CN112225818B - 去除/灭活病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种去除/灭活病毒的方法，所述方法包括如下步骤：s1)提供一原料液，所述原料液包含CHO细胞株发酵产生的Fc融合蛋白；和s2)对所述原料液进行低pH孵育0.5‑8小时，从而制得第一纯化液；其中，所述低pH孵育的pH值为3.0‑4.0，使用柠檬酸或其盐调节pH。本发明方法不仅能够达到去除/灭活Fc融合蛋白中病毒的目的，且保留了目标蛋白——Fc融合蛋白的活性，从而制得高纯度高浓度Fc融合蛋白。

Description

去除/灭活病毒的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白去除/灭活病毒的方法，更具体地涉及Fc融合蛋白生产下游工艺病毒的去除/灭活。
背景技术
哺乳动物细胞表达***的使用使得分泌的蛋白质在免疫原性及抗原性上都与天然蛋白质最为接近，而且蛋白质的加工，如糖基化，也最为准确，以CHO细胞作为表达载体应用广泛。来源于CHO表达系的生物技术产品具有存在病毒污染的危险性，这种污染会在临床中导致非常严重后果，污染可能来源于原细胞系本身，也可能来自生产过程中偶然带入的外源病毒，为了保证生物技术制品的安全，需要在生产过程中对病毒进行去除/灭活以降低单位剂量中的病毒样颗粒含量至一定标准。
已经有相关文献报道，CHO细胞中存在内源性的逆转录病毒，对于人用药的安全性具有一定的风险。按照ICH Q5A生物制品病毒安全性评估规程，要求工艺中应有2步或者2步以上的步骤组合，且至少有一步病毒去除/灭活率大于104，才能被认为是有效的病毒去除/灭活工艺。因此，对于CHO细胞来源的药用蛋白，其生产工艺中必须具有一定的去除或灭活病毒的方法，同时也需要对灭活工艺进行实验室的灭活验证检验。
现阶段融合蛋白下游工艺一般包括发酵液过滤，粗纯和精纯步骤。Fc融合蛋白一般通过Protein A亲和层析，离子层析来达到去除相关杂质和工艺杂质，在工艺过程中采用低pH值孵育进行病毒，但是现有技术中，未见对工艺杂质和低pH值灭活工艺作为主要的整体纯化步骤的技术方案。
现有工艺条件下去除病毒一般为104左右，例如，王淑菁等(重组融合蛋白柱层析病毒去除工艺的验证，中国生物制品学杂质，2014年27卷第二期，241-244)，用染料亲和层析、阴离子交换层析、凝胶层析3种层析方法去除脑心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus，EMCV)和猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)，结果显示，三种层析步骤对脑心肌炎病毒(EMCV)去除降低值分别为1.968、1.984和4.391，三种层析步骤对猪细小病毒(PPV)去除降低值分别为2.135、3.936和2.048。凝胶层析对EMCV的去除效果最好，为4.391log10。
中国专利申请201810010465.3公开了低pH病毒灭活工艺中的纯化方法
：运用1)低pH病毒灭活：使用酸性溶液将ProteinA亲和层析纯化后的洗脱蛋白溶液调节pH至3.6，所述酸性溶液为磷酸；2)中和：用碱性溶液中和低pH处理后的蛋白溶液，调节pH至5.5；3)过滤：静置至少0.5h后用0.2μm滤膜过滤，1M磷酸处理后HCP和ResDNA分别为1199ppm和5.64pg/mg。
中国专利申请201580038801.X公开了一种用于纯化TNFR-Fc融合蛋白的方法：运用亲和负载、亲和洗脱、HIC负载、HIC洗脱、AEX负载、AEX洗脱、MMC负载、MMCFF步骤，最后得到HCP为32ppm。
中国专利申请202010488460.9公开了一种降低Fc融合蛋白酸性电荷异质体含量的方法其HCP残留由上样的43.1ppm降至11.0ppm，达到产品最终质量目标。
因此，本领域需要开发新的分离纯化蛋白的方法，其不仅能够高效地灭活/去除病毒，而且还能够有效去除HCP、HCD等，同时能够保留蛋白活性。
发明内容
本发明目的是提供一种优化的分离纯化蛋白的方法，所述方法采用工艺杂质结合低pH值灭活工艺，不仅能够高效地灭活/去除病毒，而且还能够有效去除HCP、HCD等，同时能够保留蛋白活性。
本发明的第一方面，提供一种去除/灭活Fc融合蛋白病毒的方法，包括如下步骤：
