CN114014906A - 一种利用阳离子交换层析纯化疏水性蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用阳离子交换层析纯化疏水性蛋白的方法。该方法的层析步骤包括平衡、上样、冲洗和洗脱，在层析过程中所用阳离子洗脱液不包含强电解质成分，所用阳离子冲洗液电导率高于上样样品；所述阳离子平衡液、冲洗液和洗脱液所用的盐包括弱酸盐和/或磷酸盐类。本发明所述的方法能有效去除HCP和聚体，避免阳离子层析洗脱峰出现裂峰或多峰现象，收集的双特异性抗体的收率和纯度较高，均可达90％以上(纯度甚至可达99％以上)。

Description

一种利用阳离子交换层析纯化疏水性蛋白的方法

技术领域

本发明涉及抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种阳离子交换层析法纯化疏水性蛋白的方法。

背景技术

疏水性是抗体分子重要的理化性质，抗体分子疏水性的强弱对阳离子交换层析的填料的选择和工艺开发有重要的影响。一般疏水性较强的抗体分子在阳离子交换层析纯化过程中更容易出现洗脱多峰，聚合体去除效果较差、稳定性差和收率低等问题。以下以疏水性抗体为例作具体介绍。

经过30多年的研究和发展，单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)药物在肿瘤和自身免疫疾病治疗领域取得了巨大进展，同时也成为了医药领域增长速度最快、最有前景的发展方向，为常规治疗无效的患者带来了新的希望。目前通过基因工程改造以及有效的质量控制，大大提高了药物的亲和力、稳定性、生物学活性及治疗效果。

双特异性抗体(Bispecific monoclonal antibody，BsAb)能够实现单个分子同时结合两个独特的靶点，对于包括肿瘤和感染性疾病在内的各种适应症，均观察到双特异性抗体比单克隆抗体组合更好的治疗效果。同时结合两个靶点可以实现单克隆抗体无法实现的独特作用机制，人们对双特异性抗体作为治疗药物的兴趣正在增加。中国专利(申请公布号CN110305210A和专利号CN101896504B)公开了双特异性抗体的设计和制备方法。中国专利(申请公布号CN107922476A)公开了从包含具有两条κ轻链或其部分的单特异性抗体和具有两条λ轻链或其部分的单特异性抗体的混合物中分离这些双特异性抗体的方法。

下游纯化被认为是单克隆抗体药物工业化生产中最具挑战性的阶段之一，目前广泛采用三步纯化策略：样品捕获、中度纯化和精细纯化，该策略工艺复杂、对操作要求严格，导致纯化成本一般占总生产成本的50％～80％。样品捕获通常第一步是用蛋白A亲和层析，中度纯化和精细纯化可采离子交换层析和疏水层析等方法。双价双特异性抗体的下游处理很可能利用与单克隆抗体相同的处理策略。虽然不同的单抗纯化的平台工艺都是采用这几种层析方法，但是具体的参数不同、填料选择不同都会产生完全不同的结果。

阳离子交换层析(Cation exchange，CEX)因其高载量、对杂质的选择性、可扩展性和鲁棒性而被广泛应用于平台单克隆抗体的纯化过程，主要用于去除高聚物，同时能去除宿主蛋白和DNA。mAb等电点一般为中性或者弱碱性，所以阳离子交换填料在抗体的纯化工艺中一般适用于结合洗脱模式下操作，mAb在低电导率条件下结合到树脂上，并且pH低于目标分子的等电点。通过增加电导率或pH来实现mAb的洗脱，可以通过线性梯度或阶梯洗脱到预定条件来实现。杂质，特别是高聚合体在CEX填料上通常比mAb产物结合得更紧密，并且可以通过调整洗脱条件和收集范围从所需组分中分离出来。

CEX通常被认为是温和的操作，不太可能导致蛋白质构象变化，因为它主要基于静电相互作用。在大多数情况下，结合蛋白从CEX柱中以单峰形式洗脱，洗脱的盐浓度取决于pH和梯度斜率。然而阳离子交换层析的应用有时会受到蛋白质化学特性的影响，从而产生意想不到的结果。Gillespy等发现将高纯度的糖基化抗体加载到阳离子交换柱上并用盐梯度洗脱它会产生两个洗脱峰(Gillespie R,Nguyen T,Macneil S等.Cation exchangesurface-mediated denaturation of an aglycosylated immunoglobulin(IgG1).JChromatogr A,2012,1251:101-110)，一个几乎完全包含抗体的单体形式，另一个包含柱内形成的聚集物种的百分比增加。阳离子和阴离子交换层析洗脱时均出现多个洗脱峰的现象的分子机理通常被认为填料表面的吸附作用导致蛋白质分子表面动力学构象的局部变化(Kimerer L K,Pabst T M,Hunter A K等.Chromatographic behavior of bivalentbispecific antibodies on cation exchange columns.II.Biomolecularperspectives.J Chromatogr A,2019,1601:133-144.)。结合到CEX填料上的单克隆抗体的溶剂暴露区域随着时间的推移而增加，洗脱时聚集的不稳定中间体的逐渐增加，从而导致双峰洗脱现象(Guo J,Carta G.Unfolding and aggregation of a glycosylatedmonoclonal antibody on a cation exchange column.Part II.Protein structureeffects by hydrogen deuterium exchange mass spectrometry.J Chromatogr A,2014,1356:129-137)。单克隆抗体分子中组氨酸残基产生可逆质子化也会在不同的阳离子填料上产生不同的双峰洗脱现象(Luo H,Cao M,Newell K等.Double-peak elution profileof a monoclonal antibody in cation exchange chromatography is caused byhistidine-protonation-based charge variants.J Chromatogr A,2015,1424:92-101)。某些单抗分子在CEX柱上构象的可逆变化和不可逆柱上聚集，还会导致三个峰的洗脱(GuoJ,Creasy A D,Barker G等.Surface induced three-peak elution behavior of amonoclonal antibody during cation exchange chromatography.J Chromatogr A,2016,1474:85-94)。Luo等人报道了一种IgG2单抗分子在线性盐梯度洗脱过程中，洗脱缓冲液中的NaCl诱导形成一个与CEX柱强结合的可逆自缔合物，并与聚集体共洗脱，导致洗脱产物的纯度较低，并产生了明显的洗脱峰***(Luo H,Macapagal N,Newell K等.Effects ofsalt～induced reversible self-association on the elution behavior of amonoclonal antibody in cation exchange chromatography.J Chromatogr A,2014,1362:186-193)。

mAb在CEX层析柱上出现多个洗脱峰的现象通常发生在线性盐梯度洗脱模式下，某些mAb分子在盐等度洗脱时也会发生类似的现象(Guo J,Carta G.Unfolding andaggregation of a glycosylated monoclonal antibody on a cation exchangecolumn.Part II.Protein structure effects by hydrogen deuterium exchange massspectrometry.J Chromatogr A,2014,1356:129-137)。CEX层析柱上出现多个洗脱峰除了与mAb分子本身的性质外，阳离子交换填料的化学和结构也有影响，如Capto S Impact和Eshmuno CPX等聚合物接枝树脂的双峰洗脱曲线更加明显(Farys M,Gibson D,Lewis AP等.Isotype dependent on-column non-reversible aggregation of monoclonalantibodies.Biotechnol Bioeng,2018,115(5):1279-1287)。

