CN110759990A - 一种利那鲁肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利那鲁肽的制备方法，方法中采用了特殊的保护氨基酸片断：Boc‑His(Boc)‑Ala‑Glu(OtBu)‑Gly‑OH和Fmoc‑Lys(N^α‑Pal‑γGlu(α‑OtBu))‑OH，解决了规模化制备方法中产品纯度偏低的问题。

Description

一种利那鲁肽的制备方法

技术领域

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及利那鲁肽的制备方法。

背景技术

利那鲁肽是一种GLP-1类似物，与人GLP-1具有97％的序列同源性，人GLP-1可以结合并激活GLP-1受体。GLP-1受体为天然GLP-1的靶点，GLP-1是一种内源性肠促胰岛素激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。与大然GLP-1不同的是，利那鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特点均适合每天1次的给药方案。皮下注射给药后，其作用时间延长的机理包括：使吸收减慢的自联作用；与白蛋白结合；对二肽基肽酶IV(DPP-IV)和中性内肽酶(NEP)具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。

利那鲁肽具有以下的结构：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N^α-Pal-γGlu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH

利那鲁肽的制备方法已有很多报道，本发明提供一种高效的利那鲁肽制备方法来制备高纯的产品，以满足医药用途。

发明内容

本发明提供了一种新的高效制备方法，采用Fmoc-Gly树脂为起始树脂，用了特殊的保护氨基酸，解决了规模化制备方法中产品纯度偏低的问题。

本发明提供了一种利那鲁肽的制备方法，包括：采用Fmoc-Gly树脂为起始树脂，用固相多肽合成法制备，经过多肽固相合成法得到利那鲁肽树脂，利那鲁肽树脂再经酸解得到利那鲁肽粗品，最后利那鲁肽粗品纯化得到利那鲁肽纯品。

其中利那鲁肽多树脂的合成过程中除了使用其他常规的保护氨基酸，同时使用了以下特殊保护氨基酸和片段：

(1)Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH

(2)Fmoc-Lys(N^α-Pal-γGlu(α-OtBu))-OH

利那鲁肽树脂为：

Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N^α-Pal-γGlu(α-OtBu))-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂

上述利那鲁肽的制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～3.5倍。

上述利那鲁肽的制备方法中，所述的Fmoc-Gly树脂是将载体树脂与Fmoc-Gly-OH偶联得到的；其中，所述Fmoc-Gly-树脂的取代值为0.2～1.0mmol/g树脂，优选的取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。

进一步优选的，所述载体树脂为Trityl-Cl(三苯甲基氯)类型树脂或羟基类型树脂，其中Trityl-Cl类型树脂优选为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl树脂、4-Methoxytrityl-Cl(4-甲氧基三苯甲基氯)树脂或2-Cl Trity-Cl(2-氯三苯甲基氯)树脂；羟基类型树脂优选为Wang(王)树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂。

作为本发明优选的方案，当载体树脂为三苯甲基氯树脂时，Fmoc-Gly-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂中的Cl-代烷基在碱的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。

作为本发明优选的方案，当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Gly-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂中的羟基在偶联剂、活化剂和碱催化剂的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。

作为本发明优选的方案，所述固相偶联合成法为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应。所述的偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。

优选的，利那鲁肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到利那鲁肽粗品：

进一步优选的，所述利那鲁肽树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)和水的混合溶剂；其中，混合溶剂的体积配比为：TFA为80～95％，EDT为1～10％，余量为水。

更进一步优选的，混合溶剂的体积配比为：TFA为89～91％、EDT为4～6％，余量为水。最优的，混合溶剂的体积配比为：TFA为90％、EDT为5％，余量为水。

所述酸解剂用量为每克利那鲁肽树脂需要4～15mL酸解剂；优选的，每克利利那鲁肽树脂需要9～11mL酸解剂。使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～6小时，优选的为3～4小时。

进一步的，利那鲁肽粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到利那鲁肽纯品，具体方法为：

利那鲁肽粗品，加水搅拌，用氨水调pH8.5至完全溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相***交替纯化，第一种流动相***为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相***为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度***洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得利那鲁肽纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相***为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到利那鲁肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利那鲁肽纯品。

本发明方法直接使用了以下特殊保护氨基酸：

(1)Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH

(2)Fmoc-Lys(N^α-Pal-γGlu(α-OtBu))-OH

直接避免了在Lys(Alloc)去保护时引入重金盐钯的风险、或Lys(IVDde)去保护时引入基因毒性物质肼，同时避免了[D-His¹]-利那鲁肽、[Des-Gly⁴]-利那鲁肽和[Lys(N^α-Pal-D-γGlu(α-tBu)²⁶]-利那鲁肽等杂质的产生，提高了粗品纯度，使纯化难度降低，提高了产品收率，所得产品纯度大于99.0％，与已有技术相比，本发明工艺更具有广泛的实用价值和应用前景。