s1)提供一原料液，所述原料液包含CHO细胞株发酵产生的Fc融合蛋白；
s2)对所述原料液进行低pH孵育0.5-8小时，从而制得第一纯化液；
其中，所述低pH孵育的pH值为3.0-4.0，使用柠檬酸或其盐调节pH。
在另一优选例中，所述的第一纯化液包含Fc融合蛋白。
在另一优选例中，柠檬盐选自：柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钙、柠檬酸铵。
在另一优选例中，所述的原料液为经过Protein A亲和层析的层析液。
在另一优选例中，所述低pH孵育使用的pH值为3.1-3.8，较佳地为3.2-3.6，更佳地为3.3±0.1、3.4±0.1、3.5±0.1、3.6±0.1、3.7±0.1、3.8±0.1。
在另一优选例中，所述低pH孵育的时间为1-7小时，较佳地为2-4小时，更佳地为2小时、3小时、4小时。
在另一优选例中，所述低pH孵育的温度为-28℃至28℃，较佳地为-5℃至25℃。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
s3)将所述的第一纯化液上样于深层过滤器进行深层过滤，得到深层过滤液；
s4)将所述的深层过滤液上样于阴离子层析柱进行阴离子层析，得到阴离子层析液；
s5)将所述阴离子层析液上样于阳离子层析柱进行阳离子层析，得到阳离子层析液；和
任选地，s6)将所述的阳离子层析液进行纳滤，得到第二纯化液。
在另一优选例中，所述第二纯化液包含Fc融合蛋白。
在另一优选例中，步骤s4)中，阴离子层析的清洗液为10-60mmol/L柠檬酸，pH5.0-6.0；较佳地为25mmol/L柠檬酸。
在另一优选例中，步骤s5)中，阳离子层析的洗脱液为5-30mmol/L磷酸，0.1-5mol/LNaCl，pH 6.0-7.0；较佳地为10mmol/L磷酸，0.5mol/LNaCl，pH6.2±0.2。
在另一优选例中，在步骤s3)中，深层过滤使用过滤滤器通量为10-250L/m2。
在另一优选例中，在步骤s3)中，深层过滤使用过滤滤器通量为40-180L/m2，较佳地为60-150L/m2，更佳地为100-150L/m2。
在另一优选例中，在步骤s3)中，所述的深层过滤使用滤器孔径为0.1-5μm，较佳地为0.15-4μm，更佳地为0.15-3.5μm。
在另一优选例中，在步骤s4)中，使用层析柱Bestarose Diamond MIX-A进行阴离子层析。
在另一优选例中，在步骤s4)中，所述的阴离子层析用有机酸平衡过的层析柱，较佳地为柠檬酸、Tris，更佳地为柠檬酸，浓度为5-50mmol/L，较佳地为25mmol/L。
在另一优选例中，在步骤s5)中，使用层析柱用介质粒径小于60μm的层析柱进行阳离子层析。
在另一优选例中，所述的阳离子层析用有机酸平衡过的层析柱，较佳地为柠檬酸、Tris，更佳地为柠檬酸。
在另一优选例中，所述的阳离子层析柱为Nuvia HR-S。
在另一优选例中，在步骤s6)中，纳滤的滤膜孔径小于20nm。
在另一优选例中，所述柠檬酸浓度为0.5-3mol/L。
在另一优选例中，所述柠檬酸浓度1-2mol/L，较佳地为1mol/L。
在另一优选例中，所述的第一纯化液Fc融合蛋白SEC-HPLC检测纯度大于99.5％。
在另一优选例中，第一纯化液Fc融合蛋白SEC-HPLC检测纯度大于99.7％。
在另一优选例中，所述的第二纯化液Fc融合蛋白SEC-HPLC检测纯度大于99.7％。
在另一优选例中，第一纯化液Fc融合蛋白SEC-HPLC检测纯度大于99.8％。
在另一优选例中，所述的Fc融合蛋白为重组人血管内皮生长因子Fc融合蛋白。
在另一优选例中，所述的Fc融合蛋白为重组人血管内皮生长因子受体1和/或受体2Fc融合蛋白。
在另一优选例中，所述的Fc融合蛋白为重组人血管内皮生长因子受体1和/或受体2同Ig G1的Fc片段基因相连的Fc融合蛋白，优选地为VEGFR1和VEGFR2基因同免疫球蛋白IgG1的Fc片段基因相连，并在真核表达***中表达的重组蛋白，优选地，VEGFR1和VEGFR2不同受体的共2-3个胞外区融合连上免疫球蛋白Ig G1的Fc片段。