虽然双特异性抗体分子在蛋白A填料上的捕获行为与普通mAb相似，但由于双特异性抗体分子的多结构域结构和单链可变区片段(single chain antibody fragment，scFv)连接的灵活性，以及复杂的杂质组成，阳离子交换色谱可能会有显著的差异，不同的构象可能以不同的方式结合到色谱表面，导致更复杂的色谱现象，包括多峰洗脱的可能性(Kimerer L K,Pabst T M,Hunter A K等.Chromatographic behavior of bivalentbispecific antibodies on cation exchange columns.I.Experimental observationsand phenomenological model.J Chromatogr A,2019,1601:121-132)。目前双特异性抗体的CEX层析纯化多采用mAb平台纯化的方法，易出现阳离子洗脱峰异常现象，且存在工艺复杂、载量低、产品收率低、和纯度低等缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中纯化疏水性抗体分子过程中存在聚集、收率低以及纯度低等缺陷提供一种利用阳离子交换层析纯化疏水性蛋白的方法，本发明所述的方法能有效去除HCP和聚体，避免阳离子层析洗脱峰出现裂峰或多峰现象，收集的疏水性蛋白(如双特异性抗体)的收率和纯度较高，均可达90％以上(纯度甚至可达99％以上)。

本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明的技术方案之一为：一种利用阳离子交换层析纯化疏水性蛋白的方法，其层析步骤包括平衡、上样、冲洗和洗脱，在层析过程中所用阳离子洗脱液不包含强电解质成分，所用阳离子冲洗液电导率高于上样样品；

所述阳离子平衡液、冲洗液和洗脱液所用的盐包括弱酸盐和/或磷酸盐类。

较佳地，所述的阳离子交换层析所用填料为含选自由磺酸基(SO₃ ^2-)、磺甲基(S)、磺丙基(SP)和磷酸基(P)构成的群组中的基团的强阳离子交换剂或含选自由羧甲基(CM)、羧基(COO-)构成的群组中的离子交换基团的弱阳离子交换剂，优选含磺酸基^-或磺丙基等基团的强阳离子交换剂。本发明中所用阳离子交换层析的填料较佳地包括但不局限于GE公司的Capto S Impact和Capto MMC、Thermofisher公司的POROS 50XS和POROS 50HS，MerckMillipore公司的Fractogel EMD SO3^-(M)和Eshmuno CPX、苏州纳微公司Nanogel-50SP等；优选Capto S Impact或Poros 50HS填料。

本发明中所述的阳离子交换层析可为本领域常规，优选采用结合-洗脱模式。

本发明中所述的阳离子平衡液、冲洗液和洗脱液可为非强酸盐，优选醋酸-醋酸盐缓冲液、枸橼酸-枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或者组氨酸盐缓冲液，更优选醋酸-醋酸盐缓冲液；较佳地，所述的阳离子平衡液、冲洗液和洗脱液均不包含强电解质成分。

本发明中，所述的洗脱可为本领域常规，优选盐梯度洗脱或者盐等度洗脱。其中，所述的盐梯度洗脱优选盐线性梯度洗脱。

较佳地，所述盐等度洗脱的洗脱液电导率12.55～17.6mS/cm，pH值为4.8～5.5。

较佳地，所述的盐线性梯度洗脱的洗脱液电导率为19.0～25.0mS/cm，pH值为5.0～5.4。

其中：当所述填料为Capto S Impact时，所述盐等度洗脱的洗脱液电导率的范围优选13.5～15.5mS/cm；当所述填料为Poros 50HS时，所述盐等度洗脱的洗脱液电导率的范围优选12.55～14.75mS/cm。

本发明中，所述阳离子平衡液的pH较佳地为4.9～5.5，更佳地为5.0；电导率较佳地为3.0～10.5mS/cm，更佳地为5.7～10.5mS/cm，进一步更佳地为8.0mS/cm。

本发明中，所述冲洗液的pH较佳地为4.9～5.5，更佳地为5.0；电导率较佳地为3.0～10.5mS/cm，更佳地为5.7～10.5mS/cm，进一步更佳地为8.0mS/cm。

本发明中上样样品的电导率较佳地为3.74～10.5mS/cm，更佳地为3.74～7.55mS/cm。

本发明中所述的疏水性蛋白为抗体，如双特异性抗体或单抗；所述的双特异性抗体优选OX40/PD-L1双特异性抗体；更优选包含特异性结合PD-L1的单结构域抗原结合位点和特异性结合OX40的Fab片段。

较佳地，所述双特异性抗体包含多肽链1：VH-CH1-CH2-CH3-接头-VHH，以及多肽链2：VL-CL；较佳地，所述VHH的CDR1～3分别如序列表中SEQ ID NO:1～3所示，所述VH的CDR1～CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4～6所示的，且所述VL的CDR1～CDR3分别如SEQ IDNO:7～9所示。

其中，所述接头优选包含氨基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数，例如，n为1～7中的正整数，例如，n为1、2、3、4、5或6。

所述VH的氨基酸序列较佳地如序列表中SEQ ID NO:10所示。

所述VL的氨基酸序列较佳地如序列表中SEQ ID NO:11所示。

所述VHH的氨基酸序列较佳地如序列表中SEQ ID NO:12所示。

较佳地，所述的多肽链1含有如SEQ ID NO:13所示的序列或保留该序列功能的变体；更佳地，所述的变体与如SEQ ID NO:13所示的序列的同一性为90％以上，优选95％以上，更优选99％以上。

较佳地，所述的多肽链2含有如SEQ ID NO:14所示的序列或保留该序列功能的变体；更佳地，所述的变体与如SEQ ID NO:14所示的序列的同一性为90％以上，优选95％以上，更优选99％以上。

在本发明一较佳实施例中，所述OX40/PD-L1双特异性抗体是由CHO细胞培养获得的全人源双特异性抗体；较佳地，所述的OX40/PD-L1双特异性抗体的疏水性强于伊匹单抗。

本发明中的数字均为近似值，无论有否使用“大约”或“约”等字眼。盐浓度和蛋白浓度表示的数字的数值有可能会出现±10％的差异，pH所示的数字的数值可能会出现±0.1以内的差异，电导率所示的数字的数值可能会出现±0.5以内的差异。每当公开盐浓度和蛋白浓度中任意一个具有N₁值的数字时，任何具有N₁+/～10％值的数字会被明确地公开，其中+/～是指加或减，并且N₁～10％到N₁+10％之间的范围也被公开。例如，阳离子填料的清洗溶液为0.5mol/L NaOH，则有0.5moI/L+/～10％的值被同时公开，同时，0.5mol/L～10％到0.5mol/L+10％之间的浓度范围也属于公开的范围，亦即0.45～0.55mol/L及其之间的值，都在阳离子CIP溶液的包含范围内。同样每当公开pH和电导所示的数字的数值分别为N₂和N₃时，同时公开的是N₂±0.1的范围和N₃±0.5的范围。

定义：

本发明中所称的“疏水性蛋白”并不做特别的限制，并且包括任何可以通过使用本发明的离子交换层析方法从细胞中进行提纯的疏水性蛋白质。另外，所述“疏水性蛋白”并不涉及特定的疏水性数值或范围，而是指如下任何疏水性，即通过与细胞结构结合、或者自缔合作用而赋予靶蛋白质在水溶液中的不溶解性，并且允许通过本发明的离子交换层析方法对所述蛋白质进行纯化。

本发明中所称的强疏水性的蛋白，是指在试验材料和试验方法部分第1.3节中所记载的HIC-HPLC的色谱条件下，其出峰时间不早于同条件下Ipilimumab出峰时间，优选出峰时间不早于同条件下OX40/PD-L1双特异性抗体的出峰时间的蛋白。

