CN112210572B - 一种重组人抗体融合蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组人抗体融合蛋白的纯化方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供一表达重组人抗体融合蛋白基因的转染载体；(b)将所述转染载体转染入哺乳动物细胞并培养，得到包含重组人抗体融合蛋白和杂质的原料液；(c)对所述原料液进行亲和层析，从而得到亲和层析液；和(d)对所述亲和层析液进行低pH孵育和深层过滤，从而制得第一纯化液即纯化的重组人抗体融合蛋白；其中，所述低pH孵育的pH值为3‑4，使用柠檬酸或其盐调节pH。本发明方法不仅能够高效地去除杂质，且保留了目标蛋白——重组人抗体融合蛋白的活性，从而制得高纯度高浓度重组人抗体融合蛋白，以用于治疗哺乳动物眼部新生血管疾病。

Description

一种重组人抗体融合蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及一种高纯度重组人抗体融合蛋白的制备方法。
背景技术
血管内皮生长因子(VEGF)是能够在生物体内诱导血管形成(血管新生)、在血管内皮细胞中特异性表达的肝素结合型的生长因子。人VEGF蛋白于1989年得到鉴定，此外，已经克隆了其基因，并对其基因序列进行了测序。
抗体融合蛋白是指利用基因工程技术将抗体片段与其他生物活性蛋白融合所得的产物。可在原核细胞(如大肠杆菌)也可在真核细胞中进行表达。原核表达***的特点是时程短，费用低，其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达***的特点是蛋白翻译后加工机会多，产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐，产物提纯复杂等缺点。由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。蛋白质分子中关键活性部位氨基酸残基的改变，会影响其生理功能，甚至造成分子病(molecular disease)，甚至蛋白质关键部位仅一个氨基酸残基的异常，就可对蛋白质理化性质和生理功能有明显的影响。例如镰状细胞贫血，就是由于血红蛋白分子中两个β亚基第6位正常的谷氨酸变异成了缬氨酸，从酸性氨基酸换成了中性支链氨基酸，降低了血红蛋白在红细胞中的溶解度，使它在红细胞中随血流至氧分压低的外周毛细血管时，容易凝聚并沉淀析出，从而造成红细胞破裂溶血和运氧功能的低下。另实验证明，若切除了促肾上腺皮质激素或胰岛素A链N端的部分氨基酸，它们的生物活性也会降低或丧失，可见关键部分氨基酸残基对蛋白质和多肽功能的重要作用。
本领域需要开发新的保留了目标蛋白——重组人抗体融合蛋白的活性的同时能够高效地去除杂质，从而制得高纯度高浓度重组人抗体融合蛋白。
发明内容
本发明目的是提供一种不仅能够高效地去除杂质，且保留了目标蛋白——重组人抗体融合蛋白的活性的纯化方法，从而制得高纯度高浓度重组人抗体融合蛋白，以用于治疗眼部新生血管疾病。
本发明的第一方面，提供一种重组人抗体融合蛋白的纯化方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供一表达重组人抗体融合蛋白基因的转染载体；
(b)将所述转染载体转染入哺乳动物细胞并培养，得到包含重组人抗体融合蛋白和杂质的原料液；
(c)对所述原料液进行亲和层析，从而得到亲和层析液；和
(d)对所述亲和层析液进行低pH孵育和深层过滤，从而制得第一纯化液即纯化的重组人抗体融合蛋白；
其中，所述低pH孵育的pH值为3-4，使用柠檬酸或其盐调节pH。
在另一优选例中，步骤(c)中，亲和层析为Protein A亲和层析。
在另一优选例中，步骤(d)中，所述低pH孵育的时间为1-8小时，较佳地为2-4小时，更佳地为2小时、3小时、4小时。
在另一优选例中，步骤(d)中，所述低pH孵育的pH值为3.4-3.6。
在另一优选例中，步骤(d)中，所述低pH孵育的温度为-28℃至28℃，较佳地为-5℃至25℃。
在另一优选例中，低pH孵育中，柠檬盐选自：柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钙、柠檬酸铵。
在另一优选例中，步骤(d)深层过滤使用过滤滤器通量为10-250L/m2，较佳地为40-180L/m2，更佳地为100-150L/m2；优选地，使用滤器NP7PDE21。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤
(e)将所述的第一纯化液上样于阴离子层析柱进行阴离子层析，得到阴离子层析液；
(f)将所述阴离子层析液上样于阳离子层析柱进行阳离子层析，得到阳离子层析液；
(g)将所述的阴离子层析液进行纳滤，得到第二纯化液；和任选地
(h)使用深层过滤器对所述的第二纯化液进行深层过滤，得到第三纯化液即纯化的重组人抗体融合蛋白。
在另一优选例中，所述的阴离子层析用有机酸平衡过的层析柱，较佳地为柠檬酸、Tris，更佳地为柠檬酸。
在另一优选例中，步骤(e)中，阴离子层析的平衡液为0.001-0.05M柠檬酸缓冲液，pH 5.0-6.0；优选地为0.02-0.05M柠檬酸，pH 5.3-5.7，较佳地为0.05M柠檬酸，pH5.5。
