CN109311961B - 一种索马鲁肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

一种索马鲁肽的合成方法，根据索马鲁肽的肽序结构，将二肽片段、三肽片段与具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸、Fmoc‑Gly‑树脂偶联，得到索马鲁肽树脂，经侧链修饰后裂解、纯化、冻干，即得。

Description

一种索马鲁肽的合成方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，具体涉及一种索马鲁肽的合成方法。
技术背景
随着社会的发展，世界范围内糖尿病的发病率呈明显增加的趋势，2000年曾估计为2.8％，到2025年预计为4.3％，糖尿病患者人数也将从2000年的1.71亿增加到2025年的3.8亿。糖尿病分为妊娠期糖尿病、特异性糖尿病、I型糖尿病和II型糖尿病。其中，II型糖尿病又名非胰岛素依赖型糖尿病，特点是人体自身能够产生胰岛素，但细胞无法对其作出反应，使胰岛素的效果大打折扣。针对II型糖尿病的降糖药种类很多，包括二甲双胍、磺脲类药物和胰高血糖样肽-1(GLP-1)的受体激动素等，GLP-1的受体激动素是近年来研究的热点。
索马鲁肽，人胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物中的一种，英文名为Semaglutide，是丹麦诺和诺德公司研制出的一种治疗2型糖尿病的药物，其作为一种每周使用一次的皮下注射剂，现处于III期临床试验阶段，能起到良好的降低血糖作用，并且可使2型糖尿病患者主要心血管事件风险降低。Semaglutide(序列如SEQ ID NO.1)的化学表达式如下：
His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(W)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
W＝N-(17-carboxy-1-oxoheptadecyl)-L-γ-glutamyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl
目前，索马鲁肽的合成，主要采用逐步偶联的方法。采用逐步偶联的方法进行索马鲁肽合成时，由于索马鲁肽的序列中有较多的疏水氨基酸，逐步偶联时树脂收缩严重，反应不完全，导致收率偏低，同时粗肽中与产品性质相近的杂质较多，纯化比较困难。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种方法更为合理、成本大大降低，并且适用于工业化生产的索马鲁肽的合成方法。通过本发明的方法，提高了粗肽的纯度和收率，有利于纯化，制备得到高纯度质量的索马鲁肽产品，并缩短了合成时间。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，包括如下步骤：
获得二肽片段、三肽片段；
获得Fmoc-Gly-树脂；
取所述二肽片段、所述三肽片段或其组合与具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸、所述Fmoc-Gly-树脂偶联得到索马鲁肽树脂，经侧链修饰后裂解或直接裂解、纯化、冻干，即得；
二肽片段为His-Aib、Aib-Glu、Glu-Gly、Gly-Thr、Thr-Phe、Phe-Thr、Thr-Ser、Phe-Ile、Ile-Ala、Ala-Trp、Trp-Leu、Leu-Val；
三肽片段为Gly-Thr-Phe、Thr-Phe-Thr、Phe-Thr-Ser、Thr-Ser-Asp、Ser-Asp-Val、Glu-Phe-Ile、Ile-Ala-Trp、Ala-Trp-Leu；
其中，首尾含相同氨基酸的肽片段不组合；
肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
具体地，包括如下步骤：
在活化试剂和偶联试剂的存在下，分别合成二肽片段、三肽片段的N端Fmoc保护且侧链保护的片段；
若有需要，液相合成
Fmoc-Lys({18-[N-(17-carboxyheptadecanoyl)-L-γ-glutamyl]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaoctade canoyl})；
在活化试剂的存在下，由树脂固相载体和N端Fmoc保护的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)偶联得到Fmoc-Gly-树脂；然后采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQ ID NO.1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次偶联N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸、二肽片段、三肽片段或其组合，得到索马鲁肽树脂，其中赖氨酸片段采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH或Fmoc-Lys({18-[N-(17-carboxyheptadecanoyl)-L-γ-glutamyl]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaoctade canoyl})；
赖氨酸片段采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH时，索马鲁肽树脂经侧链修饰、裂解、纯化、冻干，即得索马鲁肽；
赖氨酸片段采用
Fmoc-Lys({18-[N-(17-carboxyheptadecanoyl)-L-γ-glutamyl]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaoctade canoyl})时，索马鲁肽树脂经裂解、纯化、冻干，即得索马鲁肽。
本发明中二肽片段、三肽片段或其组合是指二肽片段、三肽片段以及它们的组合形成的四肽片段、五肽片段、六肽片段、七肽片段、八肽片段、九肽片段或十肽片段。
索马鲁肽主链氨基酸有31个，采用片段方法进行合成存在很多种形式，但只有合适的片段方法才能保证较高的索马鲁肽的总收率纯度，同时又能降低合成工艺的复杂程度。为此，申请人根据长期的试验研究以及氨基酸消旋情况，提出了本发明所述方法来合成索马鲁肽，有效抑制或消除了与产品性质极为相似的消旋杂质的产生，从而大大提高了纯化步骤的收率，同时可制备得到高纯度质量的索马鲁肽产品，在保证其总收率和纯度的前提下，降低合成方法的复杂程度。
作为优选，组合为His-Aib、Glu-Gly、Gly-Thr、Thr-Phe、Phe-Thr或Thr-Ser中的两者或两者以上二肽片段的组合；
His-Aib、Glu-Gly、Gly-Thr、Thr-Phe、Phe-Thr或Thr-Ser中的两者或两者以上二肽片段的组合具体为：
His-Aib和Glu-Gly的组合；
His-Aib和Gly-Thr的组合；
His-Aib和Thr-Phe的组合；
His-Aib和Phe-Thr的组合；
His-Aib和Thr-Ser的组合；
Glu-Gly和Thr-Phe的组合；
Glu-Gly和Phe-Thr的组合；
Glu-Gly和Thr-Ser的组合；
Gly-Thr和Phe-Thr的组合；
Thr-Phe和Thr-Ser的组合；
His-Aib、Glu-Gly和Thr-Phe的组合；
His-Aib、Glu-Gly和Phe-Thr的组合；
His-Aib、Glu-Gly和Thr-Ser的组合；
His-Aib、Gly-Thr和Phe-Thr的组合；
His-Aib、Gly-Thr和Phe-Thr的组合；
His-Aib、Thr-Phe和Thr-Ser的组合；
Glu-Gly、Thr-Phe和Thr-Ser的组合；
Gly-Thr、Thr-Phe和Thr-Ser的组合。
作为优选，组合为Phe-Ile、Ile-Ala、Trp-Leu或Ala-Trp中的两者或两者以上二肽片段的组合；
Phe-Ile、Ile-Ala、Trp-Leu或Ala-Trp中的两者或两者以上二肽片段的组合具体为：
Phe-Ile和Trp-Leu的组合；
Phe-Ile和Ala-Trp的组合；
Ile-Ala和Trp-Leu的组合；
Phe-Ile、Trp-Leu和Ala-Trp的组合；
Ile-Ala、Trp-Leu和Ala-Trp的组合；
作为优选，组合为Aib-Glu、Gly-Thr、Phe-Thr、Phe-Ile、Ala-Trp、Leu-Val中不少于三个二肽片段的组合；
Aib-Glu、Gly-Thr、Phe-Thr、Phe-Ile、Ala-Trp、Leu-Val中不少于三个二肽片段的组合具体为：