本发明的定义“抗体”是指任何免疫球蛋白，复合物或者其片段形式。该术语包括但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的单克隆或多克隆抗体，包括自然或通过人源、嵌合、合成、重组、杂交、突变等基因工程修饰的形式。在本发明的实施方式中，抗体可以是全人源的单克隆抗体IgG。

本发明的定义“单克隆抗体”或“单抗”是指由单一效应B细胞合成的针对某一种特定抗原决定簇的抗体。其根据发展阶段的不同，可以是鼠源性、嵌合性、人源化和全人源单克隆抗体。

本发明的定义“双特异性抗体”或“双抗”是指一种可以同时结合两种特异性表位或目的蛋白的人工工程化抗体，具有同时结合两个不同表位的能力，可以起到一些特殊的生物学功能。在本发明的实施方式中，OX40/PD-L1双特异性抗体可以是全人源单克隆抗体，其抗体的可变区和恒定区都是人源的。OX40(也称为CD134、TNFRSF4和ACT35)是细胞表面糖蛋白和肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，在T淋巴细胞上表达并且为活化的T细胞的增殖和存活提供共刺激信号。PD-L1(也称作分化抗原簇274(CD274)或B7同源物1(B7～H1))，是40kDa I型跨膜蛋白。PD-L1与活化的T细胞上存在的其受体PD-1结合，下调T细胞活化。在本发明的实施方式中，OX40/PD-L1双特异性抗体包含特异性结合PD-L1的单结构域抗原结合位点和特异性结合OX40的Fab片段。

本发明的定义“CHO细胞”是指哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞，它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞，是常用的哺乳动物宿主细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被引入CHO细胞内时，通过合适的条件培养宿主细胞可以使其表达或分泌抗体到培养基中，得到含有目标抗体的混合物。在本发明的实施方式中，“CHO细胞”可以是用来表达OX40/PD-L1双特异性抗体的中国仓鼠卵巢细胞。

术语“杂质”指与期望的抗体产物不同的物质。污染物包括但不限于：宿主细胞物质，诸如宿主细胞蛋白(HCP)和DNA；期望抗体的变体、片段、聚集物或衍生物；细胞培养基成分。

术语“冲洗缓冲液”在本文中用于指在加载组合物之后且在洗脱感兴趣双特异性抗体之前流过层析材料的缓冲液。冲洗缓冲液可用于清除层析填料上的一种或多种杂质，基本上不洗脱期望抗体产物。

术语“洗脱缓冲液”用于自固相洗脱感兴趣抗体。在本文中，洗脱缓冲液具有相对于冲洗缓冲液的电导率更高或pH更高，使得期望抗体产物自层析介质中洗脱。

术语“离子交换”或“离子交换层析”是指利用离子交换剂为固定相，根据带点溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的层析方法。根据离子交换剂的性质不同，可将其分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。前者对阴离子具有交换能力，活性基团带正电荷；后者对阳离子有交换作用，活性基团带负电荷。根据其具有离子交换能力的pH范围大小，离子交换剂又有强、弱之分：强离子交换剂具有离子交换作用的pH值范围大，离子化率受pH影响较小；弱离子交换剂离子交换作用的pH值范围小，离子化率受pH影响大。在本发明的实施方式中“阳离子层析”或“阳离子交换层析”均指利用阳离子交换剂进行的层析。在上述步骤中，由于抗体的等电点较高，在pH低于等电点的缓冲液中带正电荷，阳离子交换剂可以通过与溶液中不同阳离子结合强弱不同而将目标产物进行分离。本发明所述的阳离子交换剂典型的有含磺酸基(SO₃ ^2-)、磺甲基(S)、磺丙基(SP)、磷酸基(P)等基团的强阳离子交换剂和含羧甲基(CM)，羧基(COO^-)等离子交换基团的弱阳离子交换剂；优选为含SO₃ ^2-或SP等基团的强阳离子交换剂，更优选地，为Capto S Impact或Poros 50HS。

术语“聚合体”可以理解为相同抗体分子的非共价结合，由两个或两个以上的抗体结合而成的分子。所述抗体可以由单链抗体共价结合(例如二硫键)的均质或异质多条多肽构成。二聚体是两个IgG分子的非特异性结合。多聚体的形成与抗体结构的变形影响因素紧密相关。例如，高盐、极端pH诱导以及抗体分子与填料表面基团相互作用等因素均可能导致抗体变性形成多聚体。聚合体在SEC分析柱上流出部分通常观察为SEC-HPLC色谱图中主峰之前的一种或多种峰。

本发明的定义“上样”是指将待分离的样品通过样品泵或手动加入到层析柱内，使之与层析填料相接触的操作。在本发明的实施方式中，上样可以是将经过适当处理后的OX40/PD-L1双特异性抗体样品加入到CEX层析柱内的操作。

本发明使用的定义“梯度洗脱”是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度，其中线性梯度最常用。在本发明的实施方式中，阳离子交换层析的洗脱步骤可采用基于盐浓度的线性梯度和pH线性梯度。

本发明使用的定义“等度洗脱”是指在阳离子交换层析的洗脱过程中，洗脱缓冲液的组成比例和流速恒定不变的洗脱方式。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明所述的方法能有效去除HCP和聚体，避免阳离子层析洗脱峰出现裂峰或多峰现象，收集的双特异性抗体的收率和纯度较高，均可达90％以上(纯度甚至可达99％以上)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为抗OX40/PD-L1双特异性抗体的结构示意图。

图2A为采用阳离子交换层析填料POROS 50HS纯化双特异性抗体的盐线性梯度洗脱峰。

图2B为阳离子交换层析收集液各组分的纯度和HCP随收集体积的变化图；阳离子交换层析填料为POROS 50HS。

图3为采用阳离子交换层析填料POROS 50XS纯化双特异性抗体的层析图谱。

图4为阳离子收集液各组分中双特异性抗体的单体和聚合体含量的分布图。

图5为POROS 50HS填料的盐线性梯度洗脱纯化双特异性抗体层析图谱。

图6为Capto MMC填料的盐线性梯度洗脱纯化双特异性抗体层析图谱。

图7为双特异性抗体在四种不同的阳离子交换层析填料上洗脱过程时分段收集各组分的单体含量和聚合体含量虽洗脱体积的变化趋势图。

图8为pH线性梯度洗脱模式下阳离子层析图谱。

图9为pH等度梯度洗脱模式下阳离子层析图谱；洗脱缓冲液为50mM tris-HCl+50mM NaCl，pH7.2，电导率8.52mS/cm。

图10为pH等度梯度洗脱模式下阳离子层析图谱；洗脱缓冲液为25mM tris-HCl+25mM NaCl，pH7.2，电导率4.74mS/cm。

图11为阳离子层析图谱。填料：POROS 50HS，线性洗脱，洗脱缓冲液为500mmol/L醋酸-醋酸钠，pH5.0，22.3mS/cm。

图12为阳离子层析图谱。填料：Capto S Impact，线性洗脱，洗脱缓冲液为500mmol/L醋酸-醋酸钠，pH5.0，22.3mS/cm。

图13为阳离子层析图谱。填料：Capto S Impact，等度洗脱，平衡缓冲液和冲洗缓冲液均为50mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)，洗脱缓冲液为325mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)。

图14为阳离子层析图谱。填料：Capto S Impact，等度洗脱，平衡缓冲液和冲洗缓冲液均为150mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)，洗脱缓冲液为325mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)。