在另一优选例中，Fc融合蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID No.:1所示的氨基酸序列。更优选的，本发明所述的Fc融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID No.:1所示的序列。
在另一优选例中，所述去除/灭活的病毒选自：小鼠微小病毒(MVM)、呼肠孤病毒III型(Reo3)、伪狂犬病毒(PRV)、鼠白血病病毒(X-MuLV)、或其组合。
在另一优选例中，所述的第一或第二纯化液Fc融合蛋白病毒去除/灭活率大于4log，优选地大于5log，更优选地大于5.5log。
在另一优选例中，所述的第一或第二纯化液病毒去除/灭活率大于4log。
在另一优选例中，所述的第一或第二纯化Fc液伪狂犬病毒(PRV)去除/灭活率大于4log，优选地大于5log。
在另一优选例中，所述的第一或第二纯化液鼠白血病病毒(X-MuLV)去除/灭活率大于4log，优选地大于5log。
在另一优选例中，所述的第一或第二纯化液伪狂犬病毒(PRV)和鼠白血病病毒(X-MuLV)去除/灭活率均大于4log，优选地大于5log。
在另一优选例中，所述的第一或第二纯化液小鼠微小病毒(MVM)去除/灭活率大于4log，优选地大于5log。
在另一优选例中，所述的第一或第二纯化液呼肠孤病毒III型(Reo3)去除/灭活率大于4log，优选地大于5log。
在另一优选例中，所述的第二纯化液Fc融合蛋白HCP去除率为99％以上。
在另一优选例中，所述的第二纯化液Fc融合蛋白HCD去除率为99％以上。
本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物包括i)使用第一方面所述的方法制得的Fc融合蛋白，和ii)药学上可接受的载体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
(无)
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地开发了一种利用低pH孵育的方法来分离纯化蛋白，其不仅能够达到去除/灭活Fc融合蛋白中病毒的目的，且保留了目标蛋白——Fc融合蛋白的活性，从而制得高纯度高浓度蛋白。在此基础上，完成了本发明。
术语
Fc融合蛋白：即Ig G1的Fc片段融合蛋白，是指在基因水平上将VEGFR1和VEGFR2基因同免疫球蛋白Ig G1的Fc片段基因相连，并在真核表达***中表达的重组蛋白。VEGFR1和VEGFR2基因同免疫球蛋白Ig G1的Fc片段基因相连，并在真核表达***中表达的重组蛋白。VEGFR1和VEGFR2不同受体的共2-3个胞外区融合连上免疫球蛋白Ig G1的Fc片段。
优选地，本发明所述的Fc融合蛋白氨基酸序列包含SEQ ID No.:1所示的序列，更优选的，本发明所述的Fc融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID No.:1所示的序列：
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No.:1)。
优选地，本发明的Fc融合蛋白由CHO-DG44细胞株表达，并且Fc融合蛋白可选自发酵上清液，或者经过任何初纯步骤获得。优选地，Fc融合蛋白浓度为0.1-8g/L(质量浓度)。
HCP：即宿主蛋白，宿主蛋白残留。优选地，指来自于CHO-DG44细胞株的宿主蛋白。
HCD：即宿主细胞DNA。优选地，指来自于CHO-DG44细胞株的宿主DNA。
SEC-HPLC:体积排阻色谱(SEC)是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法。SEC-HPLC测定纯度，参照《中国药典》2015年版四部<0514>分子排阻色谱法，高效液相色谱仪(Agilent，1260)推荐方法。
荧光定量PCR法：参照《中国药典》2015年版四部<3407>外源性DNA残留量测定法，荧光定量PCR仪为ABI公司(StepOne Plus)。本发明中，使用湖州申科生物技术有限公司CHO细胞残留DNA检测试剂盒测定HCD。
酶联免疫法(ELISA)：参照酶标仪(Molecula Devices，型号SpectraMax i3x)推荐的方法测定HCP。本发明中，使用试剂盒为Cygnus公司CHO Host Cell Proteins ELISAKit。