Aib-Glu、Gly-Thr和Phe-Thr的组合；
Aib-Glu、Gly-Thr和Phe-Ile的组合；
Aib-Glu、Gly-Thr和Ala-Trp的组合；
Aib-Glu、Gly-Thr和Leu-Val的组合；
Gly-Thr、Phe-Thr和Phe-Ile的组合；
Gly-Thr、Phe-Thr和Ala-Trp的组合；
Gly-Thr、Phe-Thr和Leu-Val的组合；
Phe-Thr、Phe-Ile、Ala-Trp的组合；
Phe-Thr、Phe-Ile、Leu-Val的组合；
Phe-Ile、Ala-Trp和Leu-Val的组合；
作为优选，组合为Aib-Glu、Glu-Gly、Thr-Phe、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe或Thr-Ser-Asp中至少包含一个三肽片段的组合。
Aib-Glu、Glu-Gly、Thr-Phe、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe或Thr-Ser-Asp中至少包含一个三肽片段的组合具体为；
Aib-Glu和Gly-Thr-Phe的组合；
Aib-Glu和Thr-Ser-Asp的组合；
Glu-Gly和Thr-Ser-Asp的组合；
Thr-Phe和Gly-Thr-Phe的组合；
Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Thr-Ser和Gly-Thr-Phe的组合；
Thr-Ser和Thr-Ser-Asp的组合；
Aib-Glu、Thr-Phe和Gly-Thr-Phe的组合；
Aib-Glu、Thr-Ser和Gly-Thr-Phe的组合；
Glu-Gly、Thr-Phe和Gly-Thr-Phe的组合；
Glu-Gly、Thr-Ser和Gly-Thr-Phe的组合；
Thr-Phe、Thr-Ser和Gly-Thr-Phe的组合；
Aib-Glu、Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Aib-Glu、Thr-Ser和Thr-Ser-Asp的组合；
Glu-Gly、Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Glu-Gly、Thr-Ser和Thr-Ser-Asp的组合；
Thr-Phe、Thr-Ser和Thr-Ser-Asp的组合；
Aib-Glu、Thr-Phe、Thr-Ser和Gly-Thr-Phe的组合；
Glu-Gly、Thr-Phe、Thr-Ser和Gly-Thr-Phe的组合；
Aib-Glu、Thr-Phe、Thr-Ser和Thr-Ser-Asp的组合；
Glu-Gly、Thr-Phe、Thr-Ser和Thr-Ser-Asp的组合；
Aib-Glu、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Aib-Glu、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Thr-Phe、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Thr-Phe、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Aib-Glu、Thr-Phe、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Aib-Glu、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Glu-Gly、Thr-Phe、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Glu-Gly、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Thr-Phe、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Aib-Glu、Thr-Phe、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Aib-Glu、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Glu-Gly、Thr-Phe、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Glu-Gly、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Thr-Phe、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Aib-Glu、Thr-Phe、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Glu-Gly、Thr-Phe、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Aib-Glu、Thr-Phe、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合；
Glu-Gly、Thr-Phe、Thr-Ser、Gly-Thr-Phe和Thr-Ser-Asp的组合。
作为优选，组合为Phe-Ile和Ala-Trp-Leu的组合。
作为优选，组合为Thr-Phe-Thr与His-Aib、Glu-Gly、或Ser-Asp-Val中的一者或两者以上的组合。
Thr-Phe-Thr与His-Aib、Glu-Gly、或Ser-Asp-Val中的一者或两者以上的组合具体为：
His-Aib和Thr-Phe-Thr的组合；
Glu-Gly和Thr-Phe-Thr的组合；
Thr-Phe-Thr和Ser-Asp-Val的组合；
His-Aib、Glu-Gly和Thr-Phe-Thr的组合；
His-Aib、Thr-Phe-Thr和Ser-Asp-Val的组合；
Glu-Gly、Thr-Phe-Thr和Ser-Asp-Val的组合；
His-Aib、Glu-Gly、Thr-Phe-Thr和Ser-Asp-Val的组合；
在索马鲁肽的制备过程中，当采用逐步偶联的方式偶联肽序主链中各个氨基酸或氨基酸衍生物时，由于索马鲁肽的序列中有较多的疏水氨基酸，逐步偶联时树脂收缩严重，反应不完全，进而影响收率，同时粗肽中与产品性质相近的杂质较多，纯化比较困难。本发明优选为以二肽、三肽片段或其组合的形式偶联，可以有效抑制树脂收缩，减少杂质产生，进而提高索马鲁肽的收率。
一些实施例中，赖氨酸片段采用
Fmoc-Lys({18-[N-(17-carboxyheptadecanoyl)-L-γ-glutamyl]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaoctade canoyl})，索马鲁肽主链树脂经裂解、纯化、冻干，即得索马鲁肽。
另外一些实施例中，赖氨酸片段采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH，索马鲁肽主链树脂经侧链修饰、裂解、纯化、冻干，即得索马鲁肽。索马鲁肽主链树脂侧链修饰的方法为：脱除肽树脂中Lys的侧链保护基团，与Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸单甲酯反应。
一些实施例中，获得Fmoc-Gly-王树脂时，所用的偶联剂为DIC/DMAP、HOBt/DIC/DMAP或PyBOP/HOBt/DIPEA。
另外一些实施例中，获得Fmoc-Gly-王树脂时，所用的偶联剂为HOBt/DIC/DMAP。
优选地，本发明提供的制备方法中，裂解的试剂为Anisole、EDT、DCM、H2O中的一者或两者以上的混合物与TFA的混合物。
优选地，本发明提供的制备方法中，试剂TFA、Anisole、EDT、DCM与H2O的体积比为(90～95)：(1～6)：(1～5)：(2～7)：(1～5)。
一些实施例中，多肽片段固相合成中采用的固相载体为Wang树脂或2-CTC树脂。
一些实施例中，索马鲁肽纯化所用方法为色谱分离法。
另外一些实施例中，索马鲁肽纯化所用色谱柱为C8柱子。
本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明通过Trt保护基保护组氨酸、谷氨酰胺的侧链；通过OtBu保护基保护谷氨酸、天冬氨酸的侧链；通过Boc保护色氨酸的侧链；通过tBu保护基保护苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸的侧链；通过Alloc保护赖氨酸的侧链；通过Pdf保护基保护精氨酸的侧链。此外，在本发明所述方法涉及的氨基酸中，氨基酸N端均优选通过Fmoc保护基进行保护，而组氨酸也可通过Boc保护基进行保护。