图15为阳离子层析图谱。填料：Capto S Impact，线性梯度洗脱，冲洗缓冲液为50mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)，洗脱缓冲液为500mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)。

具体实施方式

本发明的具体实施方式包括如下步骤：

1)阳离子上样样品将表达双特异性抗体的CHO细胞培养液进行澄清过滤或离心分离去掉细胞和细胞碎片，得到澄清液；

2)用Protein A亲和层析填料对上述澄清液进行纯化，收集亲和洗脱液；

3)将亲和洗脱液的pH调节到4.9～5.5，或将亲和洗脱液的pH调节到pH 3.5～3.6进行低pH灭活，室温放置60～180min再将其pH调到4.9～5.5，这两种方式得到的样品调节其电导率后用0.22μm滤器过滤作为阳离子上样样品；

此外，亲和洗脱液回调pH的样品和低pH灭活收集液经过深层吸附过滤、阴离子交换层析和疏水层析等纯化步骤处理过的样品，再经过pH调节和电导率调节后也均可作为阳离子上样样品。

4)阳离子交换层析，阳离子平衡液平衡层析柱3～5个柱体积后开始上样，上样完成后直接开始洗脱或用冲洗缓冲液冲洗2～5个柱体积后开始洗脱，收集洗脱组分。

在一些实施方式中，步骤1)所述的双特异性抗体的特征是：包含特异性结合PD-L1的单结构域抗原结合位点和特异性结合OX40的Fab片段。

在一些实施方式中，步骤1)所述的澄清过滤可以采用3M、Sartorius、MerckMillipore、PALL等公司的商业化膜包。

在一些实施方式中，步骤1)所述的离心分离为将CHO细胞培养液进行4000～9000g离心。在本发明实施例中，所述离心在Beckman Avanti J-E离心机上进行，4℃下离心10～15min。

在一些实施方式中，步骤2)所述的亲和层析填料可以是MabSelect SuRe LX(GE)、MabSelect PrismA (GE)、UniMab Protein A (苏州纳微)、

AF-rProtein A HC-650F(Tosoh)、Amsphere A3(JSR)、KanCapA 3G(Kaneka)、POROS MabCapture A Select(Thermofisher)、Eshmuno A(EMD Merck)、Praesto AP(Purolite)填料中的一种。

在一些实施方式中，步骤3)所述的将pH从低调高所用试剂为1～2mol/L Tris、0.1～1.0mol/L NaOH、0.5mol/L磷酸氢二钾溶液(pH 9.5)、0.2～0.5mol/L甘氨酸-氢氧化钠溶液(pH 10.5)、1～2mol/L精氨酸溶液(pH 9.0)等；将pH从高调低所用试剂为1～3mol/L醋酸溶液，1～3M枸橼酸溶液，0.1～1.0mol/L HCl、0.2～0.5mol/L甘氨酸-盐酸溶液(pH 2.3)等。

在一些实施方式中，步骤3)所述的作为阳离子上样样品是用超纯水、阳离子平衡液或两者混合物进行电导率的调节，所述电导率的范围为4.0～10.0mS/cm，优选4.0～7.5mS/cm。

在一些实施方式中，步骤4)中阳离子交换层析的填料包括但不局限于GE公司的Capto S Impact和Capto MMC、Thermofisher公司的POROS 50XS和POROS 50HS，MerckMillipore公司的Fractogel EMD SO3^-(M)和Eshmuno CPX、苏州纳微公司Nanogel-50SP等。

优选的，上样前采用平衡缓冲液对阳离子交换层析介质平衡处理。更优选的，采用3～5CV的平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡处理。

优选的，平衡缓冲液的pH为4.9～5.5，优选为5.0。平衡缓冲液包括但不局限于醋酸-醋酸钠缓冲液、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选为醋酸-醋酸钠缓冲液。

在一些实施方式中，步骤4)中阳离子交换层析的冲洗缓冲液的pH为4.9～5.5，优选为5.0，电导率为3～10mS/cm，优选为6～10mS/cm。冲洗缓冲液包括但不局限于醋酸-醋酸钠缓冲液、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选为醋酸-醋酸钠缓冲液。

在一些实施方式中，步骤4)中阳离子交换层析的洗脱缓冲液的pH为4.8～7.2，优选为5.0～5.5。洗脱缓冲液包括但不局限于醋酸-醋酸钠缓冲液、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选为醋酸-醋酸钠缓冲液。

在一些实施方式中，步骤4)中双特异性抗体的洗脱可采用盐线性梯度洗脱、盐等度洗脱、pH线性梯度洗脱、pH等度洗脱以及pH和盐双梯度的洗脱，优选采用盐线性梯度洗脱和盐等度洗脱，更优选采用盐线性梯度洗脱。

在一些实施方式中，步骤4)中洗脱样品的收集条件为：洗脱时从280nm紫外吸收值上升到100mAU/mm时开始收集，直到280nm紫外吸收值降低到200～650mAU/mm时停止收集。

本发明实施例中所用水均为电阻率达到18.0MΩ*cm(25℃)的超纯水。

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1.1双特异性抗体(以下简称双抗)

双抗为PCT/CN2020/073959中公开的同时结合PD-L1和OX40的双特异性抗体。为了本申请的目的，该PCT申请的全部内容特此并入本文作为参考。

所述双抗的抗体亚型为IgG2，其等电点为8.0～8.6，分子量为174.3kDa。

所述双抗为如图1所示结构的抗OX40/PD-L1双特异性抗体，其中抗原A为OX40，抗原B为PD-L1。

其中，所述双抗中的具体序列如下所示：

图1中VH-CH1-CH2-CH3-接头-VHH(即IGN-LP肽链#1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；图1中抗OX40抗体ADI-20057的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；图1中CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；图1中Fc(即CH2-CH3)的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；图1中接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；图1中抗PD-L1单结构域抗体的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；图1中VL-CL(即IGN-LP肽链#2)的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；图1中抗OX40抗体ADI-20057的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；图1中CL的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。

进一步的，在所述双抗中包含的抗PD-L1单结构域抗体的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～3所示；在所述双抗中包含的抗OX40抗体ADI-20057的HCDR1～HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4～6所示；在所述双抗中包含的抗OX40抗体ADI-20057的LCDR1～LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7～9所示。

在一个实施方案中，所述双抗是在293细胞或CHO细胞中重组表达的抗OX40/PD-L1双特异性抗体。

1.2双抗的疏水性验证

设置如下的色谱条件：

采用HIC-HPLC法检测OX40/PD-L1双特异性抗体的疏水性。使用Waters e 2695或安捷伦1260高效液相色谱仪进行分析。选取Ipilimumab抗体与待检测样品疏水性进行保留时间对比，保留时间越久，蛋白疏水性越强。

色谱分析条件：采用MabPacTM HIC-10LC色谱柱(厂家：Thermo，货号088480)；流动相A：1.8mol/L硫酸铵，100mmol/L NaH2PO4.2H2O，pH 6.5，流动相B：90％体积分数的100mmol/L NaH2PO4.2H2O(pH 6.5)溶液与10％异丙醇的混合溶液；流速：1.0ml/min；洗脱程序：0至20min内，100％A→0％A；20至25min内，100％B；25至30min内，100％A；采集时间：30min；进样量：10～20μl；柱温：25℃；检测波长：280nm。