去除/灭活病毒降低量是指根据2002年国家药品监督管理局《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的病毒灭活评价规定，采用病毒降低量作为对病毒灭活/去除效果的评价。若病毒降低量为4logs，表示该步骤灭活/去除病毒降低量为4。
深层过滤：当颗粒尺寸小于介质孔道直径时，不能在过滤介质表面形成滤饼,这些颗粒便进入介质内部，借惯性和扩散作用趋近孔道壁面，并在静电和表面力的作用下沉积下来，从而与流体分离。本发明中优选使用Millipore深层过滤膜(赛多利斯，型号为MX0SP)对样品(重组人抗体融合蛋白纳滤液)进行深层过滤。
病毒灭活测定方法：参考《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》(国药监注[2002]160号)。
阴离子交换柱
适用于本发明的阴离子交换柱包括Bestarose Diamond MIX-A。
在本发明中，层析介质的用量没有特别限制，通常可根据待纯化的原料中所含的Fc融合蛋白数量而定。
阳离子交换柱
如本文所用，术语“本发明的阳离子交换柱”指可特异性地将Fc融合蛋白和其他杂质有效分离的阳离子交换树脂。
适用于本发明的阳离子交换树脂没有特别限制，本发明中，阳离子层析使用介质粒径小于60um的层析柱，较佳地为Nuvia HR-S。
去除和/或灭活Fc融合蛋白(发酵液)中的病毒方法
本发明提供了去除和/或灭活Fc融合蛋白中的病毒方法，其包括由低pH孵育、深层过滤、阴离子层析、阳离子层析中包括pH孵育在内的任何两步、三步或者全部步骤的任意组合。
具体地，包括如下步骤：
s1)提供一原料液，所述原料液包含CHO细胞株发酵产生的Fc融合蛋白；
s2)对所述原料液进行低pH孵育0.5-8小时，从而制得第一纯化液；
其中，所述低pH孵育的pH值为3.0-4.0，使用柠檬酸或其盐调节pH，优选地pH值为3.1-3.8，较佳地为3.2-3.6，更佳地为3.3±0.1、3.4±0.1、3.5±0.1、3.6±0.1、3.7±0.1、3.8±0.1。
优选地，所述低pH孵育的时间为1-7小时，较佳地为2-4小时，更佳地为2小时、3小时、4小时。
优选地，所述低pH孵育在-28℃至28℃下进行，较佳地为-5℃至25℃。
优选地，所述方法还包括步骤：
s3)将所述的第一纯化液上样于深层过滤器进行深层过滤，得到深层过滤液；
s4)将所述的深层过滤液上样于阴离子层析柱进行阴离子层析，得到阴离子层析液；
s5)将所述阴离子层析液上样于阳离子层析柱进行阳离子层析，得到阳离子层析液；和
任选地，s6)将所述的阳离子层析液进行纳滤，得到第二纯化液。
优选地，步骤s4)中，阴离子层析的清洗液为10-60mmol/L柠檬酸，pH 5.00-6.0；较佳地为25mmol/L柠檬酸。
优选地，步骤s5)中，阳离子层析的洗脱液为10mmol/L磷酸，0.5mol/LN aCl，pH6.2±0.2。
优选地，在步骤s3)中，深层过滤使用过滤滤器通量为10-250L/m2，优选地为40-180L/m2，较佳地为60-150L/m2，更佳地为100-150L/m2，其中，所述的深层过滤使用滤器孔径为0.1-5μm，较佳地为0.15-4μm，更佳地为0.15-3.5μm。
优选地，在步骤s4)中，使用层析柱Bestarose Diamond MIX-A进行阴离子层析，所述的阴离子层析用有机酸平衡过的层析柱，较佳地为柠檬酸、Tris，更佳地为柠檬酸，浓度为25mmol/L。
优选地，在步骤s5)中，使用层析柱用介质粒径小于60μm的层析柱进行阳离子层析，较佳地为Nuvia HR-S；并且，所述的阳离子层析用有机酸平衡过的层析柱，较佳地为柠檬酸、Tris，更佳地为柠檬酸。
优选地，在步骤s6)中，纳滤的滤膜孔径小于20nm。
优选地，所述柠檬酸浓度为0.5-3mol/L；较佳地为1-2mol/L，更佳地为1mol/L-1.5mol/L。
优选地，所述的第一纯化液Fc融合蛋白SEC-HPLC检测纯度大于99.5％，优选地大于99.7％。
优选地，所述的第二纯化液Fc融合蛋白SEC-HPLC检测纯度大于99.7％，优选地大于99.8％。