本发明提供了一种索马鲁肽的合成方法。该方法是通过将二肽片段、三肽片段或其组合与N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸、Fmoc-Gly-树脂偶联，得到索马鲁肽树脂，经侧链修饰后裂解或直接裂解、纯化、冻干，即得。利用本发明提供的方法合成索马鲁肽，由于在疏水氨基酸密集区域使用片段进行偶联，有效抑制或消除了与产品性质极为相似的消旋杂质的产生，从而大大提高了纯化步骤的收率，同时可制备得到高纯度质量的索马鲁肽产品；在索马鲁肽合成过程中，二肽片段、三肽片段、四肽片段、五肽片段或其组合与Gly-树脂的合成可同时进行，也缩短了一定的合成时间。由此可见，本发明提供的索马鲁肽的合成方法可提高粗肽的纯度和收率，有利于纯化，制备得到高纯度质量的索马鲁肽产品，并缩短了合成时间，适合工业化生产。
附图说明
图1示实施例33提供的HPLC图谱。
图2示实施例35提供的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的索马鲁肽的合成方法作进一步详细的说明以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
说明书和权利要求书中所使用的英文缩写具体含义如表1所示。
表1说明书和权利要求书中所使用的英文缩写具体含义
Figure BDA0001806577930000081
为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1Boc-His(Trt)-Aib-OH的制备
将Boc-His(Trt)-OH(49.8g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Boc-His(Trt)-ONb溶液。
将H-Aib-OH(10.3g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Boc-His(Trt)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用MeOH-H2O重结晶，离心干燥后得到Boc-His(Trt)-Aib-OH白色粉末状固体35.41g，纯度97.8％，收率59.4％。
实施例2.Fmoc-Aib-Glu(OtBu)-OH的制备
将Fmoc-Aib-OH(10.3g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Ala-ONb溶液。
将H-Glu(OtBu)-OH(20.36g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Ala-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用乙腈-H2O重结晶，PE研磨后得到Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-OH白色粉末状固体16.34g，纯度97.3％，收率55.1％。
实施例3.Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH的制备
将Fmoc-Glu(OtBu)-OH(42.56g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mLTHF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Glu(OtBu)-ONb溶液。
将H-Gly-OH(7.5g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Glu(OtBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用DCM-Et2O重结晶，PE研磨后得到Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH白色粉末状固体31.35g，纯度95.6％，收率62.1％。
实施例4.Fmoc-Gly-Thr(tBu)-OH的制备
将Fmoc-Gly-OH(29.74g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Gly-ONb溶液。
将H-Thr(tBu)-OH(17.6g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Gly-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用DCM-Et2O重结晶，过滤收集后得到Fmoc-Gly-Thr(tBu)-OH白色粉末状固体35.94g，纯度95.6％，收率63.1％。
实施例5.Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH的制备
将Fmoc-Thr(tBu)-OH(39.75g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mLTHF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液。
将H-Phe-OH(16.5g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用乙腈-H2O重结晶，过滤收集后得到Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH白色粉末状固体35.94g，纯度95.6％，收率63.14％。
实施例6.Fmoc-Phe-Thr(tBu)-OH的制备
将Fmoc-Phe-OH(38.7g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Phe-ONb溶液。
将H-Thr(tBu)-OH(17.6g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Phe-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-PE重结晶，过滤收集后得到Fmoc-Phe-Thr(tBu)-OH白色粉末状固体30.75g，纯度98.2％，收率55.4％。
实施例7.Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-OH的制备
将Fmoc-Thr(tBu)-OH(39.8g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mLTHF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液。
将H-Ser(tBu)-OH(16.1g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-EA-PE重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-OH白色粉末状固体31.02g，纯度98.2％，收率56.3％。
实施例8.Fmoc-Phe-Ile-OH的制备
将Fmoc-Phe-OH(38.7g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液。
将H-Ile-OH(13.1g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-EA-PE重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Phe-Ile-OH白色粉末状固体28.11g，纯度96.4％，收率54.2％。
实施例9.Fmoc-Ile-Ala-OH的制备
将Fmoc-Ile-OH(35.3g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液。
将H-Ala-OH(8.9g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-EA-PE重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Ile-Ala-OH白色粉末状固体27.43g，纯度96.3％，收率62.3％。
实施例10.Fmoc-Ala-Trp(Boc)-OH的制备