结果在上述色谱条件下，Ipilimumab出峰时间在28分钟左右，OX40/PD-L1双特异性抗体的出峰时间在31分钟左右。

实施例2

(1)阳离子上样样品的制备

表达OX40/PD-L1双特异性抗体的CHO细胞培养液采用Beckman Avanti J-E离心机在9000g离心力下离心15min后将上清液用0.22μm滤器过滤得到澄清液，再用MabSelectSuRe LX(GE)填料进行亲和层析纯化，调节亲和收集液pH到4.9，用超纯水将电导率调节到4.0mS/cm，用0.22μm滤器过滤后作为阳离子上样样品。上述阳离子上样样品蛋白含量为10.9g/L，纯度96.0％(SEC-HPLC法，下文所有纯度数据均为该方法测定)，HCP含量3232.9ppm。

(2)阳离子交换层析

采用Thermofisher公司高分辨率的POROS 50HS填料装填Merck Millipore公司的

L Laboratory Column VL 11×250层析柱，柱高21.3cm，柱体积22.6mL。层析柱经过平衡缓冲液(50mmol/L醋酸-醋酸钠，pH 4.9)平衡5柱体积(CV)后，采用AKTA pure M纯化***(紫外检测器光程为2mm)上样，上样载量50g/L填料，上样时样品保留时间为6min，即3.77ml/min，上样结束用冲洗缓冲液(50mmol/L醋酸-醋酸钠，pH5.5)3CV，用冲洗缓冲液和洗脱缓冲液(B液：50mmol/L醋酸-醋酸钠，0.5mol/L NaCl，pH 5.5)进行盐线性梯度洗脱(0～100％B液，20CV)，280nm波长的紫外吸收值增加到100mAU/mm时开始收集，采用分管收集，每管收集5.0ml，280nm波长的紫外吸收值下降到100mAU/mm时停止收集。洗脱结束后用含1mol/L氯化钠的缓冲液再生3CV，用0.5mol/L NaOH溶液清洗15～30min，再用10mmol/LNaOH或20％乙醇保存，后续实施中再生、清洗和保存方法均与本实施例相同，后文不再赘述。

(3)检测和分析

检测各管收集液的蛋白含量、纯度及HCP含量，蛋白含量检测采NanoDrop2000检测，HCP含量采用商业化渠道购买的ELISA试剂盒测定，本实施例中使用的检测方法适用于其他实施例，后文不在赘述。

阳离子洗脱的层析图谱如图2A所示，洗脱峰出现双峰的现象，若按照洗脱峰降落到400mAU处附近停止收集，即在收集45.2ml(2CV)左右停止收集时，收率为82.4％，纯度为95.2％。若停止收集点设定在1.33CV左右(对应的280nm处紫外吸收值为1300mAU左右)，收率为77.1％，纯度为98.5％，收率和纯度均偏低。通过计算发现从开始收集到400mAU处附近停止收集，收集液总聚合体总含量已超过上样样品的含量，说明在阳离子洗脱过程产生了新的聚合体。纯度和HCP随洗脱柱体积的变化如图2B所示，双特异性抗体的纯度随着盐浓度的增加经历先降低后升高再降低的过程，导致了收集液纯度较低。洗脱液各段收集液组分的HCP含量随着盐浓度的增加逐渐增加，在收集45.2ml(2CV)左右停止收集时，大部分HCP被去除。

实施例3

(1)阳离子上样样品的制备

表达OX40/PD-L1双特异性抗体的CHO细胞培养液采用Merck milipore公司Millistak D0HC和X0HC深层吸附膜包过滤，再用Protein A填料进行亲和层析纯化，亲和收集液用2mol/L Tris溶液将pH调节到5.0，再用超纯水将电导率调节到3.0mS/cm，用0.22μm滤器过滤后作为阳离子上样样品。上述阳离子上样样品蛋白含量为17.0g/L，纯度96.9％，HCP含量60.7ppm。

(2)阳离子交换层析

采用Thermofisher公司高载量的POROS 50XS填料装填Merck Millipore公司的

L Laboratory Column VL 11×250层析柱，柱高9.5cm，柱体积10.1mL。层析柱经过平衡缓冲液(50mmol/L醋酸-醋酸钠，pH 5.0)平衡5CV后，采用AKTA pure 150L纯化***(紫外检测器光程为2mm)上样，上样载量37g/L填料，上样流速1.68ml/min，上样结束用冲洗缓冲液(50mmol/L醋酸-醋酸钠，pH 5.0)3CV，用冲洗缓冲液和洗脱缓冲液(B液：50mmol/L醋酸-醋酸钠，0.5mol/L NaCl，pH 5.0)进行盐线性梯度洗脱(0～100％B液，10CV)，280nm波长的紫外吸收值增加到100mAU/mm时开始收集，采用分管收集，每管收集3.4ml(1/3CV)，280nm波长的紫外吸收值下降到100mAU/mm时停止收集。

(3)检测和分析

阳离子洗脱的层析图谱如图3所示，双特异性抗体的洗脱曲线与实施例1类似，都是在洗脱液组分占比为20～30％之间开始洗脱收集，且都存在洗脱峰双峰现象(第2个洗脱峰的峰高较低)，均在0.6～0.7CV处达到最大洗脱蛋白浓度。阳离子收集液各组分中双特异性抗体的单体和聚合体含量的分布如图4所示，单体含量波动的波峰和聚合体含量波动的波峰有重叠，造成阳离子收集液中聚合体难以去除，洗脱峰截取到1CV处的收率和纯度分别为78.2％和98.1％，洗脱峰截取到1.33CV处的收率和纯度分别为88.4％和96.9％。所有收集液组分总聚合体含量超过上样样品的含量，说明在阳离子洗脱过程中同实施例1一样产生了新的聚合体。

实施例4

(1)阳离子上样样品的制备

表达OX40/PD-L1双特异性抗体的CHO细胞培养液采用PALL公司SUPRAcap HP PDE8和PDE2深层吸附膜包过滤，再用MabSelect PrismA填料进行亲和层析纯化，亲和收集液用2mol/L Tris溶液将pH调节到6.0后用0.22μm滤器过滤后暂存4℃冰箱，用2mol/L醋酸调节pH到5.0，再用超纯水将电导率调节到3.76mS/cm，用0.22μm滤器过滤后作为阳离子上样样品。上述阳离子上样样品蛋白含量为4.4g/L，纯度96.8％，HCP含量896.8ppm。

(2)阳离子交换层析

选择5种不同的CEX填料POROS 50HS、Capto S Impact、Capto MMC、Factogel EMDSO^3-(M)和Nanogel-50SP进行阳离子交换层析测试，阳离子层析的缓冲液、运行程序和收集条件都与实例2相同，都采用分管收集，每1/3CV收集1管，上样的洗脱的保留时间均为6min；

层析柱均采用Diba公司的Omnifit 006EZ-06-25-FF柱(内径6.6mm，柱管长250mm)，其中层析柱1装填POROS 50HS填料，柱高＝19.2cm，CV＝6.57mL；其中层析柱2装填Capto S Impact填料，柱高＝18cm，CV＝6.16mL；其中层析柱3装填Factogel EMD SO^3-(M)填料，柱高＝19cm，CV＝6.5mL；其中层析柱4装填Nanogel-50SP填料，柱高＝20.5cm，CV＝6.97mL；层析柱5装填Capto MMC填料，柱高＝19.5cm，CV＝6.67mL。