优选地，所述的Fc融合蛋白为重组人血管内皮生长因子Fc融合蛋白，更佳地所述的Fc融合蛋白为重组人血管内皮生长因子受体1和/或受体2Fc融合蛋白，更佳地所述的Fc融合蛋白为重组人血管内皮生长因子受体1和/或受体2同Ig G1的Fc片段基因相连的Fc融合蛋白，优选地为VEGFR1和VEGFR2基因同免疫球蛋白Ig G1的Fc片段基因相连，并在真核表达***中表达的重组蛋白。VEGFR1和VEGFR2不同受体的共2-3个胞外区融合连上免疫球蛋白Ig G1的Fc片段。
优选地，Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示。
优选地，所述去除/灭活的病毒选自：小鼠微小病毒(MVM)、呼肠孤病毒III型(Reo3)、伪狂犬病毒(PRV)、鼠白血病病毒(X-MuLV)、或其组合。
优选地，所述的第一或第二纯化液Fc融合蛋白病毒去除/灭活率大于4log，优选地大于5log。
优选地，所述的第一或第二纯化液Fc融合蛋白伪狂犬病毒(PRV)去除/灭活率大于4log，优选地大于5log。
优选地，所述的第一或第二纯化液Fc融合蛋白鼠白血病病毒(X-MuLV)去除/灭活率大于4log，优选地大于5log。
优选地，所述的第一或第二纯化液Fc融合蛋白伪狂犬病毒(PRV)和鼠白血病病毒(X-MuLV)去除/灭活率均大于4log，优选地大于5log。
优选地，所述的第一或第二纯化液Fc融合蛋白小鼠微小病毒(MVM)去除/灭活率大于4log，优选地大于5log。
优选地，所述的第一或第二纯化液Fc融合蛋白呼肠孤病毒III型(Reo3)去除/灭活率大于4log，优选地大于5log。
优选地，第一或第二纯化液Fc融合蛋白HCP去除率为99％以上。
优选地，第一或第二纯化液Fc融合蛋白HCD去除率为99％以上。
药物组合物
优选地，所述的药物组合物包括i)使用如上所述的方法制得的Fc融合蛋白，和ii)药学上可接受的载体。
优选地，所述Fc融合蛋白SEC-HPLC检测纯度大于99.5％，优选地大于99.7％，更优选地为99.8％。
优选地，所述的Fc融合蛋白为重组人血管内皮生长因子Fc融合蛋白，更佳地所述的Fc融合蛋白为重组人血管内皮生长因子受体1和/或受体2Fc融合蛋白，更佳地VEGFR1和VEGFR2基因同免疫球蛋白Ig G1的Fc片段基因相连，并在真核表达***中表达的重组蛋白。更优选地为VEGFR1和VEGFR2不同受体的共2-3个胞外区融合连上免疫球蛋白Ig G1的Fc片段。优选地，Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明纯化方法去除/灭活病毒效果好，可制得高纯度的Fc融合蛋白，其纯度高达99.8％以上。
(2)纯化产品中，小鼠微小病毒(MVM)、呼肠孤病毒III型(Reo3)和宿主HCP、HCD均得到有效的去除/灭活，可满足药物要求。
(3)本发明方法工艺过程操作简便，不需特殊试剂，且不含有凝胶层析、透析等不易放大的工艺步骤或操作，利于大规模生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例
实验材料
Fc融合蛋白样品来自上海景泽生物技术有限公司，其是由CHO-DG44细胞株表达的，其中所得的Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示。
测定HCP：Cygnus公司CHO Host Cell Proteins ELISA Kit。
测定HCD：湖州申科生物技术有限公司CHO细胞残留DNA检测试剂盒。
1、低pH孵育
缓冲液的选择：样品直接用1mol/L Tris调到pH 5.5，放在2～8℃待检；取同一批次样品用酸性滴定液(浓度为1mol/L)调Fc融合蛋白pH到3.0，室温(18～26℃)下保持3小时，然后用碱性滴定液回调pH到5.5。测定单体纯度，结果如表1
表1不同酸或者酸的缓冲液对Fc融合蛋白单体纯度的影响
Figure GDA0004052056590000101
结果表明：使用相同浓度的1mol/L的盐酸、磷酸及其缓冲液滴定液，得到相同pH(3.0)的条件下，获得的Fc融合蛋白单体纯度低于柠檬酸和柠檬酸盐缓冲液。
柠檬酸及柠檬酸盐缓冲液调Fc融合蛋白pH到3.0，室温(18～26℃)下保持3小时纯度均大于99.1％，融合蛋白稳定，生物学活性检测结果均在80％～120％范围内。因此初步认为产品在pH3.3-3.7条件下孵育3小时稳定，酸性滴定液为1mol/L柠檬酸及柠檬酸盐(pH3.0)。