将Fmoc-Ala-OH(31.1g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液。
将H-Trp(Boc)-OH(30.4g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-EA-PE重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Ala-Trp(Boc)-OH白色粉末状固体35.99g，纯度97.2％，收率58.6％。
实施例11.Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH的制备
将Fmoc-Trp(Boc)-OH(52.7g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mLTHF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液。
将H-Leu-OH(13.1g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-EA-PE重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH白色粉末状固体34.79g，纯度98.6％，收率53.6％。
实施例12.Fmoc-Leu-Val-OH的制备
将Fmoc-Leu-OH(35.3g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液。
将H-Val-OH(11.7g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Thr(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-EA-PE重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Leu-Val-OH白色粉末状固体27.91g，纯度97.5％，收率60.2％。
实施例13.Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH的制备
将实施例4制得的Fmoc-Gly-Thr(tBu)-OH(45.54g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Gly-Thr(tBu)-ONb溶液。
将H-Phe-OH(16.5g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Gly-Thr(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用DCM-H2O重结晶，过滤收集后得到Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH白色粉末状固体36.72g，纯度96.8％，收率59.0％。
实施例14.Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-OH的制备
将实施例5制得的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH(54.45g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Thr(tBu)-Phe-ONb溶液。
将H-Thr(tBu)-OH(17.6g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Thr(tBu)-Phe-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-EA-PE重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-OH白色粉末状固体38.08g，纯度98.5％，收率53.4％。
实施例15.Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-OH的制备
将实施例6制得的Fmoc-Phe-Thr(tBu)-OH(54.5g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Phe-Thr(tBu)-ONb溶液。
将H-Ser(tBu)-OH(16.1g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Phe-Thr(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用MeOH-H2O重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-OH白色粉末状固体39.36g，纯度98.4％，收率56.3％。
实施例16.Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-OH的制备
将实施例7制得的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-OH(54.1g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-ONb溶液。
将H-Asp(OtBu)-OH(19.0g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用MeOH-H2O重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-OH白色粉末状固体43.95g，纯度97.5％，收率60.1％。
实施例17.Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-OH的制备
将Fmoc-Ser(tBu)-OH(38.3g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mLTHF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Ser(tBu)-ONb溶液。
将H-Asp(OtBu)-OH(19.0g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Ser(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用MeOH-H2O重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-OH。
按照上述操作，将H-Val-OH(11.7g，100mmol)和Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-OH(55.5g，100mmol)进行偶联，得到Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-OH白色粉末状固体40.77g，纯度96.9％，收率60.4％。
实施例18.Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OH的制备
将Fmoc-Glu(OtBu)-OH(42.5g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mLTHF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Glu(OtBu)-ONb溶液。
将H-Phe-OH(16.5g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Glu(OtBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，Et2O萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-PE重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OH白色粉末状固体。
按照上述操作，将H-Ile-OH(13.1g，100mmol)和Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OH(57.2g，100mmol)进行偶联，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OH白色粉末状固体37.95g，纯度97.3％，收率53.9％。
实施例19.Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-OH的制备