在另一优选例中，在步骤(e)中，使用层析柱Bestarose Diamond MIX-A进行阴离子层析。
在另一优选例中，所述的阳离子层析用有机酸平衡过的层析柱，较佳地为磷酸缓冲液、Tris，更佳地为磷酸缓冲液。
在另一优选例中，步骤(f)中，阳离子层析的洗脱液为0.001-0.05M磷酸缓冲液，pH为6.0-7.0；优选地为0.001-0.05M磷酸缓冲液及含0.1-1M NaCl的0.001-0.05M磷酸缓冲液，pH为6.0-7.0；较佳地为0.01M磷酸缓冲液及含0.5M NaCl的0.01M磷酸缓冲液(pH 6.2)。
在另一优选例中，在步骤(f)中，使用层析柱用介质粒径小于60μm的层析柱进行阳离子层析。
在另一优选例中，所述的阳离子层析柱为Nuvia HR-S。
在另一优选例中，在步骤(g)中，深层过滤使用过滤滤器通量为10-250L/m2，较佳地为40-180L/m2，更佳地为100-150L/m2。
在另一优选例中，在步骤(g)中，纳滤的滤膜孔径小于20nm。
在另一优选例中，在步骤(h)中，所述的深层过滤使用滤器孔径为0.1-5μm，较佳地为0.15-4μm，更佳地为0.15-3.5μm。
在另一优选例中，低pH孵育中，柠檬酸浓度为0.5-3mol/L。
在另一优选例中，低pH孵育中，所述柠檬酸浓度1-2mol/L，较佳地为1mol/L。
在另一优选例中，所述转染载体是通过重组人抗体融合蛋白基因***哺乳动物表达载体中获得的。
在另一优选例中，将人抗体融合蛋白基因***pCHO 1.0载体中的Avr II/Pac I酶切位点之间。
在另一优选例中，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
在另一优选例中，所述的哺乳动物细胞为CHO-DG44细胞。
在另一优选例中，所述的重组人抗体融合蛋白为哺乳动物VEGFR(血管内皮生长因子受体)融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组人抗体融合蛋白为VEGFR1和VEGFR2的Fc融合蛋白，较佳地，所述的重组人抗体融合蛋白包括如SEQ ID No.:1所示的氨基酸序列，更佳地，所述的重组人抗体融合蛋白为如SEQ ID No.:1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的重组人抗体融合蛋白通过DNA重组技术获得。
在另一优选例中，所得的纯化的重组人抗体融合蛋白的SEC-HPLC纯度≥99.8％。
在另一优选例中，所得的纯化的重组人抗体融合蛋白的SEC-HPLC纯度≥99.9％。
在另一优选例中，所得的纯化的重组人抗体融合蛋白的HCP低于45ng/mg，较佳地低于10ng/mg，更佳地低于1.1ng/mg。
在另一优选例中，所得的纯化的重组人抗体融合蛋白的HCD低于0.1pg/mg，较佳地低于0.01pg/mg。
本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物包括i)使用第一方面所述的方法制得的纯化的重组人抗体融合蛋白；和ii)药学上可接受的载体。
本发明第三方面，提供一种第二方面所述的药物组合物在制备用于治疗眼部新生血管的药物中的用途。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1示出了深层过滤后重组人抗体融合蛋白的SEC-HPLC。
图2示出了造模后给药前(造模后2周，D15)、1mg/眼给药后1周(D23)和给药后2周(D30)的OCT。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地开发了一种重组人抗体融合蛋白的纯化方法，其不仅能够高效地去除杂质(如HCP、HCD)，且保留了目标蛋白——重组人抗体融合蛋白的活性，从而得到纯化重组人抗体融合蛋白，以用于治疗激光诱导脉络膜新生血管疾病。在此基础上，完成了本发明。
术语
重组人抗体融合蛋白：即Ig G1的Fc片段融合蛋白，是指在基因水平上将VEGFR1和VEGFR2基因同免疫球蛋白Ig G1的Fc片段基因相连，并在真核表达***中表达的重组蛋白。
优选地，本发明所用的重组人抗体融合蛋白氨基酸序列包含SEQ ID No.:1所示的序列，更优选的，本发明所述的Fc融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID No.:1所示的序列：SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No.:1)。
HCP：即宿主蛋白，宿主蛋白残留，本实施例中指来自于CHO-DG44细胞株的宿主蛋白。
HCD：即宿主细胞DNA，本实施例中指来自于CHO-DG44细胞株的宿主DNA
SEC-HPLC:体积排阻色谱(SEC)是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法。SEC-HPLC测定纯度，参照《中国药典》2015年版四部<0514>分子排阻色谱法，高效液相色谱仪(Agilent，1260)推荐方法。