具体实施方式

本发明公开了一种合成利那鲁肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。

表1

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1 利那鲁肽树脂的合成

利那鲁肽肽脂树为：

Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N^α-Pal-γGlu(α-OtBu))-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂

使用Fmoc-Gly-树脂为起始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表2所示的保护氨基酸偶联，制得利那鲁肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸或片段如下所示：

表2

接肽顺序n＝	保护氨基酸
		2	Fmoc-Arg(Pbf)
3	Fmoc-Gly-OH
		4	Fmoc-Arg(Pbf)
5	Fmoc-Val
		6	Fmoc-Leu
7	Fmoc-Trp(Boc)
		8	Fmoc-Ala
9	Fmoc-Ile
		10	Fmoc-Phe
11	Fmoc-Glu(OtBu)
		12	Fmoc-Lys(N<sup>α</sup>-Pal-γGlu(α-OtBu))
13	Fmoc-Ala
		14	Fmoc-Ala
15	Fmoc-Gln(Trt)
		16	Fmoc-Gly
17	Fmoc-Glu(OtBu)
		18	Fmoc-Leu
19	Fmoc-Tyr(tBu)
		20	Fmoc-Ser(tBu)
21	Fmoc-Ser(tBu)
		22	Fmoc-Val
23	Fmoc-Asp(OtBu)
		24	Fmoc-Ser(tBu)
25	Fmoc-Thr(tBu)
		26	Fmoc-Phe
27	Fmoc-Thr(tBu)
		28	Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly

1、接入第2个保护氨基酸

取0.09mol第2个保护氨基酸和0.09mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.09mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

取0.03mol的Fmoc-Gly-树脂(取代值约0.5mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第2个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含2个保护氨基酸的树脂。

2、接入第3～30个保护氨基酸或片段

采用上述同样方法，依次接入上述对应的第3～30个保护氨基酸或片段，得利利那鲁肽树脂。

实施例2 利那鲁肽粗品的制备

取实施例1制得的利利那鲁肽树脂，加入体积比为TFA∶水∶EDT＝95∶5∶5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为利那鲁肽粗品，粗品纯度为70.5％。

实施例3 利那鲁肽粗品的纯化

取实施例2制得的利那鲁肽粗品，加水搅拌，用氨水调pH8.5至完全溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相***交替纯化，第一种流动相***为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相***为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度***洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得利那鲁肽鲁肽纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相***为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到利那鲁肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利那鲁肽纯品40.1g，纯度为99.7％，最大单一杂质0.07％，总收率为35.6％，分子量为3750.6(100％M+H)。

上述实施例表明，本发明提供的方法所得产品纯度大于99.0％，单一杂质均小于0.15％，提高了产品质量，具有广泛的实用价值和应用前景。

Claims (7)

1.一种利那鲁肽的制备方法，包括：采用Fmoc-Gly树脂为起始树脂，用固相多肽合成法制备利那鲁肽肽树脂，利那鲁肽肽树脂再经酸解得到利那鲁肽粗品，最后经过纯化和冻干，得到利那鲁肽纯品：

His¹-Ala-Glu-Gly-Thr⁵-Phe-Thr-Ser-Asp-Val¹⁰-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu¹⁵-

Gly-Gln-Ala-Ala-Lys²⁰(N^α-Pal-γGlu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp²⁵-Leu-Val-

Arg-Gly-Arg³⁰-Gly-OH。

2.根据权利要求1所述的利那鲁肽的制备方法，其特征在于：在接入第1位His至第4位Gly时一并接入，对应的保护氨基酸为Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH。

3.根据权利要求1所述的利那鲁肽的制备方法，其特征在于：在接入第20位Lys时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Lys(N^α-Pal-γGlu(α-OtBu))-OH。

4.根据权利要求1所述的利那鲁肽的制备方法，其特征在于：所述的Fmoc-Gly树脂是将载体树脂与Fmoc-Gly-OH偶联得到的；其中，所述Fmoc-Gly-树脂的取代值为0.2～1.0mmol/g树脂；优选的取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。

5.根据权利要求1所述的利那鲁肽的制备方法，其特征在于：所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～3.5倍。

6.根据权利要求1～5任一项所述的利那鲁肽的制备方法，其特征在于：利那鲁肽肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到利那鲁肽粗品。

7.根据权利要求1所述的利那鲁肽的制备方法，其特征在于：利那鲁肽粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到利那鲁肽纯品。