将实施例9制得的Fmoc-Ile-Ala-OH(42.4g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-ONb溶液。
将H-Trp(Boc)-OH(30.4g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用MeOH-H2O重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-OH白色粉末状固体43.15g，纯度97.4％，收率59.2％。
实施例20.Fmoc-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH的制备
将实施例10制得的Fmoc-Ala-Trp(Boc)-OH(59.7g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Ala-Trp(Boc)-ONb溶液。
将H-Leu-OH(35.3g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Ala-Trp(Boc)-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用MeOH-H2O重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH白色粉末状固体52.09g，纯度96.8％，收率54.1％。
实施例21.Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH的制备
称取替代度为0.5mol/g的2-CTC树脂100g，加入到固相合成仪反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后抽干，取实施例3制得的Boc-Glu(OtBu)-Gly-OH(48.2g，100mmol)用DMF溶解，加入上述装有树脂的反应柱中，再加入DIPEA(19.25mL，110mmol)，反应2小时后抽干，加入含有600mLDMF溶液，搅拌反应1小时，用DMF洗涤6次，得到Boc-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC树脂。
用每克树脂10mL 50％TFA/DCM溶液脱除Boc-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC树脂中的Boc保护基20分钟，然后用DMF洗涤6次，得到H-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC树脂。
取实施例1制得的Boc-His(Trt)-Aib-OH(70.4g，100mmol)和150mmol HOBt，用DMF溶解，搅拌下加入150mmol DIC，继续搅拌反应1小时，加入固相合成仪反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再延长偶联反应时间)，得到Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC树脂，用甲醇洗涤6次，树脂真空干燥过夜。
配置裂解液25％TFE/二氯甲烷溶液5L，将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液浓缩后加至5L***中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水***洗涤，并且真空干燥，得到Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH白色粉末状固体67.69g，纯度96.8％，收率56.1％。
肽片段的序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例22.Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-OH的制备
将实施例13制得的Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH(60.3g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-ONb溶液。
将H-Thr(tBu)-OH(17.6g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-PE重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-OH白色粉末状固体44.77g，纯度99.1％，收率58.3％。
肽片段的序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例23.Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-OH的制备
称取替代度为0.5mol/g的2-CTC树脂100g，加入到固相合成仪反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后抽干，取实施例10制得的Fmoc-Ala-Trp(Boc)-OH(59.7g，100mmol)用DMF溶解，加入上述装有树脂的反应柱中，再加入DIPEA(19.25mL，110mmol)，反应2小时后抽干，加入含有600mLDMF溶液，搅拌反应1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ala-Trp(Boc)-2-CTC树脂。
用每克树脂10mL20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc-Ala-Trp(Boc)-2-CTC树脂中的Fmoc保护基20分钟，然后用DMF洗涤6次，得到H-Ala-Trp(Boc)-2-CTC树脂。
取实施例8制得的Fmoc-Phe-Ile-OH(50.0g，100mmol)和150mmol HOBt，用DMF溶解，搅拌下加入150mmol DIC，继续搅拌反应1小时，加入固相合成仪反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再延长偶联反应时间)，得到Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC树脂，用甲醇洗涤6次，树脂真空干燥过夜。
配置裂解液25％TFE/二氯甲烷溶液5L，将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液浓缩后加至5L***中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水***洗涤，并且真空干燥，得到Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-OH白色粉末状固体65.70g，纯度98.7％，收率60.1％。
肽片段的序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例24.Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH的制备
将实施例19制得的Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-OH(71.0g，100mmol)和HONb(20.77g，116mmol)溶解在200mL THF中，冰浴条件下加入DCC(23.73g，115mmol)，冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应5h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-ONb溶液。
将H-Leu-OH(13.1g，100mmol)和NaHCO3(17.22g，205mmol)溶解在THF/H2O(200mL：200mL)中，冰浴条件下将上述Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200mL H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取(500mL*2)，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-PE重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH白色粉末状固体51.13g，纯度98.5％，收率61.2％。