荧光定量PCR法：参照《中国药典》2015年版四部<3407>外源性DNA残留量测定法，荧光定量PCR仪为ABI公司(StepOne Plus)。本发明中，使用湖州申科生物技术有限公司CHO细胞残留DNA检测试剂盒测定HCD。
酶联免疫法(ELISA)：参照酶标仪(Molecula Devices，型号SpectraMax i3x)推荐的方法，测定HCP。本发明中，使用试剂盒为Cygnus公司CHO Host Cell Proteins ELISAKit。
阴离子交换柱
适用于本发明的阴离子交换柱包括Bestarose Diamond MIX-A。
在本发明中，层析介质的用量没有特别限制，通常可根据待纯化的原料中所含的重组人抗体融合蛋白数量而定。
阳离子交换柱
如本文所用，术语“本发明的阳离子交换柱”指可特异性地将重组人抗体融合蛋白和其他杂质有效分离的阳离子交换树脂。
适用于本发明的阳离子交换树脂没有特别限制，本发明中，阳离子层析使用介质粒径小于60um的层析柱，较佳地为Nuvia HR-S。
重组人抗体融合蛋白的纯化方法
本发明重组人抗体融合蛋白的纯化方法包括以下步骤：
(a)提供一表达重组人抗体融合蛋白基因的转染载体；
(b)将所述转染载体转染入哺乳动物细胞并培养，得到包含重组人抗体融合蛋白和杂质的原料液；
(c)对所述原料液进行亲和层析，从而得到亲和层析液；和
(d)对所述亲和层析液进行低pH孵育和深层过滤，从而制得第一纯化液即纯化的重组人抗体融合蛋白；
其中，所述低pH孵育的pH值为3-4，使用柠檬酸或其盐调节pH。
优选地，步骤(c)中，亲和层析为Protein A亲和层析。
优选地，步骤(d)中，所述低pH孵育的时间为1-8小时，较佳地为2-4小时，更佳地为2小时、3小时、4小时。
优选地，步骤(d)中，所述低pH孵育的pH值为3.4-3.6；所述低pH孵育的温度为-28℃至28℃，较佳地为-5℃至25℃。
优选地，低pH孵育中，柠檬盐选自：柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钙、柠檬酸铵。
优选地，步骤(d)深层过滤使用过滤滤器通量为10-250L/m2，较佳地为40-180L/m2，更佳地为100-150L/m2；优选地，使用滤器NP7PDE21。
优选地，所述方法还包括步骤
(e)将所述的第一纯化液上样于阴离子层析柱进行阴离子层析，得到阴离子层析液；
(f)将所述阴离子层析液上样于阳离子层析柱进行阳离子层析，得到阳离子层析液；
(g)将所述的阴离子层析液进行纳滤，得到第二纯化液；和任选地
(h)使用深层过滤器对所述的第二纯化液进行深层过滤，得到第三纯化液即纯化的重组人抗体融合蛋白。
优选地，步骤(e)中，使用层析柱Bestarose Diamond MIX-A进行阴离子层析，所述的阴离子层析用有机酸平衡过的层析柱，较佳地为柠檬酸、Tris，更佳地为柠檬酸。优选地，阴离子层析的平衡液为0.001-0.05M柠檬酸缓冲液，pH 5.0-6.0；优选地为0.02-0.05M柠檬酸,pH 5.3-5.7，较佳地为0.05M柠檬酸，pH 5.5。
优选地，所述的阳离子层析用有机酸平衡过的层析柱，较佳地为磷酸缓冲液、Tris，更佳地为磷酸缓冲液。
优选地，步骤(f)中，使用层析柱用介质粒径小于60μm(如Nuvia HR-S)的层析柱进行阳离子层析，阳离子层析的洗脱液为0.001-0.05M磷酸缓冲液，pH为6.0-7.0；优选地为0.001-0.05M磷酸缓冲液及含0.1-1M NaCl的0.001-0.05M磷酸缓冲液，pH为6.0-7.0；较佳地为0.01M磷酸缓冲液及含0.5M NaCl的0.01M磷酸缓冲液(pH 6.2)。
优选地，在步骤(g)中，深层过滤使用过滤滤器通量为10-250L/m2，较佳地为40-180L/m2，更佳地为100-150L/m2。
优选地，在步骤(g)中，纳滤的滤膜孔径小于20nm。
优选地，在步骤(h)中，所述的深层过滤使用滤器孔径为0.1-5μm，较佳地为0.15-4μm，更佳地为0.15-3.5μm。
优选地，低pH孵育中，柠檬酸浓度为0.5-3mol/L，较佳地为1-2mol/L，更佳地为1mol/L。
优选地，所述转染载体是通过重组人抗体融合蛋白基因***哺乳动物表达载体pCHO 1.0载体中的Avr II/Pac I酶切位点之间中获得的，优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞(如CHO-DG44细胞)。
优选地，所述的重组人抗体融合蛋白为哺乳动物VEGFR(血管内皮生长因子受体)融合蛋白。
优选地，所述的重组人抗体融合蛋白为VEGFR1和VEGFR2的Fc融合蛋白，较佳地，所述的重组人抗体融合蛋白包括如SEQ ID No.:1所示的氨基酸序列，更佳地，所述的重组人抗体融合蛋白为如SEQ ID No.:1所示的氨基酸序列。
药物组合物
优选地，所述的药物组合物包括i)使用如上所述的方法制得的纯化的重组人抗体融合蛋白；和ii)药学上可接受的载体。
优选地，所述的纯化的重组人抗体融合蛋白SEC-HPLC检测纯度大于99.8％，优选地大于99.9％。