孵育时间和pH选择：对照样品直接用柠檬酸及柠檬酸盐缓冲液调节pH至5.5，放在2～8℃待检。用柠檬酸或柠檬酸盐缓冲液调节pH至3.2、3.4、3.6、3.8、4.0，室温(18～26℃)孵育2h、4h、6h、8h后回调pH5.5。低pH孵育对产品的影响见下表2
生物学活性：参考《中国药典》2015年版三部<3531>尼妥珠单抗生物学活性测定法，依据抑制一半VEGF所需要的Fc融合蛋白的量。
表2
Figure GDA0004052056590000102
/>
Figure GDA0004052056590000111
上述结果表明：五种pH条件(pH3.2、3.4、3.6、3.8、4.0)下孵育，孵育8h测定样品纯度低于99.7％，孵育1h、2h、4h、6h样品纯度基本无明显变化，纯度均大于99.5％。五种pH条件(pH3.2、3.4、3.6、3.8、4.0)下孵育，纯度均99.5-99.8％之间，随着孵育时间的延长，纯度有下降趋势。生物学活性检测结果随着孵育时间的延长，有降低趋势，但是均在75％～115％范围内。
生物学活性(Cell based bioassay)和纯度(SEC-HPLC(％))
25℃，取4g/L经过Protein A亲和层析纯化的Fc融合蛋白溶液5L，1mol/L柠檬酸，调pH3.4，孵育2h，测定生物学活性(Cell based bioassay)和纯度(SEC-HPLC(％))
孵育结果如表3所示：
表3
Figure GDA0004052056590000121
孵育后用柠檬酸回调pH5.5，测定样品稳定性，结果如表4所示：
表4
温度 时间 纯度SEC-HPLC(％)
室温 0 99.8
室温 28D 99.7
2～8℃ 56D 99.8
结果表明：pH值3.6孵育病毒灭活2h，pH回调5.5后，样品在室温(18～26℃)保存14天是稳定的，单体纯度(SEC-HPLC)99.8％；在2～8℃保存28天单体纯度(SEC-HPLC)与保存第一天测定结果一致，为99.8％。这说明此步骤对产品的纯度和活性没有显著影响，保证了产品的安全性和有效性。
参照《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》(国药监注[2002]160号)，验证病毒去除/灭活效果，样品的小鼠白血病病毒(X-Mulv)和伪狂犬病病毒(PRV)的去除/灭活效果(残余指示病毒滴度(LgTCID50/0.1ml))结果如表5所示
表5-1
病毒 病毒降低量
X-Mulv ≥4.78
PRV ≥4.83
结果表明本发明的低pH孵育方法，可以有效去除小鼠白血病病毒(X-Mulv)和伪狂犬病病毒(PRV)。
2、深层过滤
低pH孵育液，通过用25mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡好的深层滤器NP7PDE21(PALL)(0.2-3.5um)，通量为120L/m2，测定HCP(ELISA)为192ppm、HCD(荧光定量PCR法)为8pg/mg。
表5-2
Figure GDA0004052056590000122
Figure GDA0004052056590000131
HCP、HCD去除率分别达到54％和91％。
3、阴离子层析
将上一步骤深层过滤后的滤液上样于“25mmol柠檬酸缓冲液，pH 5.3-5.7”平衡过的Bestarose Diamond MIX-A层析柱(填料来自博格隆上海生物技术有限公司)进行层析。收集流穿液中用ELISA法检测含本实施例重组人抗体融合蛋白的峰。
参照《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》(国药监注[2002]160号)，验证病毒去除/灭活效果，样品的小鼠微小病毒(MVM)和呼肠孤病毒III型(Reo3)的去除/灭活效果(残余指示病毒滴度(LgTCID50/0.1ml))。
病毒降低量的计算采用96孔细胞病变法，计算按Karber法。每批样品重复测定二次。Karber法公式为：LgTCID50＝L-d(S-0.5)，其中，L＝最高稀释度的对数；d＝稀释对数之间的差；s＝阳性孔比率总和。病毒降低量为零点对照样本与灭活工艺后样本病毒滴度(LgTCID50/0.1mL)检测值之差。
结果见下表6
表6
Figure GDA0004052056590000132