肽片段的序列如SEQ ID NO.5所示。
实施例25.Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-OH的制备
称取替代度为0.5mol/g的2-CTC树脂100g，加入到固相合成仪反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后抽干，取实施例22制得的Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-OH(76.1g，100mmol)用DMF溶解，加入上述装有树脂的反应柱中，再加入DIPEA(19.25mL，110mmol)，，反应2小时后抽干，加入含有600mL DMF溶液，搅拌反应1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-2-CTC树脂。
用每克树脂10mL 20％DBLK溶液脱除Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-2-CTC树脂中的Fmoc保护基20分钟，然后用DMF洗涤6次，得到H-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-2-CTC树脂。
取Fmoc-Glu(otBu)-OH(20.36g，100mmol)和1.5mol HOBt，用DMF溶解，搅拌下加入1.5mol DIC，继续搅拌反应1小时，加入固相合成仪反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再延长偶联反应时间)，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-2-CTC树脂，用甲醇洗涤6次，树脂真空干燥过夜。
配置裂解液25％TFE/二氯甲烷溶液5L，将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液浓缩后加至5L***中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水***洗涤，并且真空干燥，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-OH白色粉末状固体60.01g，纯度97.8％，收率62.0％。
肽片段的序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例26.Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH的制备
称取替代度为0.5mol/g的2-CTC树脂100g，加入到固相合成仪反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后抽干，取实施例24制得的Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH(82.3g，100mmol)用DMF溶解，加入上述装有树脂的反应柱中，再加入DIPEA(19.25mL，110mmol)，，反应2小时后抽干，加入含有600mL DMF溶液，搅拌反应1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-2-CTC树脂。
用每克树脂10mL 20％DBLK溶液脱除Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-2-CTC树脂中的Fmoc保护基20分钟，然后用DMF洗涤6次，得到H-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-2-CTC树脂。
取Fmoc-Phe-OH(16.5g，100mmol)和1.5mol HOBt，用DMF溶解，搅拌下加入1.5molDIC，继续搅拌反应1小时，加入固相合成仪反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再延长偶联反应时间)，得到Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-2-CTC树脂，用甲醇洗涤6次，树脂真空干燥过夜。
配置裂解液25％TFE/二氯甲烷溶液5L，将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液浓缩后加至5L***中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水***洗涤，并且真空干燥，得到Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH白色粉末状固体60.27g，纯度98.5％，收率61.2％。
肽片段的序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例27.Fmoc-Aib-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-OH的制备
称取替代度为0.5mol/g的Wang树脂100g，加入到固相合成仪反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后抽干，取实施例6制得的Fmoc-Phe-Thr(tBu)-OH(54.5g，100mmol)用DMF溶解，加入上述装有树脂的反应柱中，再加入DIPEA(19.25mL，110mmol)，，反应2小时后抽干，加入600mL DMF溶液，搅拌反应1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Wang树脂。
用每克树脂10mL DBLK(5+7min)溶液脱除Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Wang树脂中的Fmoc保护基，然后用DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阴性，得到H-Phe-Thr(tBu)-Wang树脂。
取实施例4制得的Fmoc-Gly-Thr(tBu)-OH(45.54g，100mmol)和150mmol HOBt，用DMF溶解，搅拌下加入150mmol DIC，继续搅拌反应1小时，加入固相合成仪反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再延长偶联反应时间)，得到Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Wang树脂，
按照上述操作，将实施例实施例2制得的Fmoc-Aib-Glu(OtBu)-OH(28.86g，100mmol)和Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Wang树脂进行偶联反应，制得Fmoc-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-OH白色粉末状固体69.41g，纯度97.3％，收率53.9％。
肽片段的序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例28.Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-OH的制备
称取替代度为0.5mol/g的Wang树脂100g，加入到固相合成仪反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后抽干，取实施例12制得的Fmoc-Leu-Val-OH(45.2g，100mmol)用DMF溶解，加入上述装有树脂的反应柱中，再加入DIPEA(19.25mL，110mmol)，，反应2小时后抽干，加入600mL DMF溶液，搅拌反应1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Leu-Val-Wang树脂。
用每克树脂10mL DBLK(5+7min)溶液脱除Fmoc-Leu-Val-Wang树脂中的Fmoc保护基，然后用DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阴性，得到H-Leu-Val-Wang树脂。
取实施例10制得的Fmoc-Ala-Trp(Boc)-OH(59.7g，100mmol)和150mmol HOBt，用DMF溶解，搅拌下加入150mmol DIC，继续搅拌反应1小时，加入固相合成仪反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再延长偶联反应时间)，得到Fmoc-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Wang树脂，