优选地，所述的纯化的重组人抗体融合蛋白为重组人血管内皮生长因子Fc融合蛋白，更佳地所述的重组人抗体融合蛋白为重组人血管内皮生长因子受体1和/或受体2Fc融合蛋白，更佳地VEGFR1和VEGFR2基因同免疫球蛋白Ig G1的Fc片段基因相连，并在真核表达***中表达的重组蛋白。更优选地为VEGFR1和VEGFR2不同受体的共2-3个胞外区融合连上免疫球蛋白Ig G1的Fc片段。优选地，所述的重组人抗体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.:1所示。
本发明的主要优点包括：
1.本发明方面纯化的重组人抗体融合蛋白的纯度高，工艺相关杂质含量低，操作简单，可以替代现有重组人抗体融合蛋白的使用和制备。
2.本发明的制备方法能够表达具有适宜糖基化模式的高纯度重组人抗体融合蛋白。
3.与其他真核表达***相比，DG44表达***可以高效表达外源基因，表达量高；
4.纯化过程中，使用亲和层析-阴离子-阳离子获得纯度大于99.8％的抗体蛋白，是一种操作简单方便，低成本，高产出的抗体片段纯化制备方法；
5.由于生物药物中微量的工艺相关杂质如宿主细胞蛋白质(HCP)和宿主细胞DNA(HCD)残留可能对生物药物的安全性和药效性能产生一定影响，因此，精准的HCP和HCD控制对重组人抗体融合蛋白的质量和安全尤为重要。
6.本发明方法纯化得到的重组人抗体融合蛋白，在灵长类的玻璃体腔作用时间长，可以减少药物的使用次数。
下面将对本发明的技术方案进行清除完整的说明，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都是本发明的保护范围。
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第四版，科学出版社)、《细胞实验指南》(科学出版社，2001年)、《蛋白质技术手册》(科学出版社，2000年)、《抗体技术实验指南》(科学出版社，2002年)等手册和相关药物法规、规定以及本文所用的试剂、载体等的厂商说明来实施。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。
实施例1重组人抗体融合蛋白基因的工程细胞株构建
pCHO 1.0载体经AvrII(CCTAGG)和PacI(TTAATTAA)双酶切后，与重组人抗体融合蛋白基因片段连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的LB琼脂培养板上，通过抗性筛选，平板上获得单菌落转化子。挑选单克隆菌落培养后提取重组质粒，提取的重组质粒AvrII/PacI双酶切进行DNA测序，重组质粒测序结果与预期序列比对一致。
将克隆正确的重组质粒Pvu I单酶切处理后转化到处于对数生长期的CHO-DG44宿主细胞(购自Invitrogen公司)，获得工程菌株，将工程菌接种到含MTX(氨甲喋呤，500nM/L)的培养基中，37℃，5％CO2，110rpm培养到对数生长期，根据细胞表达量选定本实施例重组人抗体融合蛋白产品的工程细胞株。选定表达水平大于3.0g/L，远远高于现有CHO-K1和CHO-S细胞的表达量；经原位杂交技术分析鉴定表明重组人抗体融合蛋白表达载体已经完全整合到工程细胞株的染色体内。其中，所述重组人抗体融合蛋白氨基酸序列为SEQ IDNo.:1所示的序列。
实施例2重组人抗体融合蛋白的纯化及鉴定
取实施例1的工程细胞株经过IPTG诱导培养，取培养上清液1000ml。
1.亲和层析
取滤液上样于“20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH 7±0.5”平衡过的Protein ADiamond亲和层析柱(填料来自博格隆上海生物技术有限公司)进行层析，用“50mmol/L CB，pH5±1”淋洗，“50mmol/L CB，pH4.5±0.5”洗脱，用ELISA法检测含本实施例重组人抗体融合蛋白的峰，收集流穿液。
2.低pH孵育和深层过滤
2.1低pH孵育
缓冲液的选择：步骤1的亲和层析流穿液直接用1mol/L Tris调到pH 5.5，放在2～8℃待检；取同一批次步骤1的亲和层析流穿液用酸性滴定液(浓度：1mol/L)调重组人抗体融合蛋白pH到3.0，室温(18～26℃)下保持3小时，然后用碱性滴定液回调pH到5.5。测定单体纯度，结果如表1
表1不同酸或者酸的缓冲液对Fc融合蛋白单体纯度的影响
Figure BDA0002728910110000091
结果表明：使用相同浓度的1mol/L的盐酸、磷酸及其缓冲液滴定液，得到相同pH(3.0)的条件下，获得的重组人抗体融合蛋白单体纯度低于柠檬酸和柠檬酸盐缓冲液的条件。
孵育时间和pH选择：对照步骤1的亲和层析流穿液直接用柠檬酸及柠檬酸盐缓冲液调节pH至5.5，放在2～8℃待检。用柠檬酸或柠檬酸盐缓冲液调节pH至3.2、3.4、3.6、3.8、4.0，室温(18～26℃)孵育2h、4h、6h、8h后回调pH5.5。低pH孵育对产品的影响见下表2
生物学活性：参考《中国药典》2015年版三部<3531>尼妥珠单抗生物学活性测定法，依据抑制一半VEGF所需要的Fc融合蛋白的量。
表2
Figure BDA0002728910110000092
Figure BDA0002728910110000101