实验结果表明使用本发明方法，小鼠白血病病毒(X-Mulv)病毒降低量为4.48log，小鼠微小病毒(MVM)病毒降低量达4.45log，本发明方法对HCP(ELISA)、HCD(荧光定量PCR法)的去除效果很好，经过测定，结果分别为90ng/mg和0.1pg/mg。
4、阳离子层析
将上一步骤获得流穿液上样于Nuvia HR-S层析柱(Bio-Rad公司)，分别用0.01M/L磷酸缓冲液(pH 6.0-6.4)及含0.5M/L NaCl的0.01M/L磷酸缓冲液的(pH 6.0-6.4)进行梯度洗脱，并收集洗脱液。
5、纳滤
选用Pall公司的SV4滤膜对收集的阳离子洗脱液进行除病毒过滤，纳滤过滤样品即重组人抗体融合蛋白纳滤液，该纯化的融合蛋白经SEC-HPLC(Agilent)检定，峰位与预测理论值一致。
用SEC-HPLC(Agilent)测定产品纯度，酶联免疫法(ELISA)测定HCP，用SEC-HPLC(Agilent)测定2-8℃存放7天和28天的纯度。
参照《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》(国药监注[2002]160号)，验证病毒去除/灭活效果，样品的小鼠微小病毒(MVM)和呼肠孤病毒III型(Reo3)的去除/灭活效果(残余指示病毒滴度(LgTCID50/0.1ml))。
病毒降低量的计算采用96孔细胞病变法，计算按Karber法。每批样品重复测定二次。Karber法公式为：LgTCID50＝L-d(S-0.5)，其中，L＝最高稀释度的对数；d＝稀释对数之间的差；s＝阳性孔比率总和。病毒降低量为零点对照样本与灭活工艺后样本病毒滴度(LgTCID50/0.1mL)检测值之差。
结果见下表7
表7
Figure GDA0004052056590000141
实验结果表明使用本发明方法，小鼠微小病毒(MVM)病毒降低量达5.01log，呼肠孤病毒III型(Reo3)达5.12log。此外，本发明方法对HCP(ELISA)、HCD(荧光定量PCR法)的去除效果很好，经过测定，结果分别为2ng/mg和0.07pg/mg。低pH孵育前相比HCP(ELISA)、HCD(荧光定量PCR法)去除率分别达99.52％和99.92％。更进一步地，在2-8℃存放7D和28D，所得到的Fc融合蛋白纯度不变。
综上，相比于现有技术，本发明方法具有优异的去除/灭活病毒的效果，同时，本发明还兼具去除HCP和HCD，且效果优异。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 江苏璟泽生物医药有限公司
上海景泽生物技术有限公司
<120> 去除/灭活病毒的方法
<130> P2020-1617
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 432
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
195 200 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
210 215 220
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
225 230 235 240
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
245 250 255
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
260 265 270
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
275 280 285
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
290 295 300
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
305 310 315 320
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
340 345 350
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