(3)检测和分析

POROS 50HS填料的阳离子层析图谱如图5所示，洗脱峰没有出现实施例1和实施2中出现的双峰现象，纯度和收率较高，在2CV收集体积处截峰(紫外吸收值约600mAU)时，收率88.9％，纯度98.7％。Capto MMC填料的层析图谱如图6所示，双特异性抗体分子的疏水性较强，与填料结合较为牢固，洗脱过程未收集到样品，在含1mol/L NaCl(pH7.2)的再生液中都难洗脱下来。Capto S Impact和Factogel EMD SO^3-(M)填料的层析图谱与POROS 50HS填料的层析图谱类似，而Nanogel-50SP填料的层析图谱与实例1中类似，几种填料的检测结果如表1所示。

表1不同的阳离子填料前2个柱体积收集液等体积混合物的检测结果

采用不同的填料进行盐线性梯度纯化双特异性抗体时，分段收集液的聚合体含量和单体含量随收集体积的变化如图7所示，采用POROS 50XS填料时聚合体含量在1CV收集体积时开始快速增加，导致前2个CV收集液混合物的纯度低于上样样品的纯度。采用POROS50HS填料时，前2个CV收集液混合物的纯度较高，该填料较适合用于阳离子盐线性梯度洗脱双特异性抗体。

实施例5

(1)阳离子上样样品的制备

细胞培养液采用3M公司的Zeta Plus 90ZB05A和Emphaze AEX膜包进行澄清过滤，采用MabSelect PrismA填料进行亲和层析纯化，亲和收集液用2mol/L Tris溶液将pH调节到7.2后进行阴离子交换层析，阴离子收集液用1mol/L稀盐酸调节pH到5.17，再用超纯水将电导率调节到3.56mS/cm，用0.22μm滤器过滤后作为阳离子上样样品。上述阳离子上样样品蛋白含量为4.4g/L，纯度97.1％，HCP含量9.4ppm，电导率为3.56mS/cm。

(2)阳离子交换层析

采用pH线性梯度洗脱方式考察阳离子交换层析对双特异性抗体纯化的效果。pH梯度洗脱采用填料Factogel EMD SO^3-(M)装填Omnifit柱，其中柱高＝19cm,CV＝6.5mL，层析柱使用前用0.5mol/L NaOH进清洗，具体层析条件见下表2，采用分段收集，每1/3CV收集一管。

表2阳离子采用pH线性梯度洗脱模式的层析条件

N/A表示不适用

(3)检测分析

阳离子层析图谱如图8所示，当洗脱液组分占比达到100％时，洗脱峰还没有降落到200mAU，继续维持洗脱液组分占比为100％的洗脱条件直到预设的收集停止条件达到，总收集体积8.3CV，洗脱力较弱。平衡液和洗脱液的电导分别为3.0mS/cm和6.0mS/cm，根据实施例1、2和3中盐梯度洗脱的起始收集时的电导率一般在10～15mS/cm之间，增加洗脱液的电导到该区间可能提高洗脱力。检测结果显示聚合体分布在洗脱峰的前后两侧，有部分聚合体在低pH和低电导时从柱上洗脱下来，取第3～20管收集液等比例混合，检测发现收率和纯度分别为79.6％和98.6％，收率相对较低。

实施例6

(1)阳离子上样样品制备

CHO细胞培养液采用Merck Millipore公司Millistak C0HC和X0HC深层吸附膜包过滤，再用MabSelect PrismA填料进行亲和层析纯化，用1M Tris回调pH到5.0左右，用超纯水稀释电导到3.9mS/cm左右，通过过滤0.22μm滤器过滤后作为阳离子上样样品。样品1浓度12.8g/L，pH 5.03，电导率3.94mS/cm；样品2浓度14.4g/L，pH 5.02，电导率3.85mS/cm。两个样品的纯度均为97.4％，HCP含量1323.9ppm。

(2)阳离子交换层析

采用pH等度洗脱方式考察阳离子交换层析对双特异性抗体纯化的效果。采用阳离子预装柱POROS^TM GoPure^TM HS(POROS 50HS填料，内径12mm，高度5cm,柱体积5.7mL)，样品1和样品2分别上样28ml和25ml。样品1和样品2的平衡液均为50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)，冲洗液均为20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)，洗脱液分别为50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl(pH7.2，电导率8.52mS/cm)和25mmol/LTris-HCl，25mmol/L NaCl(pH7.2，电导率4.74mS/cm)，洗脱10CV，收集条件和其他步骤层析条件同实施例4。

(3)检测分析

阳离子层析图谱如图9和图10所示，洗脱开始后pH波动较大，电导率低的洗脱液洗脱10CV还未将结合在阳离子柱上的双特异性抗体分子洗脱下来(图10)，电导率较高的洗脱液虽然在10个CV内洗脱下双特异性抗体分子，洗脱体积小于3CV，且收率较高，但抗体分子的纯度相对较低，HCP的去除效果较差，第1～6管总体积2CV，收率93.8％，纯度97.1％，HCP含量为371ppm。因此洗脱液电导率4.74～8.52mS/cm之间，POROS 50HS填料纯化采用pH等度洗脱模式纯化双特异性抗体的效果不好。

实施例7

(1)阳离子上样样品的制备

细胞培养液采用实施例2中相同条件进行澄清过滤，采用实施例3中进行亲和层析纯化，亲和收集液进行pH灭活处理(调节样品pH到3.5，室温下处理65min，回调pH到6.0)，再进行深层吸附过滤(ADF)处理，调节ADF收集液pH到5.0，用超纯水调节电导率，通过过滤0.22μm滤器过滤后作为阳离子上样样品。

(2)阳离子交换层析

采用等度洗脱模式测试阳离子填料POROS 50HS在几种不同条件下的纯化效果。测试条件1：上样样品浓度7.6g/L，纯度97.8％，HCP含量32.3ppm，电导率5.92mS/cm，上样载量50g/L。层析柱为GE XK26×40柱(CV＝132.5ml)，上样和洗脱时线性流速300cm/h，平衡洗脱液和冲洗洗脱液均为50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0，电导率约为3.0mS/cm)，洗脱液为50mmol/L醋酸-醋酸钠+150mmol/L NaCl(pH5.0,电导率约为17.39mS/cm)，洗脱5CV，紫外吸收值上升到200mAU开始收集，降落到400mAU停止收集。

测试条件2：上样样品浓度7.44g/L，pH 5.06，电导率3.91mS/cm，纯度97.2％，GEXK16×40柱(CV＝40ml)，洗脱液为50mmol/L醋酸-醋酸钠+120mmol/L NaCl(pH5.0,电导率约为14.75mS/cm)，其他参数同测试条件1。

测试条件3：上样样品浓度13.8g/L，pH 5.04，电导率3.17mS/cm，纯度97.2％，HCP含量8.5ppm。层析柱为Merck Millipore VL11柱，上样和洗脱时线性流速200cm/h，洗脱液为50mmol/L醋酸-醋酸钠+110mmol/L NaCl(pH5.0,电导率约为12.55mS/cm)，洗脱6CV，其他条件同测试条件1。

(3)检测分析

三种等度洗脱测试条件的检测结果如表3所示，洗脱液电导率在17.39mS/cm时，收率较高，但去除聚合体的效果较差，收集液的纯度比上样样品差，可能是洗脱条件相对较强使得双特异性抗体在洗脱过程产生新的聚合体；电导率为14.75mS/cm收率有所降低，但纯度较好；电导率为12.55mS/cm收率较高，但收率较低，收集体积较大，6个CV结束后还有样品未从柱上洗脱下来，若增加洗脱体积，收集体积将更大，不利于后续的工艺过程操作。综合上述分析，填料POROS 50HS采用等度洗脱纯化双特异性抗体时，电导率需控制在12.55～14.75mS/cm之间。