上述结果表明：五种pH条件(pH3.2、3.4、3.6、3.8、4.0)下孵育，孵育8h测定样品纯度低于99.7％，孵育2h、4h、6h、8h样品纯度基本无明显变化，纯度均大于99.5％。五种pH条件(pH3.2、3.4、3.6、3.8、4.0)下孵育，纯度均99.5-99.8％之间，随着孵育时间的延长，纯度有下降趋势。生物学活性检测结果随着孵育时间的延长，有降低趋势，但是均在75％～115％范围内。
2.2低pH孵育和深层过滤
使用1mol/L一水柠檬酸调整亲和层析流穿液的pH3.6，孵育2小时进行病毒灭活。灭活结束后，用柠檬酸回调低pH病毒灭活孵育液，调至pH5-7进行深层过滤(PALL，滤器为NP7PDE21)。过滤后用SEC-HPLC(Agilent)测定产品纯度和2-8℃存放7天的纯度，结果如表3所示
表3
Figure BDA0002728910110000102
结果表明：本发明方法所得的纯化的重组人抗体融合蛋白的SEC-HPLC纯度达99.8％或以上。
3.Mix-A层析
为了去除产品中的HCP，我们采用阴离子层析来达成工艺目的。将上一步骤深层过滤后的滤液上样于0.05M柠檬酸，pH 5.5平衡过的Bestarose Diamond MIX-A层析柱(填料来自博格隆上海生物技术有限公司)进行层析，收集流穿液中用ELISA法检测含本实施例重组人抗体融合蛋白的峰。收集后用SEC-HPLC(Agilent)测定产品纯度，酶联免疫法(ELISA)测定HCP、2-8℃存放7天和10天的纯度，结果如表4所示表4
Figure BDA0002728910110000103
Figure BDA0002728910110000111
4.阳离子层析
为了进一步去除产品中的相关杂质，我们采用阳离子层析来达成工艺目的。将上一步骤3获得流穿液上样于Nuvia HR-S层析柱(Bio-Rad公司)，分别用0.01M/L磷酸缓冲液(pH 6.2)及含0.5M/L NaCl的0.01M/L磷酸缓冲液(pH 6.2)进行梯度洗脱，并收集洗脱液。
5.纳滤：
选用Pall公司的SV4滤膜对收集的阳离子洗脱液进行除病毒过滤，纳滤过滤样品即重组人抗体融合蛋白纳滤液，该纯化的融合蛋白经SEC-HPLC(Agilent)检定，峰位与预测理论值一致。
用实施例1的工程细胞株通过上述步骤生产3个批次产品，产品纯度和工艺相关杂质检测结果如表5所示：
表5
Figure BDA0002728910110000112
6.深层过滤：
选用Millipore深层过滤膜(赛多利斯，型号为MX0SP)对纳滤后过滤样品(重组人抗体融合蛋白纳滤液)进行深层过滤。即获得高纯度的本实施例重组人抗体融合蛋白，该纯化的融合蛋白经SEC-HPLC(Agilent)检定(图1)，峰位与预测理论值一致。
用此方法生产3个批次产品，产品纯度和工艺相关杂质检测结果如表6所示：
表6
Figure BDA0002728910110000113
实施例3重组人抗体融合蛋白的在治疗激光诱导脉络膜新生血管模型中的作用
选取体重2.5-3.5kg的食蟹猴，双眼眼底激光诱导脉络膜新生血管模型中，每只眼激光灼烧数量为6-8个。光凝当天记为D1。造模后2周(D15)，通过眼底荧光造影(FFA)检查评估动物的眼底荧光渗漏来确定损伤的评级。
渗漏评级的4个等级：
1级，光斑没有出现高荧光；
2级，光斑高荧光但没有荧光渗漏；
3级，光斑高荧光，轻度荧光渗漏，渗漏不超过光斑边缘；
4级，光斑高荧光，重度荧光渗漏，渗漏超过光斑边缘。
其中，测量4级光斑渗漏面积用来分组。D16挑选有4级渗漏光斑的动物入组，根据4级光斑平均渗漏面积和4级光斑率进行平均分组，保证在分组时各组动物眼底4级光斑平均渗漏面积和4级光斑率无显著差异，具体为6只每组，每组公母各半。在本实验中供试品(即实施例2产品-1)中、高剂量组的给药浓度分别为1、2mg/眼。D16入组后按组进行玻璃体腔注射，单次给药，50μL/眼，双眼给药。
眼底照相(FP)和荧光血管造影(FFA)
所有食蟹猴在造模后给药前(造模后2周，D15)和给药后2周(D30)进行FP和FFA检查。分析指标：对比眼底荧光血管造影早期和晚期的图片，根据动物眼底有无荧光渗漏判断是否有脉络膜新生血管生成及渗漏，并对荧光渗漏程度进行评级，计算4级光斑数及4级光斑率。同时，测量4级光斑渗漏面积(造模后2周判定的4级光斑在后期检查中不再是4级光斑，仍需测量渗漏面积，若无渗漏，则不进行测量)，计算4级光斑平均渗漏面积(4级光斑平均渗漏面积＝测定的荧光渗漏面积/该眼给药前4级光斑数)、平均渗漏面积减少量及平均渗漏改善率：
4级光斑率＝4级光斑数/光凝点数×100％；
平均渗漏面积减少量＝给药前平均渗漏面积－给药后平均渗漏面积；
平均渗漏面积改善率(％)＝平均渗漏面积减少量/给药前平均渗漏面积×100％。
Figure BDA0002728910110000121
注：P≤0.05
由上表可知，供试品(1、2mg/眼)均能减少4级光斑平均渗漏面积。给药后2周(D30)，供试品各剂量组的4级光斑平均渗漏面积显著低于溶媒对照组(p≤0.05)；给药后2周(D30)，供试品各剂量组的4级光斑平均渗漏面积减少量及平均渗漏改善率均显著高于溶媒对照组(p≤0.05)。
光学相干断层扫描(OCT)