按照上述操作，将实施例实施例8制得的Fmoc-Phe-Ile-OH(50.0g，100mmol)和Fmoc-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Wang树脂进行偶联反应，制得Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-OH白色粉末状固体90.19g，纯度97.8％，收率58.3％。
肽片段的序列如SEQ ID NO.9所示。
实施例29.Fmoc-Gly-Wang树脂的制备
称取替代度为0.75mmol/g的Wang树脂50g，加入固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30分钟，抽干。将Fmoc-Gly-OH(5.96g，20mmol)和HOBt(2.787g，20.625mmol)溶解于200mL体积比例为1：1的DMF和DCM混合溶液中，冰浴条件下加入DIC(3.17mL，20.625mmol)活化5分钟，将上述溶液加入装有树脂的固相反应柱中，同时加入DMAP(0.439g，4mmol)，氮气搅拌反应2h，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，加入300mL Ac2O/吡啶＝7：6(V/V)封闭6小时，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.498mmol/g。
实施例30.Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备
称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂20g，加入固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30分钟，抽干。将Fmoc-Gly-OH(2.38g，8mmol)用DMF溶解，加入上述装有树脂的反应柱中，再加入DIPEA(2.1mL，12mmol)，反应2小时后抽干，加入含有150mL DMF溶液，搅拌反应1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-2-CTC树脂，检测替代度为0.269mmol/g。
实施例31.肽树脂的制备
取实施例29制得的Fmoc-Gly-Wang树脂4.0g(2mmol)装入固相反应柱中，DMF洗两次，DMF溶胀30分钟，DBLK脱保护(5+7min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Arg(pbf)-OH(6.49g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶解在15mL DMF中，冰浴条件下加入DIC(1.5mL，10mmol)活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，得到Fmoc-Arg(pbf)-Gly-Wang树脂。抽干反应液，DMF洗涤3次，DBLK脱保护(5+7min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阴性，得到H-G-Arg(pbf)-Gly-Wang树脂。
按照上述Fmoc-Arg(pbf)-OH偶联的方法，在H-Arg(pbf)-Gly-Wang树脂上依次偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，实施例28提供的Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys({18-[N-(17-carboxyheptadecanoyl)-L-γ-glutamyl]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaoctade canoyl})，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，实施例17提供的Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-OH，实施例14提供的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-OH，实施例21提供的Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH。再用每克树脂10mL 50％TFA/DCM溶液脱Boc保护基20min，用DCM洗涤6次，真空减压干燥得到肽树脂25.5g。
实施例32.肽树脂的制备
取实施例30制得的Fmoc-Gly-2-CTC树脂7.43g(2mmol)装入固相反应柱中，DMF洗两次，DMF溶胀30分钟，DBLK脱保护(5+7min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Arg(pbf)-OH(6.49g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶解在15mL DMF中，冰浴条件下加入DIC(1.5mL，10mmol)活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，得到Fmoc-Arg(pbf)-Gly-2-CTC树脂。抽干反应液，DMF洗涤3次，DBLK脱保护(5+7min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阴性，得到H-G-Arg(pbf)-Gly-2-CTC树脂。
按照上述Fmoc-Arg(pbf)-OH偶联的方法，在H-Arg(pbf)-Gly-2-CTC树脂上依次偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Ala--OH，实施例26提供的Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，实施例3提供的Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，实施例17提供的Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-OH，实施例25提供的Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-OH，实施例1提供的Boc-His(Trt)-Aib-OH。
加入2mL二氯甲烷，再加入0.44mL苯基硅烷，反应3分钟，再加入0.09gPd(PPh3)4，室温反应45分钟，抽掉反应液，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Alloc已脱除。
称取Fmoc-AEEA-OH 0.77g(1.5mmol)，PyBOP 0.87g(1.5mmol)，HOBt 0.44g(36mmol)，用2mLDMF溶解，冰水浴下加入0.58mL DIPEA(0.3mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束，DBLK脱除Fmoc，DMF洗涤6次。同样方法再次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸，反应结束后用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到肽树脂25.2g。
实施例33.索马鲁肽粗肽的制备
取实施例31中得到的肽树脂25.5g，加入到250mL反应釜中，按TFA︰Anisole︰EDT︰DCM：H2O＝90︰6︰2︰1︰1的体积比配制裂解试剂200mL，将裂解试剂倒入肽树脂中，室温反应2.5小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用10mL TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到2.50L无水***中沉淀，离心，无水***洗涤，并且真空干燥，得到固体7.34g，收率86.2％。其HPLC谱图如图1所示。
将固体沉淀溶于2L 25％乙腈/水溶液中，冰浴下加入10mL 1N LiOH溶液，搅拌反应1小时，得到索马鲁肽粗肽，用醋酸调pH至6.0。
实施例34.索马鲁肽粗肽的制备