表3三种等度洗脱测试条件的检测结果对比

实施例8

(1)阳离子上样样品的制备

阳离子上样样品的制备同实施例1，上样样品浓度8.4g/L，pH 5.07，4.16mS/cm，纯度97.2％，HCP含量1846.5ppm。

(2)阳离子交换层析

NaCl通常用于下游阳离子纯化的洗脱缓冲液中，通过前述的实施例，发现多数情况下，含有强电解质NaCl的洗脱液，无论是线性梯度洗脱还是等度洗脱，效果都不是很理想，本实施例采用弱酸盐醋酸-醋酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液的唯一成分，考察其对双特异性抗体的纯化效果。

测试条件1：Capto S Impact填料，VL11柱(CV＝23.0ml)，上样载量70g/L；测试条件2：POROS 50HS填料，VL11柱(CV＝17.4ml)，上样载量50g/L。两个测试条件的平衡液和洗脱液同实施例6，洗脱缓冲液为500mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)，线性梯度(0-100％)洗脱10CV，收集条件和其他层析程序同实施例6。

(3)检测分析

两种测试条件的阳离子层析图谱如图11和图12所示，两个阳离子洗脱峰主峰后均未出现如实施例1和2中出现的突起的峰，洗脱体积均比采用含NaCl的洗脱缓冲液大。使用POROS 50HS填料时洗脱峰较宽，收集体积较大，共6个CV左右，而相同的收集条件下，使用Capto S Impact填料，共收集体积3.7CV左右。两个盐线性梯度洗脱测试条件的检测结果对比如表4所示，两种填料的收率和纯度均比采用含NaCl的盐线性洗脱时高(如实施例1、2和3)，当停止收集点设置在700～800mAU之间时POROS 50HS填料的收率达到92.4％，纯度达到99％；当停止收集点设置在500～600mAU之间时，Capto S Impact填料的收率达到89.2％，纯度达到99.5％。

表4两种盐线性梯度洗脱测试条件的检测结果对比

实施例9

(1)阳离子上样样品的制备

阳离子上样样品的制备同实施例6，多个不同批次处理得到的样品信息如表5所示。

表5阳离子上样样品信息表

(2)阳离子交换层析

采用Capto S Impact填料测试多种层析条件下纯化OX40/PD-L1双特性抗体的效果，洗脱液电导率变化范围12.7～17.6mS/cm，pH变化范围4.8～5.5，均采用等度洗脱模式，部分阳离子层析缓冲液和部分测试条件如表6和表7所示。表7中除13#测试条件使用GEXK26柱(CV＝114.1ml)，其他均采用VL11层析柱，CV在17～23.0mL之间，洗脱体积数为5～6CV。

表6阳离子层析缓冲液信息

表7部分阳离子层析测试条件信息

(3)检测和分析

部分测试条件的检测结果如表8所示，通过测试条件1#～3#的对比发现，洗脱液电导率在13.5～15.5mS/cm范围内，洗脱收集液的收率和纯度较高，停止收集的条件设置在400～800mAU之间纯度均可达到99.0％以上。测试条件1#和3#的洗脱液电导率比较接近，测试条件1#pH比3#低，导致测试条件3#的收率较低。通过测试条件4#～7#的对比发现，洗脱液电导率在13.8～17.3mS/cm范围内，洗脱收集液的纯度随着电导率升高而降低，其中电导率在13.8～14.4的范围内电导率较高，去除聚合体的效果较好；对比测试条件5#和8#发现上样样品的电导率会影响洗脱，电导率为10.0mS/cm时，洗脱峰在设定的5CV的洗脱过程中没有完全洗脱下来，而同一批样品将电导率为7.55mS/cm时，洗脱峰正常。

对比测试条件9#和10#发现低电导率的上样样品(3.74mS/cm)采用不同的平衡和洗脱条件，收集液的收率、纯度和HCP含量没有差异，但洗脱峰峰形差异较大，测试条件9#和10#的层析图谱如图13和图14所示。平衡和清洗液电导率较低时，如3.0mS/cm，洗脱时发生了洗脱峰“裂峰”的现象(图13)，当把分段收集的各组分重新采用相同程序运行时还是出现同样的洗脱峰“裂峰”的现象，可能是在洗脱过程发生了组氨酸质子化或其他引起双特异性抗体分子构象的可逆变化。当增加平衡缓冲液和冲洗缓冲液的电导率后，洗脱峰峰形和其他测试条件的峰形类似。

对比测试条件11#和12#发现洗脱液的pH较低会导致抗体分子结合在填料上洗脱不下来，导致收集不到样品，洗脱液的pH大于5.2，电导率16.6～17.6mS/cm的范围内，收率较高，但几乎没有去除聚合体的效果。

对比测试条件13#～15#发现平衡缓冲液和冲洗缓冲液的电导率在5.7～10.5mS/cm内时，对洗脱样品的纯度没有影响，但电导率在8.0左右时的收率稍高一些。

综合上述分析，上样样品的电导率，平衡缓冲液和冲洗缓冲液的电导率，洗脱液的电导率和pH，对样品的收率和纯度影响较大，应该控制在一个合理的区间。

表8部分测试条件的检测结果对比

测试条件	收集体积(CV)	收率(％)	纯度(％)	HCP含量(ppm)
					1#	2.3	99.9	98.5	2.3
2#	3.3	99.3	98.9	2.4
					3#	2.7	91.2	99.1	3.6
4#	3.0	80.9	98.8	0.9
					5#	3.0	80.1	99.5	1.0
6#	2.7	82.2	98.5	1.5
					7#	2.0	81.4	98.2	1.1
8#	3.6	60.0	99.6	1.0
					9#	2.7	93.3	99.2	小于0.2
10#	2.7	93.3	99.2	小于0.2
					11#	0	N/A	N/A	N/A
12#	2.2	99.5	92.4	3.1
					13#	4.1	90.6	98.6	9.7
14#	4.1	93.8	98.7	8.9
					15#	4.2	92.5	98.7	7.4

注：N/A表示不适用，在11#测试条件下洗脱阶段未收集到样品。

实施例10

(1)阳离子上样样品的制备

阳离子上样样品的制备同实施例6，阳离子上样样品信息：浓度14g/L，pH 5.01，6.88mS/cm，纯度97.6％。

(2)阳离子交换层析

采用Capto S Impact填料，VL11柱，CV＝21.52mL；洗脱缓冲液pH5.0-5.4，洗脱液电导率22.0～27.0mS/cm，冲洗液为150mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)，四种洗脱液分别对应测试条件1#～4#：(1)500mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)；(2)475mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)；(3)500mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.2)；(4)525mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.4)。上样载量80g/L，上样完成后冲洗液和洗脱液采用20％～80％的线性梯度进行洗脱，洗脱体积10CV。测试条件1收集条件同实施例6，测试条件2～4起始收集点是洗脱峰紫外吸收值等于200mAU，终止收集点是洗脱峰紫外吸收值等于1200mAU。

(3)检测分析

测试条件1的阳离子层析图谱如图15所示，洗脱峰的降落段的形态和实施例7中阳离子层析图谱图12的形态有不同之处，收集的体积偏大。四种测试条件下阳离子收集液的收率和纯度如表9所示，终止收集的UV280值设定在888-1340mAU之间时收率大于91.0％和纯度大于99.1％。当终止收集的UV280设置在1200mAU时，四种测试条件的收率和纯度对比发现，测试条件2#是最好的。终止收集的UV280在1300mAU停止收集时，四种测试的收率大于90.0％，纯度大于99.0％。采用本实施例的方法，洗脱液的参数在较宽的操作范围内(电导率的范围19.0～27.0mS/cm，pH 5.0～5.4)，收集液的收率和纯度较高，收集液的电导率在13.5～15.5mS/cm范围内。