所有动物在造模后给药前(造模后2周，D15)、1mg/眼给药后2周(D30)进行OCT检查。结果如图2所示，检查区域需覆盖所有激光光凝斑。由图2可见荧光渗漏4级光斑对应OCT图像中视网膜下高反射信号物质(SHRM)的高度明显，即视网膜神经上皮以外色素上皮层以内的异常高反射信号区域的最高高度。1mg/眼给药后1周(D23)和给药后2周(D30)视网膜神经上皮以外色素上皮层以内的异常高反射信号区域的明显减少(P≤0.05)。
结果表明：造模后给药前(造模后2周，D15)、1mg/眼给药后1周(D23)和给药后2周(D30)进行OCT检查，给药后1周(D23)和给药后2周(D30)视网膜神经上皮以外色素上皮层以内的异常高反射信号区域的显著减少(P≤0.05)。给药后1周(D23)和2周(D30)，供试品各剂量组的SHRM平均高度、平均高度减少量及平均高度改善率与溶媒对照组间存在统计学差异(p≤0.05)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海景泽生物技术有限公司
江苏璟泽生物医药有限公司
<120> 一种重组人抗体融合蛋白的制备方法
<130> P2020-1618
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 432
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1               5                   10                  15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
            20                  25                  30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
        35                  40                  45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
    50                  55                  60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65                  70                  75                  80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
                85                  90                  95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
            100                 105                 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
        115                 120                 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
    130                 135                 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
                165                 170                 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
            180                 185                 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
        195                 200                 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
    210                 215                 220
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
225                 230                 235                 240
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
                245                 250                 255
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
            260                 265                 270
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