取实施例32中得到的肽树脂25.2g，加入到250mL反应釜中，按TFA︰Anisole︰EDT︰DCM：H2O＝92︰4︰2︰1︰1的体积比配制裂解试剂200mL，将裂解试剂倒入肽树脂中，室温反应2.5小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用10mL TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到2.50L无水***中沉淀，离心，无水***洗涤，并且真空干燥，得到固体7.35g，收率86.4％。其HPLC谱图与实施例33提供的图谱相似。
将固体沉淀溶于2L 25％乙腈/水溶液中，冰浴下加入10mL 1N LiOH溶液，搅拌反应1小时，得到索马鲁肽粗肽，用醋酸调pH至6.0。
实施例35.索马鲁肽精肽的制备
取实施例33制得的索马鲁肽粗肽溶液，采用Waters 2545RP-HPLC***，波长214nm，色谱柱为50×250mm反相C8柱，柱温为50℃，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分(30-40min)。冻干后得索马鲁肽3.34g，纯度为98.8％，收率为38.1％。其HPLC谱图如图2所示。
实施例36.索马鲁肽精肽的制备
取实施例34制得的索马鲁肽粗肽溶液，采用Waters 2545RP-HPLC***，波长214nm，色谱柱为50×250mm反相C8柱，柱温为50℃，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分(30-40min)。冻干后得索马鲁肽3.24g，纯度为98.5％，收率为38.1％。其HPLC谱图与实施例35提供的图谱相似。
对比实施例
称取实施例29制备的替代度为0.498mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂4.0g(2mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-王树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。取6.53g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(10mmol)，2.93g HOBt(12mmol)，4.33g PyBOP(10mmol)溶于体积比为1︰1的DCM和DMF混合溶液中，冰水浴下加入1.27mL DIPEA(1.8mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸进行偶联的步骤，按照索马鲁肽主链的肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys({18-[N-(17-carboxyheptadecanoyl)-L-γ-glutamyl]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaoctade canoyl})、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH的偶联。再用每克树脂10mL 50％TFA/DCM溶液脱Boc保护基20min，用DCM洗涤6次，真空减压干燥得到肽树脂10.5g。
得到的肽树脂，加入到250mL反应釜中，按TFA︰Anisole︰EDT︰DCM：H2O＝92︰4︰2︰1︰1的体积比配制裂解试剂200mL，将裂解试剂倒入肽树脂中，室温反应2.5小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用10mL TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到2.50L无水***中沉淀，离心，无水***洗涤，并且真空干燥，得到固体2.79g，收率75.3％
制得的索马鲁肽粗肽溶液，采用Waters 2545RP-HPLC***，波长214nm，色谱柱为50×250mm反相C8柱，柱温为50℃，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分(30-40min)。冻干后得索马鲁肽0.65g，纯度为98.2％，收率为17.6％。
Figure BDA0001806577930000271
Figure BDA0001806577930000281
Figure BDA0001806577930000291
Figure BDA0001806577930000301
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市健元医药科技有限公司
<120> 一种索马鲁肽的合成方法
<130> 9
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列1
<400> 1
His Aib Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列2
<400> 2
His Aib Glu Gly
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列3
<400> 3
Gly Thr Phe Thr
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列4
<400> 4
Phe Ile Ala Trp
1
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列5
<400> 5
Ile Ala Trp Leu
1
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列6
<400> 6
Glu Gly Thr Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列7
<400> 7
Phe Ile Ala Trp Leu
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列8
<400> 8
Aib Glu Gly Thr Phe Thr
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列9
<400> 9
Phe Ile Ala Trp Leu Val
1 5

Claims (3)

1.一种索马鲁肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
获得二肽片段、三肽片段；
获得Fmoc-Gly-树脂；
取所述二肽片段、所述三肽片段或其组合与具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸、所述Fmoc-Gly-树脂偶联得到索马鲁肽树脂，裂解、纯化、冻干，即得；
所述二肽片段为His-Aib、Aib-Glu、Glu-Gly、Gly-Thr、Thr-Phe、Phe-Thr、Thr-Ser、Phe-Ile、Ile-Ala、Ala-Trp、Trp-Leu、Leu-Val；
所述三肽片段为Gly-Thr-Phe、Thr-Phe-Thr、Phe-Thr-Ser、Thr-Ser-Asp、Ser-Asp-Val、Glu-Phe-Ile、Ile-Ala-Trp、Ala-Trp-Leu；
其中，首尾含相同氨基酸的肽片段不组合；
所述肽的序列如SEQ ID NO.l 所示；
所述组合为His-Aib、Glu-Gly、Thr-Phe-Thr、Ser-Asp-Val、Phe-Ile、Ala-Trp和Leu-Val；或
所述组合为His-Aib、Glu-Gly、Thr-Phe-Thr、Ser-Asp-Val、Phe-Ile和Ala-Trp-Leu；或
所述组合为His-Aib、Glu-Gly、Thr-Phe-Thr、Ser-Asp-Val、Ile-Ala和Trp-Leu；或
所述组合为His-Aib、Gly-Thr、Phe-Thr、Ser-Asp-Val、phe-Ile和Ala-Trp-Leu；或
所述组合为His-Aib、Gly-Thr、Phe-Thr、Ser-Asp-Val、Ile-Ala和Trp-Leu。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述裂解的试剂为Anisole、EDT、DCM、H2O中的一者或两者以上的混合物与TFA的混合物。
3. 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述裂解的试剂中TFA、Anisole、EDT、DCM与H2O的体积比为(90-95): (1-6): (1-5): (2-7): (1-5)。
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