表9四种测试条件下阳离子收集液的收率和纯度

实施例11

(1)阳离子上样样品的制备

阳离子上样样品的制备同实施例6，阳离子上样样品信息：浓度10.1g/L，pH 5.05，3.58mS/cm，SEC-HPLC纯度为95.5％。

(2)阳离子交换层析

采用Capto S Impact填料，VL11柱，CV＝21.52mL；平衡缓冲液、冲洗缓冲液和洗脱液A：50mM醋酸-醋酸钠，pH 4.93，2.57mS/cm；洗脱液B：(B1)50mM醋酸-醋酸钠，500mM KCl，pH5.0，60.0mS/cm；(B2)50mM醋酸-醋酸钠，250mM Na₂SO₄，pH5.0，63.0mS/cm；阳离子交换层析程序：平衡5CV，上样载量80g/L，冲洗3CV，0-100％B线性梯度洗脱20CV，收集200mAU-1200mAU组分，再生3CV，CIP 3CV。

(3)检测分析

采用洗脱液B1和B2的阳离子收集液的收率分别为95.7％和99.6％，SEC-HPLC纯度分别为96.8％和96.0％。上述结果显示阳离子洗脱液成分含有强电解质如KCl和Na₂SO₄，采用盐线性梯度洗脱时，阳离子收集液收率较高，但对聚合体的去除效果不佳，和前述实例中阳离子洗脱液成分含有NaCl的结果类似。

实施例12

(1)阳离子上样样品的制备

阳离子上样样品的制备同实施例6，阳离子上样样品信息：浓度8.2g/L，pH 4.95，6.61mS/cm，SEC-HPLC纯度为98.0％。

(2)阳离子交换层析

采用Capto S Impact填料，VL11柱，CV＝21.52mL；实验1：平衡缓冲液、冲洗缓冲液和洗脱液A1：60mM组氨酸盐酸盐，pH 4.96，4.77mS/cm；洗脱液B1：400mM组氨酸盐酸盐，pH5.41，20.5mS/cm；实验2：平衡缓冲液、冲洗缓冲液和洗脱液A2：50mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH5.0，6.83mS/cm；洗脱液B2：400mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH5.0，6.83mS/cm；阳离子交换层析程序：平衡5CV，上样载量80g/L，冲洗3CV，0-100％B线性梯度洗脱20CV，收集200mAU-1200mAU组分，再生3CV，CIP 3CV。

(3)检测分析

采用洗脱液B1和B2的阳离子收集液的收率分别为93.5％和91.8％，SEC-HPLC纯度分别为98.1％和98.4％，收集体积分别为2.2CV和2.1CV。上述结果显示阳离子洗脱液成分为弱酸盐，如400mM组氨酸盐酸盐和枸橼酸枸橼酸钠，采用盐线性梯度洗脱时，阳离子收集液收率较高，但对聚合体的去除效果不明显，可能与上样样品的纯度较高有关。洗脱体积较醋酸-醋酸钠体系(约3CV)大，说明本案例中采用的两个线性梯度洗脱的缓冲液体系的洗脱力偏强，降低洗脱液中组氨酸盐酸盐和枸橼酸枸橼酸钠的浓度或改变收集条件可能会提高聚合体的去除能力。

Claims (10)

1.一种利用阳离子交换层析纯化疏水性蛋白的方法，其层析步骤包括平衡、上样、冲洗和洗脱，其特征在于，在层析过程中所用阳离子洗脱液不包含强电解质成分，所用阳离子冲洗液电导率高于上样样品；

所述阳离子平衡液、冲洗液和洗脱液所用的盐包括弱酸盐和/或磷酸盐类。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阳离子交换层析所用填料为含选自由磺酸基(SO₃ ^2-)、磺甲基(S)、磺丙基(SP)和磷酸基(P)构成的群组中的基团的强阳离子交换剂或含选自由羧甲基(CM)、羧基(COO-)构成的群组中的离子交换基团的弱阳离子交换剂，优选含磺酸基或磺丙基的强阳离子交换剂；

和/或，所述的阳离子交换层析采用结合-洗脱模式；

和/或，所述阳离子平衡液、冲洗液和洗脱液为醋酸-醋酸盐缓冲液、枸橼酸-枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或者组氨酸盐缓冲液，优选醋酸-醋酸盐缓冲液；较佳地，所述的阳离子平衡液、冲洗液和洗脱液均不包含强电解质成分；

和/或，所述的洗脱为盐梯度洗脱或者盐等度洗脱，所述的盐梯度洗脱优选盐线性梯度洗脱。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述盐等度洗脱的洗脱液电导率为12.55～17.6mS/cm，pH值为4.8～5.5；

所述的盐线性梯度洗脱的洗脱液电导率为19.0～25.0mS/cm，pH值为5.0～5.4。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，当所述填料为Capto S Impact时，所述的盐等度洗脱洗脱液电导率的范围为13.5～15.5mS/cm；当所述填料为Poros 50HS时，所述的盐等度洗脱洗脱液电导率的范围为12.55～14.75mS/cm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冲洗液的pH为4.9～5.5，优选5.0；电导率为3.0～10.5mS/cm，优选5.7～10.5mS/cm，更优选8.0mS/cm；

和/或，所述平衡缓冲液的pH为4.9～5.5，优选5.0；电导率为3.0～10.5mS/cm，优选5.7～10.5mS/cm，更优选8.0mS/cm；

和/或，上样样品的电导率为3.74～10.5mS/cm，优选3.74～7.55mS/cm。

6.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述的疏水性蛋白为抗体，如双特异性抗体或者单抗；所述的双特异性抗体优选OX40/PD-L1双特异性抗体；更优选包含特异性结合PD-L1的单结构域抗原结合位点和特异性结合OX40的Fab片段。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述双特异性抗体包含多肽链1：VH-CH1-CH2-CH3-接头-VHH，以及多肽链2：VL-CL；较佳地，所述VHH的CDR1～3分别如序列表中SEQID NO:1～3所示，所述VH的CDR1～CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4～6所示的，且所述VL的CDR1～CDR3分别如SEQ ID NO:7～9所示。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述接头包含氨基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数，例如，n为1～7中的正整数，如，n为1、2、3、4、5或6，所述接头的氨基酸序列优选如序列表中SEQ ID NO:15所示；

和/或，所述VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示；

和/或，所述VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示；

和/或，所述VHH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示；

和/或，所述CH1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:16所示；

和/或，所述CH2-CH3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:17所示；

和/或，所述CL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:18所示。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的多肽链1含有如SEQ ID NO:13所示的序列或保留该序列功能的变体；较佳地，所述的变体与如SEQ ID NO:13所示的序列的同一性为90％以上，优选95％以上，更优选99％以上；

和/或，所述的多肽链2含有如SEQ ID NO:14所示的序列或保留该序列功能的变体；较佳地，所述的变体与如SEQ ID NO:14所示的序列的同一性为90％以上，优选95％以上，更优选99％以上。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述OX40/PD-L1双特异性抗体是由CHO细胞培养获得的全人源双特异性抗体；

较佳地，所述的OX40/PD-L1双特异性抗体的疏水性强于伊匹单抗。

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