355 360 365
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
370 375 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
385 390 395 400
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
405 410 415
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
420 425 430

Claims (11)

1.一种去除/灭活病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
s1)提供一原料液，所述原料液包含CHO细胞株发酵产生的Fc融合蛋白；和
s2)对所述原料液进行低pH孵育2-6小时，从而制得第一纯化液；
其中，所述低pH孵育的pH值为3.4±0.1或3.5±0.1，使用柠檬酸或其盐调节pH，其中，所述柠檬酸浓度为1mol/L-1.5mol/L；
其中，所述方法还包括步骤：
s3)将所述的第一纯化液上样于深层过滤器进行深层过滤，得到深层过滤液；
s4)将所述的深层过滤液上样于阴离子层析柱进行阴离子层析，得到阴离子层析液，其中，阴离子层析柱为Bestarose Diamond MIX-A；
s5)将所述阴离子层析液上样于阳离子层析柱进行阳离子层析，得到阳离子层析液，其中，所述阳离子层析柱为Nuvia HR-S；和
任选地，s6)将所述的阳离子层析液进行纳滤，得到第二纯化液；
所述去除/灭活的病毒选自：小鼠微小病毒(MVM)、呼肠孤病毒III型(Reo3)、伪狂犬病毒(PRV)、鼠白血病病毒(X-MuLV)、或其组合；
所述的Fc融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID No.:1所示的序列；
所述的第一或第二纯化液Fc融合蛋白SEC-HPLC检测纯度大于99.5％；
所述的第二纯化液Fc融合蛋白HCP去除率为99％以上；
所述的第二纯化液Fc融合蛋白HCD去除率为99％以上。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低pH孵育的温度为-5℃至25℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s3)中，深层过滤使用过滤滤器通量为10-250L/m2。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s5)中，使用层析柱用介质粒径小于60μm的层析柱进行阳离子层析。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一纯化液Fc融合蛋白SEC-HPLC检测纯度大于99.7％。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二纯化液Fc融合蛋白SEC-HPLC检测纯度大于99.7％。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第二纯化液小鼠微小病毒(MVM)去除/灭活率大于5log，呼肠孤病毒III型(Reo3)去除/灭活率大于5log。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低pH孵育的时间为2-4小时。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一或第二纯化液病毒去除/灭活率大于4log。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，柠檬酸盐选自：柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钙、柠檬酸铵。
11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述低pH孵育的pH值为3.4±0.1。
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