:3,397.006。对上述浓缩液进行冻干，得到14mg化合物Ⅱ，形状为白色固体粉末，收率为45％。对纯品进行分析型液相分析(使用液相条件：采用安捷伦1260***进行液相分析，波长214nm，色谱柱为4.6×250mm的反相C18柱，柱温为35℃，流动相为0.1％的水(A相)和0.1％的乙腈(B相)，流速为1mL/min，梯度：B％：20-55％-90％-90％-20％-20％，0-10-20-25-26-35min。)，结果如图6所示，经解析，其纯度为95％。

实施例5化合物Ⅲ的制备

分别称取17-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七烷酸叔丁酯(3.88g，4.58mmol)，HSTU(3.30g，9.17mmol)，用350mLTHF进行溶解，再加1.5mLDIPEA(1.18mg，9.17mmol)，室温下磁力搅拌4小时。通过分析型液相检测反应是否完全转化。反应结束后，对反应溶液进行减压浓缩，加入DCM重新溶解，用饱和盐水洗涤三次，将收集的DCM溶液放入一定量无水硫酸钠进行干燥，静置0.5小时，抽滤，得样品4.7147g，收率为121％。产物即为化合物Ⅲ

实施例6化合物Ⅳ的合成

称取直链肽[Aib8,Arg34GLP-1(7-37)]化合物Ⅱ(SEQNO:2)(60mg，17.1umol)溶于6mLH₃BO₃硼酸溶液(0.05mol，pH＝9.5)和3mL乙腈，室温磁力搅拌，通过注射泵在0.5小时内向上述溶液匀速滴加3mL含有实施例8制备得到的化合物Ⅲ的乙腈溶液(10umol/mL)。通过液相检测反应是否完全转化。反应结束后，通过分析液相(液相条件：采用安捷伦1260***进行液相分析，波长214nm，色谱柱为4.6×250mm的反相C18柱，柱温为35℃，流动相为0.1％的水(A相)和0.1％的乙腈(B相)，流速为1mL/min，梯度：B％：20-55％-90％-90％-20％-20％，0-10-20-25-26-35min。)检测反应产物转化情况，结果如图7所示，产物的保留时间为15.623min，产物转化率为95％。然后对反应溶液进行减压下浓缩，冻干，得到粗品120mg，等待纯化。

实施例7化合物Ⅳ的纯化

称取上述实施例6制备得到的粗品12mg，用1mL乙睛和水的混合溶剂(3/1，v/v)进行溶解，采用Waters1525***进行半制备纯化，波长214nm，色谱柱为10×250mm的反相C18柱，柱温为37℃,流动相为0.1％的水(A相)和0.1％的乙腈(B相)，流速为8ml/min，梯度：B％：55％-70％，30min，收集目的组分，减压浓缩。

采用MAIDI-TOFMS进行检测，结果见图8，MAIDI-TOFMS计算理论分子量C₁₉₅H₃₀₇N₄₅O₅₉[M+H]⁺m/z＝4,224.248，观察到:4,224.476。对上述浓缩液进行冻干，得到3mg化合物Ⅳ，收率为50％。对化合物Ⅳ纯品进行分析型液相分析(使用液相条件：采用安捷伦1260***进行液相分析，波长214nm，色谱柱为4.6×250mm的反相C18柱，柱温为35℃，流动相为0.1％的水(A相)和0.1％的乙腈(B相)，流速为1mL/min，梯度：B％：20-55％-90％-90％-20％-20％，0-10-20-25-26-35min。)，结果如图9所示，经解析，其纯度为95％。产物即为化合物Ⅳ。

实施例8化合物Ⅳ的脱保护反应

称取3mg上述实例7制备得到的化合物Ⅳ(0.7umol)，加入0.5mL切割试剂(TFA/水/TIPS，95:2.5:2.5，v/v/v)，室温磁力搅拌2小时。反应结束后，将反应液缓慢滴加到20ml冰***中进行沉淀，离心，无水***洗涤2次，真空干燥，得到固体，等待纯化。