        275                 280                 285
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
    290                 295                 300
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
305                 310                 315                 320
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
                325                 330                 335
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
            340                 345                 350
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
        355                 360                 365
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
    370                 375                 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
385                 390                 395                 400
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
                405                 410                 415
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            420                 425                 430

Claims (9)

1.一种重组人抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)提供一表达重组人抗体融合蛋白基因的转染载体；
(b)将所述转染载体转染入哺乳动物细胞并培养，得到包含重组人抗体融合蛋白和杂质的原料液；
(c)对所述原料液进行亲和层析，从而得到亲和层析液；和
(d)对所述亲和层析液进行低pH孵育和深层过滤，从而制得第一纯化液即纯化的重组人抗体融合蛋白；
其中，所述低pH孵育的pH值为3-4，使用柠檬酸或其盐调节pH，所述低pH孵育的时间为2-4小时，所述低pH孵育的温度为25℃；所述柠檬酸浓度为1mol/L；
(e)将所述的第一纯化液上样于阴离子层析柱进行阴离子层析，得到阴离子层析液；
(f)将所述阴离子层析液上样于阳离子层析柱进行阳离子层析，得到阳离子层析液；
(g)将所述的阴离子层析液进行纳滤，得到第二纯化液；和任选地
(h)使用深层过滤器对所述的第二纯化液进行深层过滤，得到第三纯化液即纯化的重组人抗体融合蛋白；
所得的纯化的重组人抗体融合蛋白的SEC-HPLC纯度≥99.8％；
所述的重组人抗体融合蛋白为如SEQ ID No.:1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，柠檬酸盐选自：柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钙、柠檬酸铵。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转染载体是通过重组人抗体融合蛋白基因***哺乳动物表达载体中获得的。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将人抗体融合蛋白基因***pCHO 1.0载体中的Avr II/Pac I酶切位点之间。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(e)中，阴离子层析的平衡液为0.02-0.05M柠檬酸，pH 5.3-5.7。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所得的纯化的重组人抗体融合蛋白的SEC-HPLC纯度≥99.9％。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)深层过滤使用过滤滤器通量为100-150L/m2。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中，所述低pH孵育的pH值为3.4-3.6。
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