实施例9索玛鲁肽的纯化

取上述实施例8制备得到的粗品，用50％乙睛+50％水的混合溶剂1mL溶解，采用Waters1525***进行半制备纯化，波长214nm，色谱柱为10×250mm的反相C18柱，柱温为37℃,流动相为0.1％的水(A相)和0.1％的乙腈(B相)，流速为4ml/min，梯度：B％：42％-57％，30min，收集目的组分，减压浓缩。

采用MAIDI-TOFMS进行检测，结果见图10，MAIDI-TOFMS计算理论分子量C₁₈₇H₂₉₁N₄₅O₅₉[M+H]⁺m/z＝4,111.123,[M+2H]²⁺m/z＝2,056.566,观察到:4,112.857；2,056.969。对上述浓缩液进行冻干，得到2mg索玛鲁肽，产率为67％。对索玛鲁肽纯品进行分析型液相分析(使用液相条件：采用安捷伦1260***进行液相分析，波长214nm，色谱柱为4.6×250mm的反相C18柱，柱温为35℃，流动相为0.1％的水(A相)和0.1％的乙腈(B相)，流速为1mL/min，梯度：B％：20-55％-90％-90％-20％-20％，0-10-20-25-26-35min。)，结果见如图11所示，经解析，其纯度为98％。

序列表

<120> 一种索玛鲁肽的半合成制备法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25

Claims (12)

1.一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤1，将下式化合物Ⅰ和如SEQ NO:1所示的Arg34 GLP-1(11-37)通过化学连接反应偶联、酸解得到如SEQ NO:2所示的化合物ⅡAib8,Arg34 GLP-1(7-37)；

步骤2，将化合物17-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(羧基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七烷酸叔丁酯进行活化酯反应得到下列化合物Ⅲ；

步骤3，将化合物Ⅲ连接到化合物Ⅱ序列中26位Lys的侧链氨基，反应得到化合物Ⅳ；

步骤4，化合物Ⅳ进行脱保护、冰***沉淀、纯化、冻干、最终得到索玛鲁肽。

2.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，步骤1所述的化合物Ⅰ的合成步骤为：

步骤1-1，Boc-His(Trt)-Aib-Glu(otbu)-Gly-OH与水杨醛二甲缩醛在PyBOP、DIEA、0℃反应温度下偶联得到中间产物Boc-His(Trt)-Aib-Glu(otbu)-Gly-O-水杨醛二甲缩醛，即化合物0；

步骤1-2，对化合物0进行全脱保护、冰***沉淀、纯化后冻干，得到化合物Ⅰ。

3.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，步骤1所述如SEQ NO:1所示的Arg34 GLP-1(11-37)来源于微生物发酵。

4.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，步骤1所述反应在醋酸吡啶的缓冲体系下进行，所述吡啶、醋酸摩尔比为1：0～120；所述反应的温度在20-55℃进行。

5.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，步骤3所述反应在的硼酸缓冲体系中进行，pH范围为8～11；所述的缓冲体系中硼酸浓度为0.01mol/L～0.1mol/L。

6.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，步骤3所述反应中化合物Ⅲ匀速滴加到化合物Ⅱ中。

7.根据权利要求1或6所述的一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，步骤3所述反应中化合物Ⅲ在0.1～1小时内匀速滴加到化合物Ⅱ中。

8.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，步骤4所述脱保护的方法为使用切割试剂处理，所述切割试剂为TFA、H₂O与TIPS一组或者TFA、TIS、H₂O与DODT一组。

9.根据权利要求8所述的一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，所述切割试剂TFA、H₂O与TIPS的体积比为95:2.5:2.5；所述切割试剂TFA、TIS、H₂O与DODT的体积比为92.5:2.5:2.5:2.5。

10.根据权利要求1或4所述的一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，步骤1所述反应在醋酸吡啶的缓冲体系下进行，所述吡啶、醋酸摩尔比为1：120；所述反应的温度在35℃进行。

11.根据权利要求1或5所述的一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，步骤3所述反应在的硼酸缓冲体系中进行，pH范围为9；所述的缓冲体系中硼酸浓度为0.05mol/L。

12.根据权利要求1或6所述的一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，步骤3所述反应中化合物Ⅲ在0.5小时内匀速滴加到化合物Ⅱ中。

Images